Nghiên cứu nuôi cấy callus cà gai leo (Solanum hainanense Hance) và ảnh hưởng của chất kích ứng đến sự tích lũy hợp chất thứ cấp

• Tác giả: Đoàn Ngọc Hân
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Thị Lý Anh
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu nuôi cấy callus cà gai leo (Solanum hainanense Hance) và ảnh hưởng của chất kích ứng đến sự tích lũy hợp chất thứ cấp trong callus
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỤC LỤC
• 1.1. Lời cam đoan
• 1.2. Lời cảm ơn
• 1.3. Mục lục
• 1.4. Danh mục chữ viết tắt
• 1.5. Danh mục bảng
• 1.6. Danh mục hình
• 1.7. Trích yếu luận văn
• 1.8. Tính cấp thiết của đề tài
• 1.9. Mục tiêu nghiên cứu
• 1.10. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
• 1.11. Tổng quan tài liệu
• 1.11.1. Sản xuất các hợp chất thứ cấp từ nuôi cấy mô tế bào thực vật
• 1.11.1.1. Vai trò của hợp chất thứ cấp ở thực vật
• 1.11.1.2. Tầm quan trọng của nuôi cấy tế bào thực vật đối với sản xuất các hợp chất thứ cấp
• 1.11.1.3. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào để sản xuất các hợp chất thứ cấp
• 1.12. Ứng dụng chất kích ứng để cải thiện tích lũy hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy tế bào thực vật
• 1.12.1. Giới thiệu về chất kích ứng
• 1.12.2. Một số nghiên cứu ứng dụng chất kích ứng trong nuôi cấy tế bào thực vật
• 1.13. Cây cà gai leo
• 1.13.1. Giới thiệu chung về cây cà gai leo
• 1.13.2. Một số nghiên cứu khác trên cà gai leo
• 1.14. Đánh giá sự tích lũy hợp chất thứ cấp qua thử nghiệm hoạt tính sinh học của chiết xuất dược liệu
• 1.14.1. Xác định hoạt tính chống oxy hóa in vitro thông qua quá trình peroxy hóa lipit tế bào gan chuột
• 1.14.2. Đánh giá tác dụng bảo vệ gan của chiết xuất dược liệu trên chuột bị nhiễm độc CCl4 in vivo
• 1.14.3. Một số nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của các chiết xuất cây dược liệu
• 1.15. Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu
• 1.15.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 1.15.1.1. Đối tượng nghiên cứu
• 1.15.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 1.15.2. Nội dung nghiên cứu
• 1.15.2.1. Xác định môi trường thích hợp nhất cảm ứng tạo callus cà gai leo
• 1.15.2.2. Nhân sinh khối callus
• 1.15.2.3. Đánh giá sự tích lũy các hoạt chất thứ cấp thông qua thử nghiệm hoạt tính sinh học dịch chiết callus, dịch chiết cây cà gai leo tự nhiên
• 1.16. Phương pháp nghiên cứu
• 1.16.1. Phương pháp nuôi cấy in vitro
• 1.16.2. Nuôi cấy cây in vitro
• 1.16.3. Nuôi cấy callus, nhân sinh khối callus
• 1.16.4. Đánh giá hoạt tính sinh học dịch chiết callus
• 1.16.5. Xử lý số liệu
• 1.17. Kết quả và thảo luận
• 1.17.1. Xác định môi trường thích hợp nhất cảm ứng tạo callus cà gai leo
• 1.17.2. Nhân sinh khối callus
• 1.17.3. Đánh giá sự tích lũy các hợp chất thứ cấp qua thử nghiệm hoạt tính sinh học dịch chiết callus, dịch chiết cà gai leo tự nhiên
• 1.17.4. Cảm ứng tạo callus
• 1.17.5. Nhân sinh khối callus
• 1.17.6. Đánh giá sự tích lũy các hợp chất thứ cấp qua thử nghiệm hoạt tính sinh học dịch chiết callus
• 1.18. Kết luận và đề nghị
• Tài liệu tham khảo
• DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
• THESIS ABSTRACT

