MỞ ĐẦU Từ lâu thực vật luôn là nguồn cung cấp một số lƣợng khổng lồ các hợp chất hóa học có hoạt tính và đƣợc dùng làm thuốc. Các hợp chất hoạt tính sinh học đƣợc chiết xuất từ thực vật có thể đƣợc sử dụng nhƣ thuốc điều trị bệnh, thực phẩm chức năng, thuốc bảo vệ thực vật, phụ gia thực phẩm, thuốc nhuộm, chất tạo hƣơng vị và mỹ phẩm. Hiện có khoảng 25–28% thuốc chữa bệnh có nguồn gốc từ thực vật, hơn 60% thuốc điều trị ung thƣ trực tiếp hoặc gián tiếp từ thực vật và có nhiều loại không có sản phẩm tổng hợp hoặc bán tổng hợp thay thế. Vì thế nguồn sinh khối thực vật đang ngày một tăng cao và những nghiên cứu nhằm tăng cƣờng sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp có hoạt tính dƣợc học là đòi hỏi cấp bách.
Trong vài thập kỷ qua, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã có những bƣớc phát triển vƣợt bậc, là một phƣơng pháp thay thế thích hợp trong việc tạo các nguồn sinh khối ở quy mô khác nhau không phụ thuộc vào mùa vụ. Ngoài ra, việc nuôi cấy mô tế bào còn có thể tiến hành ở bất cứ nơi nào trong điều kiện vô trùng và không phải sử dụng các chất bảo vệ thực vật độc hại. Một trong những tiến bộ đáng kể trong kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật chính là tạo tế bào dạng huyền phù (tế bào không bị biệt hóa) của thực vật để nghiên cứu các hoạt tính sinh học và sản xuất các chất trao đổi thứ cấp có giá trị. Nuôi cấy tế bào huyền phù còn là một trong những giải pháp để cải thiện khó khăn khi nồng độ các chất trao đổi thứ cấp trong cây thấp và đã đƣợc phát triển thành công nhƣ chất artemisinin (phân lập từ cây thanh hao hoa vàng, có tác dụng chữa sốt rét) và chất paclitaxel (hay taxol, phân lập từ cây thông đỏ, có tác dụng chữa ung thƣ).
Cây dừa cạn (Catharanthus roseus L. Don) là cây dƣợc liệu, chứa nhiều chất thứ cấp khác nhau trong đó có nhóm chất terpenoid alkaloid có nhân indole (TIA) nhƣ vinblastine và vincristine để điều trị một số bệnh ung thƣ nguy hiểm nhƣ bệnh bạch cầu, ung thƣ hạch bạch huyết 8 (lymphosarcoma), ung thƣ biểu mô rau (choriokarsinoma), u nguyên bào thần kinh, ung thƣ vú, ung thƣ phổi, bệnh Hodgkin, các khối u dạng Wilkin và ung thƣ tế bào lƣới. Trên thực tế nhu cầu về các alkaloid ngày một tăng, nhƣng quá trình sản xuất những hợp chất này vẫn gặp nhiều khó khăn do hai hợp chất này chỉ có mặt trong cây dừa cạn với hàm lƣợng rất thấp, khoảng 0,0002- 0,0005% tổng hàm lƣợng alkaloid trong cây và phụ thuộc vào giống và các cơ quan khác nhau của cây. Vì thế, sử dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào in vitro để phát triển sinh khối và sau đó là điều khiển sinh tổng hợp các chất thứ cấp có giá trị đã đƣợc nghiên cứu rộng rãi, đặc biệt ở cây dừa cạn, tuy nhiên kết quả vẫn còn hạn chế và phụ thuộc nhiều vào hệ thống nuôi cấy bao gồm vật liệu, điều kiện nuôi cấy… Trong khuôn khổ luận văn này, nghiên cứu sẽ tập trung “ Nghiên cứu thiết lập hệ thống nuôi cấy tế bào huyền phù cây dừa cạn (Catharanthus roseus L.) của Việt Nam” nhằm chọn tạo đƣợc các dòng tế bào có khả năng phát triển sinh khối với tốc độ nhanh và giữ đƣơc khả năng tổng hợp các chất thứ cấp.
