Tổng quan luận án

Ung thư gan là một trong những bệnh lý ác tính phổ biến và là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới cũng như tại Việt Nam. Theo số liệu từ GLOBOCAN năm 2020, ung thư gan đứng thứ sabe về số ca mắc mới (khoảng 841.000 trường hợp) và đứng thứ tư về tỷ lệ tử vong do ung thư trên toàn cầu (khoảng 782.000 trường hợp). Tại Việt Nam, ung thư gan chiếm vị trí thứ nhất về tỷ lệ mắc mới (25.335 ca, chiếm 15,4%) và đứng đầu về tỷ lệ tử vong do ung thư (25.404 ca, chiếm 22,1%). Trong các phân loại ung thư gan nguyên phát, ung thư biểu mô tế bào gan (UTBMTBG - Hepatocellular Carcinoma: HCC) chiếm đa số với tỷ lệ khoảng 90%. Khoảng 70–90% UTBMTBG phát triển trên nền các bệnh lý gan mạn tính, bao gồm xơ gan, nhiễm viêm gan siêu vi B (HBV), viêm gan siêu vi C (HCV), bệnh gan do rượu và bệnh gan nhiễm mỡ không do rượu (NAFLD).

Do tính chất đa dạng về hình thái tế bào và cơ chế sinh bệnh phức tạp, tiên lượng của bệnh nhân UTBMTBG có sự khác biệt rất lớn. Quá trình nghiên cứu sinh học phân tử đã chỉ ra sự tồn tại của quần thể tế bào gốc ung thư (Cancer Stem Cells - CSCs) trong mô ung thư gan. Các tế bào này sở hữu những đặc tính sinh học bao gồm: khả năng tự làm mới (self-renewal), tiềm năng biệt hóa (differentiation), khả năng hình thành khối u (tumorigenicity) và tính kháng hóa/xạ trị. Mặc dù nhiều dấu ấn bề mặt tế bào gốc ung thư như EpCAM, CK19, CD44, CD133, CD90, CD24 và CD13 đã được nghiên cứu trên thế giới, nhưng tính đặc hiệu của từng dấu ấn đơn lẻ vẫn có những giới hạn nhất định do sự không đồng nhất của mô u. Do đó, xu hướng tiếp cận hiện nay là kết hợp đồng thời nhiều dấu ấn tế bào gốc ung thư với các đặc điểm giải phẫu bệnh - lâm sàng nhằm nâng cao độ chính xác trong chẩn đoán và tiên lượng.

Tại thời điểm nghiên cứu, ở Việt Nam chưa có công trình nào công bố đầy đủ về kiểu biểu hiện và đồng biểu hiện của các dấu ấn tế bào gốc ung thư trong UTBMTBG. Luận án tiến sĩ y học của nghiên cứu sinh Tiền Thanh Liêm với đề tài "Nghiên cứu biểu hiện dấu ấn tế bào gốc ung thư trong ung thư biểu mô tế bào gan", chuyên ngành Giải phẫu bệnh – Pháp y (mã số: 62 72 01 05), thực hiện tại Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh dưới sự hướng dẫn khoa học của GS. Hứa Thị Ngọc Hà, được tiến hành nhằm giải quyết khoảng trống nghiên cứu này.

