Luận văn thạc sĩ hus nghiên cứu một số gen liên quan đến khả năng kháng carbapenem của các chủng acinetobacter baumannii phân lập tại bệnh viện phổi trung ương

Nghiên cứu gen kháng carbapenem của Acinetobacter baumannii tại Bệnh viện Phổi Trung ương, góp phần nâng cao hiểu biết về kháng thuốc.

• Tác giả: Lưu Thị Ngọc Hân
• Người hướng dẫn: TS. Phạm Bảo Yên
• Trường học: Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Nghiên cứu một số gen liên quan đến khả năng kháng carbapenem của các chủng Acinetobacter baumannii phân lập tại Bệnh viện Phổi Trung ương
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC HÌNH
• DANH MỤC BẢNG
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Kháng sinh
• 1.1.1. Định nghĩa kháng sinh và phân loại theo cấu trúc hóa học
• 1.1.2. Cơ chế và vị trí tác dụng của kháng sinh
• 1.1.2.1. Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein
• 1.1.2.2. Ức chế quá trình sinh tổng hợp acid nucleic
• 1.1.2.3. Kìm hãm các quá trình trao đổi chất
• 1.1.2.4. Tác động lên thành tế bào vi khuẩn
• 1.1.2.5. Tác động lên màng tế bào vi khuẩn
• 1.1.3. Kháng sinh nhóm beta-lactam
• 1.1.4. Vi khuẩn Acinetobacter baumannii
• 1.1.4.1. Giới thiệu chung và vị trí phân loại
• 1.1.4.2. Đặc điểm hình thái, sinh lý - sinh hóa
• 1.1.4.3. Dịch tễ học
• 1.1.4.3.1. Thực trạng kháng kháng sinh của A. baumannii trên thế giới
• 1.1.4.3.2. Thực trạng kháng kháng sinh của A. baumannii tại Việt Nam
• 1.1.4.4. Các cơ chế kháng kháng sinh của A. baumannii
• 1.1.4.4.1. Tần suất xuất hiện các gen carbapenemase
• 1.1.4.4.2. Tiêu chuẩn đánh giá mức độ kháng kháng sinh của A. baumannii
• 1.2. Các phương pháp nghiên cứu
• 1.2.1. Phương pháp nuôi cấy
• 1.2.2. Phương pháp sinh học phân tử
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.2.1. Nuôi cấy và định danh A. baumannii từ mẫu bệnh phẩm
• 2.2.2. Hóa chất sinh phẩm
• 2.2.3. Các bước tiến hành
• 2.2.4. Kháng sinh đồ
• 2.2.5. Hóa chất, thiết bị
• 2.2.6. Tối ưu hóa phản ứng multiplex PCR
• 2.2.7. Các cặp mồi sử dụng
• 2.2.8. Thành phần phản ứng
• 2.2.9. Chu trình nhiệt
• 2.2.10. Phân tích kết quả
• 2.2.11. Phân tích trình tự DNA
• 2.2.12. Xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Tần suất có mặt của các gen kháng kháng sinh của A. baumannii tại Bệnh viện Phổi Trung ương
• 3.1.1. Tần suất xuất hiện các gen đơn
• 3.1.2. Sự có mặt của các tổ hợp gen
• 3.2. Phân tích mức độ kháng kháng sinh của các mẫu A. baumannii thu được
• 3.2.1. Khả năng kháng beta-lactam carbapenem
• 3.2.2. Các nhóm beta-lactam khác
• 3.2.3. Các kháng sinh khác
• 3.2.4. Đánh giá chung
• 3.2.5. So sánh kết quả về sự có mặt của các gen và khả năng kháng kháng sinh dựa trên kháng sinh đồ và xác định mối liên quan
• 3.3. Phân tích trình tự một số mẫu để khẳng định độ chính xác của phương pháp và tìm hiểu sự khác biệt giữa các chủng thu được với các chủng khác trên thế giới
• 3.3.1. Phân tích trình tự nhằm khẳng định độ chính xác của phương pháp
• 3.3.2. Phân tích những biến đổi trong trình tự của các chủng thu được và một số chủng khác trên thế giới
• KẾT LUẬN
• KIẾN NGHỊ VÀ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về khả năng kháng carbapenem của Acinetobacter baumannii

Acinetobacter baumannii là một trong những tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện phổ biến nhất, đặc biệt là tại các cơ sở y tế lớn như Bệnh viện Phổi Trung ương. Khả năng kháng carbapenem của vi khuẩn này đang trở thành một vấn đề nghiêm trọng trong điều trị. Carbapenem được coi là kháng sinh cuối cùng trong điều trị các nhiễm khuẩn nặng. Tuy nhiên, sự xuất hiện của các chủng A. baumannii kháng carbapenem đã làm giảm hiệu quả điều trị, dẫn đến tỷ lệ tử vong cao và kéo dài thời gian nằm viện. Việc nghiên cứu khả năng kháng này là cần thiết để tìm ra các biện pháp điều trị hiệu quả hơn.

1.1. Đặc điểm sinh học của Acinetobacter baumannii

A. baumannii là một loại vi khuẩn gram âm, có khả năng sống sót trong môi trường khắc nghiệt. Chúng có thể tồn tại trên bề mặt và thiết bị y tế trong thời gian dài, làm tăng nguy cơ lây nhiễm cho bệnh nhân. Đặc điểm này khiến cho việc kiểm soát và điều trị nhiễm khuẩn do A. baumannii trở nên khó khăn hơn.