Kết quả của luận văn sẽ là cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo nhằm cải thiện khả năng tổng hợp các chất thứ cấp của tế bào dừa cạn ở điều kiện in vitro. Để đạt đƣợc mục tiêu, các công việc cụ thể sẽ đƣợc tiến hành nhƣ sau: 1. Nghiên cứu ảnh hƣởng của vật liệu, môi trƣờng, chất kích thích sinh trƣởng khác nhau đến khả năng hình thành mô sẹo của 02 giống dừa cạn của Việt Nam. Nghiên cứu điều kiện thích hợp cho nuôi cấy huyền phù tế bào từ mô sẹo dừa cạn đã đƣợc chọn lọc.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Giới thiệu chung về dừa cạn 1. Đặc điểm sinh học và phân bố Dừa cạn có tên khoa học là Catharanthus roseus (L) G. Don, tên thƣờng gọi là dừa cạn hoặc bông dừa hay trƣờng xuân hoa là một loài thực vật thân thảo thuộc chi Catharanthus, họ Trúc đào (Apocynaceae).
Chi Catharanthus gồm 8 loài, trong đó 7 loài có nguồn gốc từ bán đảo Madagascar (C. trichophyllus) và 1 loài C. pusillus từ Ấn Độ. Loài Catharanthus roseus (L) G.
Loài cây này chủ yếu đƣợc trồng ở các nƣớc nhiệt đới, ở những vùng lạnh cây đƣợc trồng vào mùa hè vì không chịu đƣợc lạnh.1: Cây dừa cạn (Nguồn: http://www.vn/caythuoc/index.php?q=node/195) Dừa cạn là dạng cây thƣờng xanh hoặc cây thân thảo, cao tới 80 cm đến 1 m và hoa nở liên tục quanh năm với hoa màu hồng, tím hoặc trắng [2]. Lá cây có hình từ bầu dục đến thuôn, dài từ 2,5- 9,0 cm và rộng từ 1- 3,5 cm, không có lông, màu xanh bóng với một gân ở giữa màu nhạt và cuống lá ngắn khoảng 1-1,8 cm và đƣợc sắp xếp theo cặp đối diện. roseus phổ biến nhất đƣợc đặt tên dựa trên màu hoa, bao gồm một giống hoa màu hồng Rosel và một giống hoa màu trắng Alba. Hoa có nhiều màu từ màu trắng đến hồng đậm với hoa gồm 5 cánh mỏng, tiểu nhụy gắn với phần trên 10 của ống vành, tâm bì rời ở noãn sào với năm cánh giống thùy hoa.
Quả là một cặp nang dài khoảng 2-4 cm và rộng 3 mm. roseus là một loài khác biệt với hầu hết các loài khác trong họ ở khả năng tự tƣơng thích. Tuy nhiên, quá trình tự thụ phấn trong hoa thƣờng không xảy ra ở cây dừa cạn vì sự tách biệt vật lý giữa nhụy và bao phấn, một hiện tƣợng đƣợc gọi là herkogamy ngƣợc, khi nhụy bị thấp xuống dƣới mức bao phấn [3]. Ở Việt Nam, dừa cạn là cây hoang dại, có vùng phân bố tự nhiên tƣơng đối đặc trƣng từ tỉnh Quảng Ninh đến Kiên Giang dọc theo vùng ven biển, tập trung ở các tỉnh miền Trung nhƣ Thanh Hóa, Nghệ An, Thừa Thiên - Huế, Quảng Nam, Đà Nẵng, Bình Định và Phú Yên.
Ngoài ra dừa cạn còn xuất hiện ở các đảo nhƣ Cô Tô, Côn Đảo và Phú Quốc [1]. Ở những vùng phân bố tự nhiên ven biển, dừa cạn có khi mọc gần nhƣ thuần loại trên các bãi cát dƣới rừng phi lao, trảng cỏ cây bụi thấp, có khả năng chịu đựng điều kiện đất đai khô cằn của vùng cát ven biển. Giá trị y học Catharanthus roseus đƣợc coi là một nhà máy sản xuất đến 130 terpenoid indole alkaloids (TIAs) khác nhau, trong đó có nhiều chất có hoạt tính dƣợc học quan trọng đƣợc dùng trong điều trị ung thƣ, tiểu đƣờng, cao huyết áp, dị ứng, táo bón và nhiều bệnh đƣờng ruột. Trong đó, vinblastine là hợp chất đã đƣợc FDA (Food and Drug Administration) của Mỹ phê duyệt vào năm 1965 và trở thành một thành phần chính của phƣơng pháp hóa trị liệu trong điều trị nhiều loại ung thƣ nhƣ bạch cầu, bàng quang, tinh hoàn, các u bạch huyết, ung thƣ vú, ung thƣ phổi tế bào nhỏ…, đƣợc bán trên thị trƣờng hơn 40 năm nay.