Luận án xác định hai mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

  1. Xác định kiểu biểu hiện và đồng biểu hiện của các dấu ấn CK19, CD44, EpCAM bằng phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch trong UTBMTBG.
  2. Xác định mối liên quan giữa kiểu biểu hiện và đồng biểu hiện của các dấu ấn CK19, CD44, EpCAM với các đặc điểm giải phẫu bệnh UTBMTBG.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: 100 mẫu bệnh phẩm mô đúc khối nến và tiêu bản của các bệnh nhân đã được phẫu thuật cắt u và chẩn đoán xác định là UTBMTBG trong giai đoạn từ năm 2010 đến năm 2012.
  • Phạm vi không gian: Nghiên cứu thu thập thông tin lâm sàng tại Bệnh viện Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh; thực hiện xử lý kỹ thuật mô bệnh học, nhuộm hóa mô miễn dịch và phân tích giải phẫu bệnh tại Bộ môn Mô phôi – Giải phẫu bệnh, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh.
  • Phạm vi thời gian: Thời gian thực hiện nghiên cứu từ tháng 10/2014 đến tháng 10/2017; luận án hoàn thành và bảo vệ năm 2022.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã tổng hợp hệ thống cơ sở dữ liệu y văn trong nước và quốc tế liên quan đến tế bào gốc ung thư của gan, các dấu ấn sinh học phân tử và đặc điểm bệnh học của UTBMTBG.

Các hướng nghiên cứu trước đây được điểm lại

Tác giả đã phân tích cơ chế hình thành và đặc tính sinh học của tế bào gốc ung thư gan từ các nguồn: tế bào gốc/tiền thân gan bình thường ở kênh Hering bị biến đổi, sự khử biệt hóa/hồi biệt hóa của tế bào gan trưởng thành dưới tác động của các yếu tố biến đổi di truyền và vi môi trường viêm mạn tính (như vai trò của yếu tố chỉnh sửa chất nhiễm sắc CHD1L, các con đường truyền tín hiệu Wnt/β-catenin, TGF-β/Smad, JNK).

Về các dấu ấn sinh học của tế bào gốc ung thư:

  • EpCAM (Epithelial Cell Adhesion Molecule): Là kháng nguyên bề mặt tế bào biểu mô màng loại I (314 axit amin). Dấu ấn này không biểu hiện ở tế bào gan trưởng thành bình thường mà xuất hiện ở gan phôi thai, tế bào biểu mô ống mật và các tổn thương tiền ung thư. Luận án trích dẫn các nghiên cứu quốc tế ghi nhận tỷ lệ biểu hiện EpCAM trong UTBMTBG dao động lớn: Kim (2011) ghi nhận 35% trên 137 mẫu; Govaere (2013) ghi nhận 14,97% trên 167 mẫu; Matthai (2015) ghi nhận 32,7% trên 49 mẫu; Sung và cộng sự (2015) ghi nhận 56% trên 82 mẫu; Kumagai và cộng sự (2016) ghi nhận 8,5% trên 94 mẫu; Noh và cộng sự (2018) ghi nhận 46,9% trên 262 trường hợp. Biểu hiện EpCAM đi kèm kích hoạt Wnt/β-catenin và liên quan đến tính kháng doxorubicin, 5-fluorouracil.
  • CK19 (Cytokeratin 19): Dấu ấn biểu mô thuộc họ cytokeratin của tế bào đường mật và tế bào tiền thân gan, liên quan đến con đường chuyển dạng biểu mô - trung mô (EMT) và TGF-β/Smad. Nghiên cứu của Govaere (2013) ghi nhận tỷ lệ dương tính CK19 là 11,38% (đồng biểu hiện với EpCAM là 6,58%); Matthai (2015) ghi nhận 24,5%; Sung (2015) ghi nhận 6%; Kumagai (2016) ghi nhận 19,1%; Masato và cộng sự (2016) ghi nhận 8,8% trên 136 mẫu. Các nghiên cứu chỉ ra rằng UTBMTBG dương tính với CK19 có kích thước u lớn hơn, độ biệt hóa kém, tỷ lệ xâm nhập mạch máu vi thể cao và kháng các can thiệp tại chỗ như TACE, RFA.
  • CD44: Glycoprotein màng tế bào đóng vai trò là thụ thể chính của axit hyaluronic, tham gia vào tương tác tế bào - chất nền ngoại bào. Mima (2012) khảo sát biểu hiện CD44v6 liên quan đến xâm nhập mô; Kim và cộng sự (2015) ghi nhận CD44 không biểu hiện trên 13 mẫu UTBMTBG khảo sát; Lingala và cộng sự (2010) ghi nhận tỷ lệ 60% trên 25 mẫu; phân tích gộp của Luo và cộng sự ghi nhận tỷ lệ biểu hiện CD44 dao động từ 30% đến 70%; Thapa (2016) và Kakehashi (2016) xác định vai trò của CD44 và biến thể CD44v9 trong dự đoán tái phát và tiên lượng sau phẫu thuật.
  • Các dấu ấn khác được tổng thuật: CD133 (PROM1), CD90 (Thy-1), CD24, CD13 (aminopeptidase N), tế bào dân số phụ (Side Population - SP thông qua chất vận chuyển BCRP1/ABCG2), aldehyde dehydrogenase (ALDH), OV6 và DLK1.