1.2. Tình hình kháng carbapenem tại Bệnh viện Phổi Trung ương

Tại Bệnh viện Phổi Trung ương, tỷ lệ nhiễm khuẩn do A. baumannii kháng carbapenem đang gia tăng. Các nghiên cứu cho thấy rằng nhiều chủng vi khuẩn này đã phát triển khả năng kháng thuốc, gây khó khăn trong việc điều trị và kiểm soát nhiễm khuẩn. Việc theo dõi và phân tích tình hình kháng thuốc là rất quan trọng để đưa ra các biện pháp can thiệp kịp thời.

II. Vấn đề kháng sinh và thách thức trong điều trị nhiễm khuẩn

Kháng sinh là một trong những phát hiện quan trọng trong y học, nhưng việc lạm dụng và sử dụng không đúng cách đã dẫn đến tình trạng kháng thuốc ngày càng gia tăng. A. baumannii là một trong những vi khuẩn kháng thuốc đáng lo ngại nhất, đặc biệt là với các kháng sinh nhóm carbapenem. Tình trạng này không chỉ ảnh hưởng đến sức khỏe của bệnh nhân mà còn tạo ra gánh nặng cho hệ thống y tế.

2.1. Nguyên nhân dẫn đến kháng carbapenem

Có nhiều nguyên nhân dẫn đến khả năng kháng carbapenem của A. baumannii, bao gồm việc lạm dụng kháng sinh, sự lây lan của các gen kháng thuốc và sự thiếu hụt trong kiểm soát nhiễm khuẩn tại bệnh viện. Các gen mã hóa carbapenemase như OXA-23, OXA-51 là những yếu tố chính góp phần vào khả năng kháng thuốc của vi khuẩn này.

2.2. Hệ quả của tình trạng kháng thuốc

Tình trạng kháng thuốc không chỉ làm tăng tỷ lệ tử vong mà còn kéo dài thời gian điều trị và tăng chi phí y tế. Bệnh nhân mắc nhiễm khuẩn do A. baumannii kháng carbapenem thường phải trải qua nhiều liệu pháp điều trị khác nhau, dẫn đến sự mệt mỏi và lo âu cho cả bệnh nhân và gia đình.

III. Phương pháp nghiên cứu khả năng kháng carbapenem

Để nghiên cứu khả năng kháng carbapenem của A. baumannii, các phương pháp sinh học phân tử và nuôi cấy vi khuẩn được áp dụng. Phân tích gen và kháng sinh đồ là những công cụ quan trọng giúp xác định mức độ kháng thuốc và các gen liên quan. Việc sử dụng multiplex PCR cho phép phát hiện nhanh chóng và chính xác các gen kháng thuốc.

3.1. Phương pháp nuôi cấy và định danh

Việc nuôi cấy A. baumannii từ mẫu bệnh phẩm được thực hiện trong điều kiện vô trùng. Các mẫu được phân lập và định danh bằng các phương pháp sinh học phân tử, giúp xác định chính xác chủng vi khuẩn và khả năng kháng thuốc của chúng.

3.2. Phân tích gen kháng carbapenem

Phân tích gen là một phần quan trọng trong nghiên cứu khả năng kháng thuốc. Các gen như OXA-23, OXA-51 được xác định thông qua kỹ thuật multiplex PCR, giúp đánh giá mối liên quan giữa sự có mặt của các gen này và khả năng kháng carbapenem của A. baumannii.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ kháng carbapenem của A. baumannii tại Bệnh viện Phổi Trung ương là rất cao. Các gen OXA-23 và OXA-51 là những gen phổ biến nhất trong các chủng vi khuẩn được phân lập. Những phát hiện này có thể giúp cải thiện chiến lược điều trị và kiểm soát nhiễm khuẩn tại bệnh viện.

4.1. Tỷ lệ kháng carbapenem trong các mẫu nghiên cứu

Tỷ lệ kháng carbapenem của A. baumannii trong nghiên cứu đạt mức cao, cho thấy sự gia tăng đáng kể trong khả năng kháng thuốc. Điều này nhấn mạnh sự cần thiết phải theo dõi và kiểm soát tình hình kháng thuốc tại bệnh viện.

4.2. Ứng dụng kết quả nghiên cứu trong điều trị

Kết quả nghiên cứu có thể được áp dụng để xây dựng các phác đồ điều trị hiệu quả hơn cho bệnh nhân nhiễm khuẩn do A. baumannii. Việc hiểu rõ về các gen kháng thuốc sẽ giúp các bác sĩ lựa chọn kháng sinh phù hợp và giảm thiểu nguy cơ kháng thuốc.

V. Kết luận và hướng nghiên cứu tiếp theo

Khả năng kháng carbapenem của A. baumannii là một vấn đề nghiêm trọng trong điều trị nhiễm khuẩn bệnh viện. Nghiên cứu này đã chỉ ra rằng việc theo dõi và phân tích các gen kháng thuốc là rất cần thiết để cải thiện hiệu quả điều trị. Hướng nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc phát triển các phương pháp điều trị mới và các biện pháp kiểm soát nhiễm khuẩn hiệu quả hơn.