Ngoài ra, vincristine và vinblastine còn thể hiện hoạt tính kháng khuẩn [4]. Một hợp chất khác của nhóm TIA là ajmalicin đƣợc sử dụng làm chất chống cao huyết áp, hợp chất vindoline đƣợc nghiên cứu ứng dụng trong điều trị bệnh tiểu đƣờng [5]. Khi nghiên cứu để phát hiện các chất có hoạt tính hạ đƣờng huyết từ cây dừa cạn của Việt Nam, Nguyen và cs [6] đã 11 phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 9 hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme glucosidase từ cây và rễ dừa cạn thu hái tại Hoài Nhơn, Bình Định, trong đó có 2 chất lần đầu tiên đƣợc phân lập từ loài này. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên 9 dòng tế bào ung thƣ ở ngƣời, gồm ung thƣ gan (Hep- G2), ung thƣ biểu mô (KB), ung thƣ phổi (LU-1), ung thƣ vú (MCF-7), melanoma cancer ung thƣ sắc tố (SK-Mel2), ung thƣ bạch cầu cấp tính (HL60), ung thƣ buồng trứng (SW626), ung thƣ tuyến tiền liệt (LNCaP) và ung thƣ ruột kết (HT-29) đã có những kết quả nhất định.
Mặc dù có vai trò quan trong nhƣng cấu trúc phức tạp của vinblastine và vincristine làm cho việc tổng hợp hóa học các chất này rất khó khăn. Dừa cạn cũng đƣợc dùng phổ biến trong các bài thuốc Đông y để trị cao huyết áp, trị bệnh tiểu đƣờng, tiêu hóa kém, lỵ thông tiểu tiện, bệnh đi tiểu đỏ và ít. Một số trƣờng hợp còn dùng để trị ung thƣ máu, ung thƣ phổi [7]. Trƣớc đây, nguồn dừa cạn mọc tự nhiên ở Việt Nam tƣơng đối dồi dào.
Trƣớc năm 1975, miền Bắc đã từng xuất khẩu sang Đông Âu 1-3 tấn/năm. Những năm gần đây, lƣợng xuất khẩu sang Pháp (khoảng trên 10 tấn/năm) thƣờng xuyên hơn, nhƣng chủ yếu là từ cây trồng tại Phú Yên. Nuôi cấy mô tế bào cây thuốc in vitro Nuôi cấy mô tế bào thực vật đƣợc bắt đầu từ đầu thế kỷ 20. Trong những năm 1940 và 1960, những tiến bộ công nghệ đã dẫn đến sự phát triển của kỹ thuật nuôi cấy mô tế thực vật nhằm nghiên cứu hoạt động của tế bào (bao gồm tế bào học, dinh dƣỡng, chuyển hóa, quá trình phát sinh hình thái, hình thành phôi và bệnh học), tạo ra cây sạch bệnh và điều kiện lƣu trữ tế bào và nhân giống vô tính.
Từ những năm 1960, quá trình sinh tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp đã đƣợc nghiên cứu rộng rãi trong nhiều loại tế bào thực vật và nhiều ứng dụng mới đã đƣợc phát triển, cải thiện đáng kể cho quá trình nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Hiện nay, việc nuôi cấy tế bào thực vật trở thành công cụ hiệu quả để sản xuất quy mô lớn các chất chuyển hóa thứ 12 cấp dùng trong chăm sóc sức khỏe cho con ngƣời (ví dụ, thuốc chống ung thƣ) [8]. Những ƣu điểm chính của hệ thống nuôi cấy mô tế bào so với trồng trọt ngoài tự nhiên bao gồm: các hợp chất thực vật đƣợc lựa chọn có thể đƣợc tạo liên tục không phụ thuộc các yếu tố bên ngoài nhƣ mùa vụ, điều kiện đất đai và khí hậu; các tế bào nuôi cấy không bị đe dọa bởi sự tấn công của vi sinh vật hoặc côn trùng; các tế bào của bất kỳ loài thực vật nào thậm chí là những loài quý hiếm hoặc có nguy cơ tuyệt chủng có thể dễ dàng duy trì để tạo ra các chất chuyển hóa thứ cấp; và quá trình sản xuất chất chuyển hóa thứ cấp có thể điều khiển nhằm giảm chi phí và cải thiện năng suất.