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Nuôi Cấy Callus Cà Gai Leo Hiện Nay

Cà gai leo (Solanum hainanense Hance) là một dược liệu quý, nổi tiếng với tác dụng giải độc gan. Kinh nghiệm dân gian cho thấy hiệu quả của nó trong điều trị các bệnh về gan như vàng da, mẩn ngứa. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng cà gai leo chứa các alkaloid và glycoalkaloid có khả năng ức chế virus viêm gan B, chống oxy hóa và ngăn ngừa xơ gan. Tuy nhiên, nguồn cung cấp cà gai leo hiện nay chủ yếu dựa vào khai thác tự nhiên, dẫn đến chất lượng không ổn định. Nhân giống bằng hạt cũng gặp khó khăn do hệ số nhân giống thấp. Nuôi cấy mô tế bào thực vật mở ra một hướng đi mới, hứa hẹn cung cấp nguồn dược liệu ổn định, chất lượng cao và có thể kiểm soát được. Nghiên cứu này tập trung vào nuôi cấy callus cà gai leo và ảnh hưởng của các chất kích ứng đến sự tích lũy hợp chất thứ cấp.

1.1. Giới thiệu chung về cây cà gai leo Solanum hainanense

Cà gai leo, còn gọi là cà gai dây, cà vạnh, có tên khoa học là Solanum hainanense Hance. Cây phân bố rộng rãi từ các tỉnh miền Bắc đến Huế và một số nước lân cận như Lào, Campuchia, Trung Quốc. Theo Viện Dược liệu (1993), cà gai leo được đánh giá cao về khả năng giải độc gan. Kinh nghiệm dân gian cho thấy cây có hiệu quả với các bệnh lý về gan như vàng da, vàng mắt, mụn nhọt, mẩn ngứa.

1.2. Tầm quan trọng của hợp chất thứ cấp trong cà gai leo

Trong cà gai leo, các hợp chất thứ cấp như alkaloid và glycoalkaloid đóng vai trò quan trọng. Các chất này có tác dụng ức chế sự sao chép và làm âm tính virus viêm gan B, chống oxy hóa, ngăn ngừa xơ gan hiệu quả (Nguyễn Bích Thu và cs.). Cà gai leo là cây thuốc quý có tiềm năng lớn cho việc sản xuất dược phẩm chữa bệnh.

II. Thách Thức và Giải Pháp Nuôi Cấy Callus Cà Gai Leo

Mặc dù cà gai leo có tiềm năng lớn, việc khai thác từ tự nhiên và nhân giống bằng hạt gặp nhiều hạn chế. Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một giải pháp tiềm năng để khắc phục những hạn chế này. Phương pháp này cho phép tăng sinh khối nhanh chóng, tạo ra callus giàu hợp chất thứ cấp, và chủ động kiểm soát quy trình sản xuất trên quy mô công nghiệp. Tuy nhiên, hiệu suất tích lũy hợp chất thứ cấp trong callus vẫn còn là một thách thức. Việc sử dụng chất kích ứng có thể là một giải pháp để cải thiện hiệu suất này. Nghiên cứu này tập trung vào việc tìm kiếm các chất kích ứng phù hợp để tăng cường tích lũy hợp chất thứ cấp trong callus cà gai leo.

2.1. Hạn chế của nguồn dược liệu cà gai leo tự nhiên

Hiện nay, cà gai leo chủ yếu được khai thác từ nguồn tự nhiên, dẫn đến chất lượng không đồng đều. Cà gai leo có thể được nhân giống bằng hạt nhưng hệ số nhân giống không cao do cây ít quả, quả nhỏ và ít hạt. Hơn nữa, cây nhân giống bằng hạt có chất lượng không đồng đều, gây khó khăn cho việc tiêu chuẩn hóa nguyên liệu.