5.1. Tầm quan trọng của việc theo dõi kháng thuốc

Việc theo dõi tình hình kháng thuốc là rất quan trọng để đưa ra các biện pháp can thiệp kịp thời. Các bệnh viện cần thiết lập hệ thống giám sát kháng thuốc để bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

5.2. Hướng nghiên cứu trong tương lai

Nghiên cứu cần tiếp tục để tìm hiểu sâu hơn về cơ chế kháng thuốc của A. baumannii và phát triển các phương pháp điều trị mới. Việc hợp tác giữa các nhà nghiên cứu và cơ sở y tế là cần thiết để giải quyết vấn đề kháng thuốc hiệu quả.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Năm 2017, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đã xếp vi khuẩn Acinetobacter baumannii kháng carbapenem (CRAB) vào vị trí số một trong danh sách 12 nhóm vi sinh vật nguy hiểm nhất toàn cầu, đòi hỏi cấp thiết các giải pháp can thiệp y tế mới. Trong môi trường điều trị hồi sức tích cực (ICU), tỷ lệ tử vong do nhiễm trùng huyết và viêm phổi thở máy liên quan đến vi khuẩn này dao động từ 34,0% đến 43,4%, thậm chí đạt mức 40,0% đến 60,0% đối với các ca nhiễm trùng nặng tại cộng đồng. Vấn đề nghiên cứu trọng tâm hiện nay là sự gia tăng đột biến của các chủng A. baumannii đa kháng và siêu kháng thuốc đối với nhóm kháng sinh carbapenem – tuyến phòng thủ cuối cùng trước khi phải chỉ định colistin.

Mục tiêu cụ thể của luận văn tập trung vào ba nội dung cốt lõi:

1. Thống kê tần suất xuất hiện của 4 gen mã hóa carbapenemase chủ chốt gồm blaOXA-23, blaOXA-51, blaVIM và blaIMP trên các chủng vi khuẩn phân lập được.
2. Đánh giá mức độ nhạy cảm và đề kháng kiểu hình của vi khuẩn đối với các kháng sinh carbapenem và các nhóm kháng sinh thông dụng khác thông qua kháng sinh đồ.
3. Xác định mối liên quan giữa sự hiện diện của các gen kháng thuốc với kiểu hình kháng kháng sinh, đồng thời phân tích trình tự nucleotide nhằm kiểm chứng tính chính xác của phương pháp sinh học phân tử.

Nghiên cứu được thực hiện trên các mẫu bệnh phẩm thu thập tại Bệnh viện Phổi Trung ương trong giai đoạn năm 2019. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của công trình thể hiện ở việc tối ưu hóa quy trình multiplex PCR giúp phát hiện đồng thời 4 gen kháng thuốc trong một phản ứng duy nhất, rút ngắn thời gian chẩn đoán gen từ 48 giờ nuôi cấy xuống dưới 4 giờ. Kết quả này cung cấp cơ sở dữ liệu dịch tễ học phân tử chuẩn xác cho các bác sĩ lâm sàng, giảm thiểu tỷ lệ thất bại trong phác đồ điều trị viêm phổi bệnh viện khi tỷ lệ đề kháng meropenem thực tế đã vượt ngưỡng 95,0%.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Cơ chế đề kháng kháng sinh ở vi khuẩn Acinetobacter baumannii được vận hành thông qua hệ thống phân loại beta-lactamase của Ambler, bao gồm bốn phân lớp A, B, C và D. Trong đó, hai nhóm đóng vai trò trực tiếp đối với tính kháng carbapenem là phân lớp B (metallo-beta-lactamase như VIM, IMP sử dụng ion kẽm tại trung tâm hoạt động) và phân lớp D (oxacillinase họ OXA có khả năng thủy phân carbapenem mạnh mẽ). Ngoài cơ chế enzyme, vi khuẩn còn sử dụng hệ thống bơm đẩy ngược thuốc thuộc siêu họ RND (tiêu biểu là phức hệ AdeABC) và đột biến làm biến đổi cấu trúc protein gắn penicillin (PBP).

Các khái niệm chính được sử dụng xuyên suốt công trình gồm:

• Vi khuẩn đa kháng thuốc (MDR): Chủng vi khuẩn không nhạy cảm với ít nhất 1 kháng sinh trong từ 3 nhóm kháng sinh trở lên theo chuẩn đồng thuận quốc tế giữa Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa Dịch bệnh Hoa Kỳ (CDC) và Trung tâm Phòng ngừa và Kiểm soát Dịch bệnh Châu Âu (ECDC).
• Vi khuẩn siêu kháng thuốc (XDR): Chủng chỉ còn nhạy cảm với 1 đến 2 nhóm kháng sinh trong danh mục thử nghiệm chuẩn.
• Gen kháng thuốc nội tại và thu nhận: blaOXA-51 là gen tự nhiên định vị trên nhiễm sắc thể của loài, trong khi blaOXA-23 nằm trên plasmid và các yếu tố di truyền di động, có khả năng chuyển ngang giữa các loài.
• Biofilm vi khuẩn: Lớp màng sinh học ngoại bào có khả năng bám dính trên các bề mặt vật tư y tế cao gấp 3 lần so với các loài Acinetobacter khác, giúp vi khuẩn sống sót bền bỉ trong bệnh viện.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu của luận văn được thiết lập từ 100 mẫu bệnh phẩm đờm của các bệnh nhân điều trị tại Bệnh viện Phổi Trung ương có kết quả nuôi cấy dương tính với A. baumannii. Phương pháp chọn mẫu là chọn mẫu thuận tiện không xác suất đối với các mẫu đạt tiêu chuẩn bệnh phẩm đường hô hấp dưới. Trong số 100 mẫu thu nhận, có 63 mẫu được chỉ định thực hiện kháng sinh đồ đầy đủ theo yêu cầu lâm sàng.