Khoảng trống nghiên cứu luận án giải quyết

Các công trình trước đây trên thế giới cho thấy sự dao động rất lớn về tỷ lệ biểu hiện của từng dấu ấn đơn lẻ (EpCAM: 8,5% – 56%; CK19: 6% – 30%; CD44: 30% – 70%) do khác biệt về quần thể bệnh nhân, giai đoạn bệnh và quy trình nhuộm. Tại Việt Nam, chưa có dữ liệu nghiên cứu về sự phối hợp bộ 3 dấu ấn CK19, CD44 và EpCAM trên cùng một nhóm bệnh nhân UTBMTBG được phẫu thuật. Luận án giải quyết khoảng trống này bằng việc chuẩn hóa quy trình hóa mô miễn dịch tự động để xác định tỷ lệ đơn biểu hiện, các kiểu đồng biểu hiện (EpCAM/CK19, EpCAM/CD44, CK19/CD44, EpCAM/CK19/CD44) và đối chiếu với các đặc điểm giải phẫu bệnh đại thể và vi thể theo bảng phân loại cập nhật của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO 2019) và Hiệp hội Ung thư Gan Hàn Quốc (2017).

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết và khái niệm sử dụng

Luận án dựa trên khung lý thuyết tế bào gốc ung thư (Cancer Stem Cell Theory) và mô hình phân tầng sinh ung thư (Hierarchical model). Theo mô hình này, khối u UTBMTBG chứa một quần thể nhỏ tế bào gốc có khả năng tự làm mới vô hạn và tạo ra các dòng tế bào biệt hóa không đồng nhất. Quá trình tiến triển ác tính của UTBMTBG gắn liền với hiện tượng chuyển dạng biểu mô - trung mô (EMT), sự mất biệt hóa mô học, khả năng xâm nhập mạch máu vi thể và kháng lại các phác đồ hóa trị liệu thông thường.

Phương pháp nghiên cứu

  • Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu cắt ngang mô tả (descriptive cross-sectional study).

  • Cách thức tính cỡ mẫu: Áp dụng công thức tính cỡ mẫu ước lượng một tỷ lệ trong quần thể:

    $$n = Z_{1-\alpha/2}^2 \cdot \frac{p(1-p)}{d^2}$$

    Trong đó:

    • Hệ số tin cậy $Z_{1-\alpha/2} = 1,96$ (tương ứng độ tin cậy 95%, $\alpha = 0,05$).
    • Sai số tuyệt đối chấp nhận được $d = 0,1$ (do các giá trị $p$ nằm trong khoảng 0,3 – 0,7).
    • Tỷ lệ ước tính từ y văn: với EpCAM chọn $p_1 = 56%$ ($\rightarrow n \ge 95$); với CK19 chọn $p_2 = 30%$ ($\rightarrow n \ge 81$); với CD44 chọn $p_3 = 70%$ ($\rightarrow n \ge 81$).
    • Cỡ mẫu thực tế được chọn vào nghiên cứu là 100 trường hợp, đáp ứng yêu cầu thống kê tối thiểu cho cả ba dấu ấn.