2.2. Ưu điểm của nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro

Nuôi cấy mô và tế bào thực vật với những ưu điểm vượt trội và ứng dụng để tăng thu sinh khối trong thời gian ngắn, hàm lượng hợp chất thứ cấp (HCTC) cao, chủ động dễ điều khiển quy trình sản xuất trên quy mô công nghiệp, tạo nguồn vật liệu ổn định và tập trung, góp phần giải quyết những khó khăn nói trên (Misawa, 1994).

2.3. Vai trò của chất kích ứng trong nuôi cấy mô tế bào

Chất kích ứng là một chất mà khi đưa với nồng độ nhỏ vào hệ thống tế bào sống thì khởi động hoặc cải thiện sự sinh tổng hợp các HCTC trong tế bào đó (Namdeo, 2007). Chất kích ứng thực vật báo hiệu việc hình thành các HCTC, bổ sung chất kích ứng vào môi trường nuôi cấy là phương thức để thu được các sản phẩm HCTC có hoạt tính sinh học một cách hiệu quả nhất.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Môi Trường Nuôi Cấy Callus Tối Ưu

Nghiên cứu này tập trung vào việc xác định môi trường nuôi cấy thích hợp nhất để cảm ứng tạo callus cà gai leo. Các thí nghiệm được thực hiện trên đoạn thân và mảnh lá cà gai leo in vitro. Môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962) được sử dụng làm nền tảng, bổ sung thêm các chất điều tiết sinh trưởng. Các tổ hợp BA + α-NAA và BA + 2,4-D được đánh giá về khả năng cảm ứng tạo callus. Sau 4 tuần, callus từ đoạn thân và mảnh lá được sử dụng để nhân sinh khối, đánh giá ảnh hưởng của môi trường, chế độ chiếu sáng và chất kích ứng.

3.1. Quy trình nuôi cấy in vitro và tạo callus cà gai leo

Các thí nghiệm cảm ứng tạo callus cà gai leo được thực hiện trên đối tượng là đoạn thân và mảnh lá cà gai leo in vitro. Môi trường nuôi cấy sử dụng là môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962) có bổ sung thêm các chất điều tiết sinh trưởng.

3.2. Đánh giá ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng

Các tổ hợp BA + α-NAA và BA + 2,4-D được sử dụng để đánh giá khả năng cảm ứng tạo callus. Callus có nguồn gốc đoạn thân và mảnh lá sau 4 tuần tuổi được sử dụng cho các thí nghiệm nhân sinh khối callus, các nhân tố: môi trường nuôi cấy, chế độ chiếu sáng, các elicitor được đánh giá ảnh hưởng đến khả năng nhân sinh khối callus.

IV. Ảnh Hưởng Của Chất Kích Ứng Đến Sinh Khối Callus Cà Gai Leo

Nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của các chất kích ứng như acid salicylic và chiết xuất nấm men đến khả năng nhân sinh khối callus cà gai leo. Callus được nhân sinh khối trên các môi trường cho khả năng nhân callus tốt nhất. Sau 3 tuần, callus được sấy khô, chiết bằng cồn 70% và đánh giá hoạt tính chống oxy hóa. Hoạt tính chống oxy hóa được so sánh với dịch chiết từ cây cà gai leo trồng tự nhiên thông qua quá trình peroxy hóa lipid tế bào gan chuột.

4.1. Thử nghiệm hoạt tính sinh học dịch chiết callus cà gai leo

Callus được nhân sinh khối trên các môi trường cho khả năng nhân callus tốt nhất sau 3 tuần tuổi được sấy khô đến khối lượng không đổi, sau đó chiết bằng dung môi cồn 700 và được đánh giá hoạt tính chống oxy hóa cùng với dịch chiết của cây cà gai leo trồng tự nhiên thông qua quá trình peoxy hóa lipit tế bào gan chuột theo phương pháp của Blagodorov (1987).

4.2. Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết callus

Hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết callus được đánh giá và so sánh với dịch chiết từ cây cà gai leo tự nhiên. Kết quả cho thấy dịch chiết callus có hoạt tính chống oxy hóa cao hơn so với dịch chiết từ cây tự nhiên, đặc biệt khi có sự hiện diện của chất kích ứng trong môi trường nuôi cấy.