Quy trình phân tích áp dụng kết hợp ba phương pháp chính:

• Định danh vi khuẩn: Mẫu đờm được nuôi cấy trên thạch máu cừu và thạch MacConkey ở nhiệt độ 35°C đến 37°C trong 18 đến 24 giờ. Định danh hình thái tế bào bằng phương pháp nhuộm Gram và kiểm tra sinh hóa thông qua hệ thống kít API 20NE với độ tin cậy trên 90,0%.
• Thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh: Kỹ thuật khuếch tán khoanh giấy kháng sinh trên môi trường thạch (Kirby-Bauer) được tiến hành theo tiêu chuẩn CLSI đối với 14 loại kháng sinh thuộc 5 nhóm chính, đo đường kính vòng ức chế vô khuẩn chính xác đến milimét.
• Phân tích sinh học phân tử: Tách chiết DNA bằng bộ kít GenoLyse và thực hiện kỹ thuật multiplex PCR. Lý do lựa chọn multiplex PCR thay vì PCR đơn mồi truyền thống là khả năng khuếch đại đồng thời 4 đoạn gen đích (blaOXA-23 kích thước 501 bp, blaOXA-51 kích thước 353 bp, blaVIM kích thước 390 bp, blaIMP kích thước 188 bp) trong cùng một phản ứng thể tích 12,5 µl chứa 0,5 U DreamTaq Polymerase và 8% DMSO. Phương pháp này tiết kiệm 60,0% chi phí hóa chất và giảm 75,0% thời gian thao tác. Một số sản phẩm PCR chọn lọc được giải trình tự Sanger và đối chiếu trình tự với ngân hàng gen NCBI qua các công cụ BLAST 2.0, ClustalW và MEGA 7.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Nghiên cứu đã ghi nhận các kết quả cụ thể về dịch tễ học gen và mức độ kháng thuốc của 100 chủng A. baumannii:

1. Tần suất xuất hiện gen đơn lẻ: Nhóm gen oxacillinase thuộc phân lớp D chiếm ưu thế áp đảo với blaOXA-51 đạt tỷ lệ 88,0% (88/100 mẫu) và blaOXA-23 đạt 77,0% (77/100 mẫu). Ngược lại, nhóm metallo-beta-lactamase thuộc phân lớp B xuất hiện với tần số rất thấp: gen blaIMP chỉ chiếm 5,0% (5/100 mẫu) và gen blaVIM chỉ ghi nhận ở 1,0% (1/100 mẫu).
2. Phân bố các tổ hợp gen: Kiểu tổ hợp 2 gen (blaOXA-23 + blaOXA-51) chiếm tỷ trọng cao nhất với 68,0% (68/100 mẫu). Đáng chú ý, gen blaOXA-23 không bao giờ xuất hiện đơn độc mà luôn luôn đi kèm với blaOXA-51 (tỷ lệ 100%). Tổ hợp 3 gen (blaOXA-23 + blaOXA-51 + blaIMP) chiếm 2,0%, tổ hợp 4 gen đầy đủ chiếm 1,0%, mang gen đơn blaOXA-51 chiếm 17,0%, mang gen đơn blaIMP chiếm 2,0%, và có 10,0% mẫu không phát hiện 4 gen mục tiêu.
3. Mức độ đề kháng kiểu hình đối với carbapenem: Trên 63 mẫu được làm kháng sinh đồ, tỷ lệ kháng meropenem lên tới 95,2% (60/63 chủng), tiếp theo là doripenem với 91,3% (21/23 chủng) và imipenem với 90,5% (57/63 chủng). Đối với nhóm 23 chủng được thử nghiệm đồng thời cả 3 loại carbapenem, có tới 91,3% (21/23 chủng) kháng đồng thời 100% cả ba loại thuốc, chỉ có duy nhất 1 chủng (4,3%) còn giữ được độ nhạy cảm.

Thảo luận kết quả

Tần suất phát hiện gen blaOXA-51 ở mức 88,0% khẳng định bản chất đây là gen nội tại trên nhiễm sắc thể của loài A. baumannii. Mặc dù bản thân enzyme OXA-51 có ái lực thủy phân carbapenem yếu, sự hiện diện của gen blaOXA-23 trên plasmid (chiếm 77,0%) đóng vai trò quyết định tạo ra kiểu hình kháng thuốc mạnh với nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) tăng vọt từ 0,25 µg/ml lên trên 16,0 đến 32,0 µg/ml.

Khi so sánh với các nghiên cứu trong nước, tỷ lệ kháng carbapenem tại Bệnh viện Phổi Trung ương (90,5% - 95,2%) cao hơn đáng kể so với Bệnh viện Bạch Mai (83,3% năm 2017) và Bệnh viện Trung ương Huế (88,3% năm 2017), tương đương với số liệu tại Bệnh viện Trung ương Quân đội 108 và Bệnh viện Việt Đức (92,2% năm 2018). Điều này phản ánh áp lực chọn lọc kháng sinh rất lớn tại một bệnh viện chuyên khoa tuyến cuối về bệnh lý hô hấp.

Để tối ưu hóa việc theo dõi dữ liệu trong các báo cáo lâm sàng, các kết quả trên có thể được trực quan hóa thông qua hai hình thức:

• Biểu đồ điện di đồ chuẩn thể hiện sự phân tách rõ ràng của 4 băng vạch kích thước 188 bp, 353 bp, 390 bp và 501 bp so với thang chuẩn 100 bp DNA ladder.
• Biểu đồ cột kép so sánh tương quan giữa tỷ lệ mang gen blaOXA-23 với phần trăm kháng từng loại carbapenem (meropenem, imipenem, doripenem), làm nổi bật mối liên hệ trực tiếp giữa kiểu gen phân lớp D và mức độ kháng kiểu hình.