  • Tiêu chuẩn chọn mẫu và loại trừ:

    • Tiêu chuẩn chọn mẫu: Mẫu bệnh phẩm phẫu thuật được vùi nến, chẩn đoán xác định UTBMTBG bằng nhuộm Hematoxylin – Eosin (H&E), khối nến nguyên vẹn, không bị nứt vỡ và đủ diện tích mô để cắt mỏng.
    • Tiêu chuẩn loại trừ: Ung thư từ cơ quan khác di căn đến gan hoặc UTBMTBG đã có di căn xa/di căn hạch; bệnh nhân đã trải qua các phương pháp điều trị khác trước phẫu thuật (như TACE, RFA, hóa trị); khối nến bị hư hỏng hoặc không còn mô u đại diện.

  • Quy trình kỹ thuật và công cụ đo lường:

    • Hệ thống máy nhuộm: Hệ thống máy nhuộm hóa mô miễn dịch tự động Ventana Benchmark XT (Roche).
    • Chuẩn bị mẫu: Cắt lát mô mỏng 3 µm từ khối nến và đặt lên tiêu bản tích điện dương.
    • Thông số kháng thể và điều kiện nhuộm:
Dấu ấn Loại kháng thể Dòng kháng thể Nhà cung cấp Nồng độ kháng thể Điều kiện bộc lộ kháng nguyên Điều kiện ủ kháng thể thứ nhất Bộ phát hiện
EpCAM Đơn dòng Ber-EP4 Ventana - Roche 4,96 µg/ml Dung dịch CC1, 95°C trong 30 phút 37°C trong 16 phút DAB kit
CK19 Đơn dòng A53-B/A2.26 Ventana - Roche 0,23 µg/ml Dung dịch CC1, 95°C trong 30 phút 37°C trong 16 phút DAB kit
CD44 Đơn dòng SP37 Ventana - Roche 0,70 µg/ml Dung dịch CC2, 95°C trong 30 phút 37°C trong 16 phút DAB kit

  • Mẫu chứng: Chứng dương dùng mẫu mô carcinôm tuyến đại tràng (đối với EpCAM và CK19) và mô amiđan bình thường (đối với CD44). Chứng âm được thực hiện bằng cách thay kháng thể thứ nhất bằng dung dịch đệm PBS.

  • Hệ thống biến số và tiêu chuẩn đánh giá giải phẫu bệnh:

    • Đặc điểm đại thể: Phân loại theo Hiệp hội Ung thư Gan Hàn Quốc (2017) và WHO (2019): dạng nốt mơ hồ, dạng nốt lan rộng, dạng nhiều nốt, dạng nốt kèm nốt vệ tinh, dạng lan tỏa; ghi nhận kích thước u lớn nhất và số lượng u (đơn độc, nhiều u, lan tỏa).
    • Cấu trúc mô học (WHO 2019): Dạng bè, dạng giả tuyến, dạng đặc, dạng bè to (>10 lớp tế bào), dạng hỗn hợp (khi có từ 2 dạng chiếm từ 25% đến 75% mô u); các biến thể mô học (viêm gan nhiễm mỡ, sợi mảnh, xơ hóa, giàu lympho, giàu bạch cầu trung tính, kỵ sắc).
    • Biến thể tế bào u: Tế bào gan kinh điển, tế bào sáng, tế bào khổng lồ, phồng bào, tế bào hình thoi, loại tế bào hỗn hợp.
    • Độ biệt hóa mô học (WHO 2019): Biệt hóa tốt, biệt hóa vừa, biệt hóa kém (nếu có nhiều độ biệt hóa thì tính theo độ biệt hóa chiếm >75% hoặc tính theo độ biệt hóa kém nhất).
    • Số lượng phân bào: Đếm trên 10 quang trường độ phóng đại lớn (QTx400); phân chia thành mức độ phân bào thấp (<10 phân bào/10 QTx400) và phân bào cao ($\ge 10$ phân bào/10 QTx400).
    • Thấm nhập tế bào viêm: Đánh giá sự tập trung của lympho bào/tương bào tại 3 vị trí: tiểu thùy, quanh khoảng cửa/tĩnh mạch cửa, và vỏ bao u (mỗi vị trí có viêm tính 1 điểm, không có tính 0 điểm). Tổng điểm: ít (<3 điểm), vừa (=3 điểm), nhiều (>3 điểm).
    • Các yếu tố mô bệnh học khác: Xâm nhập mạch máu vi thể, hoại tử u.
    • Đánh giá mức độ biểu hiện hóa mô miễn dịch: Dựa trên điểm cường độ bắt màu (Intensity Score - IS) và điểm tỷ lệ tế bào u bắt màu (Proportion Score - PS) để tính tổng điểm nhuộm miễn dịch (Total Immunostaining Score - TIS).
    • Xử lý số liệu: Nhập liệu và phân tích thống kê bằng phần mềm SPSS phiên bản 22.0.