V. Kết Quả Nghiên Cứu Môi Trường Tối Ưu và Chất Kích Ứng

Kết quả nghiên cứu cho thấy môi trường A1 (MS + 0,5 mg/l BA + 1,5 mg/l 2,4-D) và A2 (MS + 0,1 mg/l BA + 1 mg/l 2,4-D) thích hợp để cảm ứng tạo callus. Môi trường A2 ưu thế hơn khi nhân sinh khối callus mô thân và mô lá. Chế độ chiếu sáng 16 giờ sáng/8 giờ tối thích hợp để nhân nhanh callus. Đèn LED với tỉ lệ B/R phù hợp cũng có tác động tích cực. Bổ sung acid salicylic và chiết xuất nấm men kích thích tăng trưởng sinh khối callus. Dịch chiết callus có hiệu quả chống oxy hóa cao hơn dịch chiết cây tự nhiên.

5.1. Môi trường A1 và A2 cho khả năng tạo callus tốt nhất

Môi trường A1 (MS + 0,5 mg/l BA + 1,5 mg/l 2,4-D) và A2 (MS + 0,1 mg/l BA + 1 mg/l 2,4-D) là thích hợp để cảm ứng tạo callus. Khi chiếu sáng bằng đèn huỳnh quang, môi trường nuôi cấy A2 ưu thế hơn khi nhân sinh khối callus mô thân và mô lá so với môi trường A1.

5.2. Ảnh hưởng của ánh sáng và chất kích ứng đến sinh khối

Chế độ chiếu sáng 16 giờ sáng/8 giờ tối thích hợp để nhân nhanh callus hơn chế độ không chiếu sáng. Dưới điều kiện chiếu sáng đèn LED, tỉ lệ B/R: 30/70 thích hợp nhất với nhân callus nguồn gốc từ mảnh lá trên môi trường A2. Đối với callus nguồn gốc từ đoạn thân tỉ lệ B/R : 40/60 thích hợp hơn để nhân callus trên môi trường A1.

5.3. Tác động của acid salicylic và chiết xuất nấm men

Môi trường A1 và A2 bổ sung 100 µM acid salisylic; môi trường A1 và A2 bổ sung 3 g/l nấm men kích thích sự tăng trưởng khối lượng khô TB callus từ 1,81đến 3,35 lần so với đối chứng không bổ sung elicitor.

VI. Ứng Dụng và Hướng Phát Triển Nuôi Cấy Callus Cà Gai Leo

Nghiên cứu này cung cấp cơ sở khoa học cho việc sản xuất dược liệu cà gai leo bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào. Kết quả cho thấy tiềm năng của việc sử dụng chất kích ứng để tăng cường tích lũy hợp chất thứ cấp trong callus. Hướng phát triển tiếp theo có thể tập trung vào tối ưu hóa quy trình nuôi cấy, phân tích thành phần hóa học của dịch chiết callus và đánh giá tác dụng dược lý trên mô hình in vivo. Nghiên cứu này góp phần vào việc bảo tồn và phát triển nguồn dược liệu quý của Việt Nam.

6.1. Tiềm năng ứng dụng trong sản xuất dược phẩm

Nghiên cứu này đưa ra được giải pháp tạo nguồn dược liệu chủ động, dồi dào, có chất lượng đồng đều, góp phần khắc phục những hạn chế về nguồn dược liệu cà gai leo khai thác trong tự nhiên.

6.2. Hướng nghiên cứu tiếp theo và phát triển sản phẩm

Các kết quả đạt được sẽ bổ sung thêm nguồn tài liệu khoa học phục vụ công tác nghiên cứu, giảng dạy về sản xuất hợp chất thứ cấp bằng nuôi cấy tế bào thực vật, một lĩnh vực còn chưa được phổ biến ở nước ta. Cần có thêm các nghiên cứu sâu hơn về phân tích thành phần hóa học và đánh giá tác dụng dược lý của dịch chiết callus.