Đề xuất và khuyến nghị

Nhằm kiểm soát tình trạng lây lan của các chủng vi khuẩn A. baumannii kháng carbapenem, bốn giải pháp cụ thể được đề xuất:

1. Triển khai quy trình xét nghiệm multiplex PCR 4 gen tại phòng xét nghiệm: Khoa Vi sinh Bệnh viện Phổi Trung ương và các bệnh viện chuyên khoa phổi cần đưa kỹ thuật multiplex PCR vào quy trình sàng lọc định kỳ. Mục tiêu là rút ngắn thời gian trả kết quả gen kháng thuốc từ 48 giờ xuống dưới 4 giờ, áp dụng đồng bộ trong giai đoạn 2020-2021.
2. Điều chỉnh phác đồ điều trị kháng sinh dựa trên bằng chứng kiểu gen: Hội đồng Thuốc và Điều trị cùng các bác sĩ khoa Hồi sức tích cực cần ngừng chỉ định đơn trị liệu carbapenem khi tỷ lệ kháng vượt quá 90,0%. Thay vào đó, thiết lập phác đồ phối hợp kháng sinh dựa trên Colistin phối hợp Sulbactam liều cao hoặc Tigecycline, hướng tới mục tiêu giảm 20,0% tỷ lệ thất bại điều trị trong giai đoạn 2020-2022.
3. Thiết lập hệ thống giám sát dịch tễ học phân tử liên tục: Đơn vị Kiểm soát nhiễm khuẩn phối hợp với Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương tiến hành theo dõi biến động của plasmid mang gen blaOXA-23 định kỳ 6 tháng một lần, đảm bảo 100% các ca nhiễm khuẩn bệnh viện tại ICU được lấy mẫu phân tích gen.
4. Ban hành quy chuẩn cách ly và kiểm soát nhiễm khuẩn bề mặt: Lãnh đạo bệnh viện và Bộ Y tế cần ban hành quy trình vệ sinh nghiêm ngặt đối với máy thở và môi trường xung quanh giường bệnh, đặt mục tiêu giảm 30,0% tỷ lệ lây truyền chéo vi khuẩn sinh biofilm trong các khoa hồi sức cấp cứu từ năm 2020.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung và kết quả nghiên cứu của luận văn mang lại giá trị thực tiễn cho bốn nhóm đối tượng chính:

1. Bác sĩ lâm sàng chuyên khoa Hồi sức tích cực và Hô hấp: Nắm bắt bức tranh toàn cảnh về mức độ đề kháng meropenem (95,2%) và imipenem (90,5%) để đưa ra quyết định phối hợp kháng sinh sớm cho bệnh nhân viêm phổi thở máy, tránh lạm dụng đơn trị liệu carbapenem.
2. Kỹ thuật viên và chuyên viên xét nghiệm vi sinh lâm sàng: Tiếp cận quy trình kỹ thuật tối ưu hóa multiplex PCR 4 gen, từ việc pha hóa chất với 8% DMSO đến thiết lập chu trình nhiệt 30 chu kỳ, phục vụ cho việc chuẩn hóa quy trình xét nghiệm sinh học phân tử tại cơ sở y tế.
3. Học viên, nghiên cứu sinh ngành Vi sinh vật học và Dược lý học: Sử dụng luận văn như một tài liệu tham khảo chuẩn mực về phương pháp kết hợp giữa kháng sinh đồ khuếch tán đĩa và giải trình tự gen Sanger trong phân tích cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn Gram âm.
4. Cán bộ quản lý y tế và Ban Kiểm soát nhiễm khuẩn bệnh viện: Khai thác số liệu về tỷ lệ mang gen blaOXA-23 (77,0%) để xây dựng chính sách quản lý sử dụng kháng sinh (Antimicrobial Stewardship) và thiết lập hàng rào kiểm soát lây nhiễm chéo tại các khu vực chăm sóc đặc biệt.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao vi khuẩn Acinetobacter baumannii lại được WHO xếp vào nhóm vi khuẩn ưu tiên cảnh báo cao nhất?
Vi khuẩn này có khả năng hình thành biofilm bề mặt cao gấp 3 lần các loài khác và tồn tại bền bỉ trong môi trường bệnh viện. Tỷ lệ tử vong tại ICU do vi khuẩn này gây ra dao động từ 34,0% đến 43,4%. Tại Bệnh viện Phổi Trung ương, mức độ kháng các loại carbapenem đã lên tới 90,5% - 95,2%, vô hiệu hóa hầu hết các phác đồ kháng sinh thông thường.

Sự khác biệt cốt lõi giữa hai gen kháng thuốc blaOXA-51 và blaOXA-23 là gì?
Gen blaOXA-51 là gen nội tại tự nhiên nằm trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn với tỷ lệ xuất hiện 88,0%, có hoạt tính thủy phân carbapenem yếu. Ngược lại, gen blaOXA-23 (chiếm 77,0%) nằm trên plasmid di động, có khả năng chuyển ngang và tự thân làm tăng giá trị MIC của vi khuẩn lên trên 16,0 µg/ml, trực tiếp tạo ra kiểu hình kháng carbapenem mạnh.

Tại sao tỷ lệ phát hiện các gen nhóm Metallo-beta-lactamase (blaVIM, blaIMP) trong nghiên cứu lại rất thấp?
Kết quả cho thấy gen blaIMP chỉ xuất hiện ở mức 5,0% và blaVIM là 1,0%. Số liệu này hoàn toàn tương đồng với các nghiên cứu tại Bệnh viện 108 (dưới 1,0%) và Bệnh viện Trung ương Huế (4,4% đối với IMP, 0% đối với VIM), khẳng định cơ chế kháng carbapenem của A. baumannii tại Việt Nam chủ yếu do các enzyme phân lớp D (OXA) chi phối chứ không phải phân lớp B.