Nội dung chính theo từng chương

Chương I: Tổng quan

Chương I hệ thống hóa toàn diện các kiến thức nền tảng về dịch tễ học, sinh học phân tử và giải phẫu bệnh của UTBMTBG:

  1. Khái niệm và đặc tính của tế bào gốc ung thư gan: Trình bày chi tiết lý thuyết tế bào gốc ung thư, bao gồm 4 đặc tính then chốt (tự làm mới, tiềm năng biệt hóa đa dòng, khả năng sinh u và tính đề kháng trị liệu). Phân tích mô hình phân tầng sinh ung thư và nguồn gốc tế bào gốc gan từ kênh Hering, tế bào gan/đường mật trưởng thành thông qua cơ chế chuyển dạng di truyền và hồi biệt hóa.
  2. Các dấu ấn sinh học phân tử: Phân tích cấu trúc phân tử, cơ chế tác động và ý nghĩa tiên lượng của 11 dấu ấn tế bào gốc ung thư (EpCAM, CK19, CD44, CD133, CD90, CD24, CD13, Side Population/ABCG2, ALDH, OV6, DLK1). Phân tích sâu 3 dấu ấn chủ đạo của nghiên cứu (EpCAM, CK19, CD44), làm rõ mối liên quan của từng dấu ấn với con đường Wnt/β-catenin, quá trình EMT và khả năng kháng hóa trị (doxorubicin, 5-FU, sorafenib).
  3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước: Tổng thuật các công trình nghiên cứu quốc tế về tỷ lệ biểu hiện đơn lẻ và phối hợp của EpCAM, CK19, CD44 trên mô bệnh học UTBMTBG.
  4. Bệnh học đại thể và vi thể UTBMTBG: Cập nhật các bảng phân loại mô bệnh học theo WHO (2019) và Hiệp hội Ung thư Gan Hàn Quốc (2017), phân tích các dạng đại thể (nốt mơ hồ, nốt lan rộng, nhiều nốt, nốt kèm vệ tinh, lan tỏa), 4 cấu trúc mô học kinh điển (bè, đặc, giả tuyến, bè to), các biến thể mô học hiếm gặp (sợi mảnh, xơ hóa, viêm gan nhiễm mỡ, giàu tế bào viêm) và 3 mức độ biệt hóa tế bào (tốt, vừa, kém).