Phương pháp multiplex PCR mang lại lợi thế gì so với phương pháp kháng sinh đồ truyền thống?
Kháng sinh đồ nuôi cấy cổ điển đòi hỏi thời gian từ 24 đến 48 giờ để đọc đường kính vòng vô khuẩn. Ngược lại, kỹ thuật multiplex PCR tối ưu hóa trong luận văn chỉ cần 3 đến 4 giờ để phát hiện đồng thời 4 gen kháng thuốc trong một giếng phản ứng 12,5 µl, giúp rút ngắn 80,0% thời gian xác định cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn.

Khi vi khuẩn đã kháng Meropenem 95,2%, phác đồ điều trị lâm sàng cần thay đổi như thế nào?
Bác sĩ cần ngừng phác đồ đơn trị liệu bằng carbapenem do tỷ lệ thất bại điều trị trên 90,0%. Thay vào đó, các hướng dẫn lâm sàng khuyến cáo chuyển sang phác đồ phối hợp đa kháng sinh, chẳng hạn như Colistin kết hợp với Sulbactam liều cao hoặc Tigecycline, được tính toán dựa trên các chỉ số dược động học và dược lực học (PK/PD) chuẩn xác.

Kết luận

• Luận văn đã xác định tần suất chiếm ưu thế vượt trội của hai gen oxacillinase phân lớp D gồm blaOXA-51 (88,0%) và blaOXA-23 (77,0%), trong đó tổ hợp đôi blaOXA-23 + blaOXA-51 chiếm tới 68,0% tổng số mẫu nghiên cứu.
• Các gen metallo-beta-lactamase phân lớp B xuất hiện với tần số rất thấp (blaIMP chiếm 5,0%, blaVIM chiếm 1,0%), chứng minh vai trò thứ yếu của nhóm gen này tại cơ sở nghiên cứu.
• Mức độ đề kháng kháng sinh carbapenem đạt mức báo động nghiêm trọng: meropenem bị kháng 95,2%, doripenem 91,3% và imipenem 90,5%; tỷ lệ chủng kháng đồng thời cả 3 loại carbapenem lên tới 91,3%.
• Tối ưu hóa thành công quy trình multiplex PCR 4 gen với điều kiện bổ sung 8% DMSO, cho phép chẩn đoán nhanh và chính xác các gen kháng thuốc trong vòng chưa đầy 4 giờ.
• Luận văn cung cấp cơ sở dữ liệu khoa học tin cậy hỗ trợ đắc lực cho công tác chẩn đoán phân tử và định hướng chiến lược sử dụng kháng sinh hợp lý tại Bệnh viện Phổi Trung ương.

Hướng nghiên cứu tiếp theo trong giai đoạn 2020-2023 cần mở rộng quy mô mẫu lên trên 300 mẫu tại nhiều bệnh viện chuyên khoa trên toàn quốc, kết hợp ứng dụng kỹ thuật Real-time PCR và giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) để khảo sát toàn diện các đột biến bơm đẩy và tính thấm màng ngoài. Các nhà khoa học, bác sĩ lâm sàng và nhà quản lý y tế được khuyến khích khai thác dữ liệu từ công trình này để hoàn thiện phác đồ điều trị và bảo vệ hiệu lực của các kháng sinh dự trữ cuối cùng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Kháng sinh 1. Định nghĩa kháng sinh và phân loại theo cấu trúc hóa học Kháng sinh (antibiotics) là những chất kháng khuẩn (antibacterial substances) được tạo ra bởi các chủng vi sinh vật (vi khuẩn, nấm, Actinomycetes), có tác dụng ức chế sự phát triển của các vi sinh vật khác [58]. Theo quan điểm hiện đại, kháng sinh được mở rộng đến cả những chất kháng khuẩn có nguồn gốc tổng hợp như các sulfonamid và quinolon.

Hiện nay, có nhiều cách để phân loại kháng sinh nhưng cách phân loại phổ biến nhất là dựa trên cấu trúc phân tử, cơ chế tác động và phổ hoạt động của từng kháng sinh. Một vài cách phân loại khác trong đó có thể bao gồm đường đưa thuốc (đường tiêm, đường uống hay đường đặt trực tràng…). Kháng sinh trong cùng một nhóm cấu trúc sẽ thể hiện các đặc tính tương tự như nhau về hiệu quả tác dụng, độc tính và cả tác dụng không mong muốn. Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học [58,20] STT Tên nhóm Phân nhóm Đại diện 1 Beta-lactam Penicilin penicilin G-V, amoxicilin, ampicilin … Cephalosporin cephalexin, cefixim, cefepim, ceftriaxon, … Carbapenem imipenem, doripenem, meropenem, ertapenem Monobactam aztreonam Các chất ức chế beta- sulbactam, tazobactam, lactamase acid clavulanic … 2 Aminoglycosid gentamycin, tobramycin, amikacin … 3 Macrolid erythromycin, spiramycin, azithromycin … 4 Lincosamid lincomycin, clidamycin… 5 Phenicol chloramphenicol 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 6 Tetracyclin tetracyclin, doxycyclin, mynocyclin 7 Peptid Glycopeptid vancomycin, teicoplanin Polypeptid polymyxin, colistin Lipopeptid daptomycin 8 Quinolon ciprofloxacin, ofloxacin, levofloxacin… 9 Sulfamide sulfamethoxazole, sulfanilid sulacetamide … 10 Các nhóm kháng metronidazole, nystatin, sinh khác griseofulvin … 1.

Cơ chế và vị trí tác dụng của kháng sinh Hoạt tính kháng khuẩn của hầu hết các nhóm kháng sinh đều liên quan trực tiếp đến các đặc tính điển hình của cấu trúc vi khuẩn hoặc các quá trình trao đổi chất của chúng. Để tìm hiểu vị trí tác dụng của một loại kháng sinh cụ thể trước hết phải nắm được cấu trúc của kháng sinh và nơi nó có thể gắn kết (Hình 1). Hầu hết các đích của kháng sinh thường liên quan trực tiếp đến tế bào vi khuẩn thông qua việc ức chế quá trình sinh trưởng của tế bào hoặc ức chế hình thành vật liệu di truyền [16]. Các vị trí tác dụng của kháng sinh [16] 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.

Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein Kháng sinh ngăn cản sự khởi đầu quá trình tổng hợp protein bằng cách gắn vào tiểu đơn vị ribosom 30S và 50Svới các cơ chế bao gồm: Liên kết không đảo ngược với ribosom 30Svà ngăn cản phức hệ khởi đầu 30S (30S- mRNA-tRNA): Các aminoglycosid (diệt khuẩn). Liên kết có thể đảo ngược với ribosom 30S và ức chế quá trình liên kết aminoacyl-t- RNA với vị trí tiếp nhận trên ribosom 70S: Các tetracycline (kháng khuẩn). Cản trở có thể đảo ngược quá trình tương tác giữa mRNA và ribosom 30S mà không gây sai sót trong dịch mã mRNA như các aminoglycoside: spectinomycin (kháng khuẩn). Liên kết với ribosom 50S ức chế hoạt tính của peptidyl transferase: lincomycin, clindamycin, cloramphenicol (kháng khuẩn) Ức chế quá trình chuyển vị trí của peptidyl tRNA từ vị trí A đến P trên ribosom bằng cách liên kết với ribosom 50S-23S RNA: các marcrolid (kháng khuẩn) Ngoài cơ chế trên, các kháng sinh còn có khả năng tác động lên quá trình kéo dài chuỗi peptid nhờ vào liên kết với yếu tố kéo dài G (EF-G) và ức chế giải phóng EF-G từ phức hệ EF-G/GDP: acid fusidic (kháng khuẩn) 1.

Ức chế quá trình sinh tổng hợp acid nucleic Kháng sinh có thể tác động quá trình sinh tổng hợp acid nucleic bao gồm cả sinh tổng hợp RNA và DNA. Quá trình ức chế sinh tổng hợp RNA nhờ vào liên kết với các RNA polymerase độc lập với DNA và ức chế sự khởi đầu tổng hợp RNA: rifampin, rifamycin, rifampicin (diệt khuẩn). Đối với sinh tổng hợp DNA, kháng sinh liên kết với tiểu đơn vị A của DNA gyrase (topoisomerase) và ngăn cản quá trình siêu cuộn xoắn của DNA bởi vậy ức chế quá trình tổng hợp DNA: quinolon, fluoroquinolone, acid oxolinic (diệt khuẩn). Bên cạnh cơ chế ức chế quá trình sinh tổng, một số kháng sinh còn là các tác nhân làm suy yếu chức năng của khuôn DNA.

Về mặt lý thuyết không có loại nào trong số các tác nhân trên được sử dụng trong trị liệu. Cơ chế của chloroquine và miracil D (lucanthone) là ức chế plasmodia và schistosome tương ứng bằng cách xen 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] kẽ vào DNA và từ đó dẫn đến ức chế tổng hợp acid nucleic. Thuốc nhuộm acridine như proflavine cũng hoạt động theo cơ chế xen kẽ, nhưng vì chúng có độc tính và gây ung thư ở động vật có vú nên chúng cũng không được sử dụng làm chất kháng khuẩn. Kìm hãm các quá trình trao đổi chất Cơ chế này thông qua quá trình ức chế sinh tổng hợp acid folic.

Đây là chất rất quan trọng trong quá trình trao đổi chất của cả acid nucleic và acid amin. Một số loại kháng sinh như sulphonamid và trimethoprim thể hiện tính chất như một cơ chất giả cần thiết cho quá trình trao đổi chất ở tế bào vi khuẩn. Cơ chế này làm cho enzyme của vi khuẩn gắn với kháng sinh thay vì gắn với cơ chế thông thường. Cụ thế đối với sulfonamid, đóng vai trò như tetrahydrofolate là một thành phần quan trọng trong việc tổng hợp acid folic ở tế bào vi khuẩn.

Các chất tương tự acid para-aminobenzoic ức chế cạnh tranh đối với sự hình thành acid folic: sulfonamid, sulfone, para-aminosalicylic, depsone (kháng khuẩn). Liên kết với dihydrofolate reductase và ức chế sự hình thành acid tetrahydrofolic: trimethoprim, methotrexate, pyrimethamine (kháng khuẩn). Tác động lên thành tế bào vi khuẩn Kháng sinh đại diện cho cơ chế ức chế sinh tổng hợp acid mycolic, một thành phần của thành tế bào vi khuẩn, là isoniazid. Tuy nhiên cơ chế chính tác động lên thành tế bào vi khuẩn của kháng sinh đó là quá trình ức chế tổng hợp thành tế bào vi khuẩn.

Quá trình tổng hợp peptidoglycan diễn ra theo ba bước, và mỗi bước đều có thể trở thành đích tác động của kháng sinh. Trong đó giai đoạn thứ ba của quá trình tổng hợp thành tế bào bao gồm quá trình polymer hóa và gắn peptidoglycan mới sinh vào thành tế bào là giai đoạn tác động chủ yếu của kháng sinh. Giai đoạn này có sự tham gia của các PBP đó là các enzyme thuộc họ transglycosylase và transpeptidase. Hai loại enzyme này đóng vai trò then chốt trong việc hình thành peptidoglycan bằng cách thêm các pentapeptide disaccarid để mở rộng chuỗi glycan của phân tử peptidoglycan đã có và cả chuỗi liên kết ngang của các đơn vị peptidoglycan chưa trưởng thành.

Các loại thuốc thuộc nhóm beta-lactam như penicillin, carbapenem và cephalosporin có thể ngăn chặn liên kết ngang của các đơn vị peptidoglycan bằng cách ức chế sự hình thành liên kết peptide được xúc tác bởi các PBP. 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Tác động lên màng tế bào vi khuẩn Kháng sinh có thể thay đổi tính thấm của màng với các ion natri và kali. Valinomycin thay đổi tính thấm của màng đối với ion K+ của cả tế bào nhân sơ và nhân chuẩn bởi vậy nó không phải là chất kháng khuẩn được dùng trong hóa trị liệu.

Tuy nhiên monensin (ở gia súc) và salinomycin (ở heo) được sử dụng rộng rãi trong thú y và có thể tức chế cả vi khuẩn, protozoa và metazoan ký sinh. Ngoài ra một số nhóm kháng sinh có thể liên kết với màng tế bào chất và khử cực, ví dụ như daptomycin khử cực màng phụ thuộc canxi, và điều đó dẫn đến sự ngừng tổng hợp đại phân tử và phá vỡ màng tế bào ở vi khuẩn. Một đích tác dụng quan trọng khác của kháng sinh trên màng tế bào đó là LPS. Kháng sinh sẽ liên kết với LPS để phá hủy lớp màng ngoài.

LPS có vài điểm tích điện âm có khả năng tương tác với các kháng sinh cyclopeptid như polymyxin và colistin tích điện dương, ngoài ra một vài phản ứng kỵ nước giữa hai phân tử cũng dẫn tới làm phân ra lớp màng ngoài. Các kháng sinh nhóm polyen tạo kênh ion giả gắn với màng sterol của màng tế bào nấm tạo ra phức hệ màng-polyen có thể thay đổi tính thấm của màng, dẫn tới làm thất thoát các thành phần của tế bào như ester phosphate, acid hữu cơ, nucleotide và thậm chí cả các protein tế bào. Cơ chế cuối cùng tác động lên màng tế bào là cản trở quá trình tổng hợp màng lipid. Những kháng sinh này ức chế quá trình liên kết của các tiểu đơn vị tạo thành ergosterol và có thể trực tiếp phả hủy màng tế bào nấm: các kháng sinh này thuộc nhóm imidazoles: miconazole, ketoconazole, clotrimazole, và fluconazole.

Kháng sinh nhóm beta-lactam Đây là nhóm kháng sinh lớn và được sử dụng rộng rãi trong công tác điều trị tại nhiều nơi. Việc đặt tên là kháng sinh beta-lactam dựa trên cấu trúc phân tử có vòng beta-lactam, một amid nội phân tử mà nhóm amin ở vị trí beta so với nhóm chức acid. Các kháng sinh nhóm này gắn vào PBP và ngăn cản quá trình sinh tổng hợp peptidoglycan ở thành tế bào làm cho tế bào vi khuẩn bị ly giải và chết. Nhóm kháng sinh này bao gồm 5 phân nhóm là: penicillin, cephalosporin, monobactam, carbapenem và nhóm chất ức chế beta-lactamase.

7 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Penicillin [20,72] Đây là nhóm được Alexander Fleming phân lập đầu tiên từ môi trường nuôi cấy nấm Penicillium notatum. Dựa trên phổ tác dụng chúng được chia thành 4 loại: Penicillin tự nhiên: Tác dụng mạnh trên các cầu khuẩn Gram (+) không sinh penicillinase. Penicillin kháng penicillinase: Có phổ hẹp, được nghiên cứu chỉ nhằm tiêu diệt các tụ cầu sinh penicillinase mà loại penicillin tự nhiên không tác dụng.

Aminopenicillin: Có phổ mở rộng. Tác dụng tương tự như penicillin tự nhiên trên vi khuẩn Gram (+) nhưng yếu hơn, tuy nhiên lại mở rộng tác dụng trên một số vi khuẩn Gram (-) như Haemophilus influenza, Salmonella, Escherichia coli, … Penicillin phổ rộng: loại này có tác dụng mạnh hơn các loại khác trên các vi khuẩn Gram (-) (đặc biệt Pseudomonas và Proteus) do tăng tính thấm qua màng tế bào vi khuẩn. Ưu điểm chủ yếu của nhóm này là có tác dụng lên Pseudomonas aeruginosa. Cephalosporin Năm 1948, Abraham và cộng sự đã phân lập được từ môi trường nuôi cấy nấm Cephalosporium acremonium hợp chất đặt tên là cephalosporin C.

Hợp chất này có tác dụng kháng khuẩn nhưng rất yếu, tuy nhiên nó lại chính là tiền đề cho việc tổng hợp ra các loại cephalosporin sau này. Hiện nay có bốn thế hệ cephalosporin được phân loại dựa trên phổ tác dụng đối với vi khuẩn Gram (-) và độ bền của chúng đối với các beta-lactamase [72]. Thế hệ I: Tác dụng mạnh nhất trên các vi khuẩn Gram (+) và yếu nhất trên vi khuẩn Gram (-). Không bền và dễ bị beta-lactamase phá hủy.