Chương II: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương II mô tả chi tiết quy trình triển khai nghiên cứu thực nghiệm trên 100 mẫu bệnh phẩm UTBMTBG:

  1. Thiết kế và địa điểm: Trình bày thiết kế nghiên cứu cắt ngang mô tả, thực hiện tại Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh từ 10/2014 đến 10/2017 trên các mẫu phẫu thuật giai đoạn 2010–2012.
  2. Cơ sở tính toán cỡ mẫu: Trình bày các công thức toán thống kê và tham số y văn để xác định cỡ mẫu đại diện tối thiểu cho ba dấu ấn ($n_{\text{EpCAM}} \ge 95$, $n_{\text{CK19}} \ge 81$, $n_{\text{CD44}} \ge 81$), từ đó thiết lập cỡ mẫu thực tế $N = 100$.
  3. Quy trình chuẩn hóa hóa mô miễn dịch: Mô tả các bước kỹ thuật cắt tiêu bản 3 µm, giao thức bộc lộ kháng nguyên nhiệt độ cao (95°C trong 30 phút bằng dung dịch đệm CC1 cho EpCAM/CK19 và CC2 cho CD44), nồng độ kháng thể đơn dòng (Ber-EP4: 4,96 µg/ml; A53-B/A2.26: 0,23 µg/ml; SP37: 0,70 µg/ml), thời gian ủ kháng thể (16 phút ở 37°C), bộ phát hiện DAB kit trên hệ thống máy Ventana Benchmark XT, cùng việc thiết lập mẫu chứng dương (carcinôm đại tràng, amiđan) và chứng âm (PBS).
  4. Tiêu chuẩn đánh giá và biến số nghiên cứu: Định nghĩa cụ thể các thang đo cho biến số dịch tễ (tuổi, giới), bệnh căn (HBV, HCV), đặc điểm đại thể (kích thước u, số lượng u), đặc điểm vi thể (cấu trúc mô học, biến thể tế bào, độ biệt hóa theo WHO 2019, số lượng phân bào trên 10 QTx400, mức độ xâm nhập mạch máu vi thể, hoại tử u, điểm thấm nhập tế bào viêm 0–3 vị trí), và phương pháp chấm điểm hóa mô miễn dịch TIS.

Chương III: Kết quả nghiên cứu

Chương III trình bày toàn bộ số liệu thu thập được từ 100 trường hợp UTBMTBG:

  1. Đặc điểm dịch tễ và giải phẫu bệnh chung:
    • Phân bố theo nhóm tuổi, giới tính và tình trạng nhiễm siêu vi viêm gan (HBV, HCV).
    • Phân bố theo kích thước khối u, số lượng khối u và dạng đại thể.
    • Tỷ lệ các dạng cấu trúc mô học (bè, giả tuyến, đặc, hỗn hợp) và biến thể tế bào u (kinh điển, tế bào sáng, phồng bào, tế bào khổng lồ).
    • Tỷ lệ phân bố độ biệt hóa mô học (tốt, vừa, kém theo WHO 2019).
    • Tỷ lệ có hiện tượng xâm nhập mạch máu vi thể, hoại tử mô u, mức độ phân bào (<10 so với $\ge 10$ trên 10 QTx400) và mức độ thấm nhập tế bào viêm.
  2. Tỷ lệ biểu hiện đơn lẻ của từng dấu ấn:
    • Tỷ lệ dương tính và phân bố các mức độ biểu hiện (dựa trên điểm TIS) của dấu ấn CK19.
    • Tỷ lệ dương tính và phân bố các mức độ biểu hiện của dấu ấn CD44.
    • Tỷ lệ dương tính và phân bố các mức độ biểu hiện của dấu ấn EpCAM.
  3. Tỷ lệ và các kiểu đồng biểu hiện dấu ấn tế bào gốc ung thư:
    • Tỷ lệ đồng biểu hiện 2 dấu ấn: EpCAM/CK19, EpCAM/CD44, CK19/CD44.
    • Tỷ lệ đồng biểu hiện cả 3 dấu ấn: EpCAM/CK19/CD44 trong mô u.
  4. Mối liên quan giữa biểu hiện dấu ấn với đặc điểm giải phẫu bệnh:
    • Mối tương quan giữa biểu hiện CK19 đơn lẻ với cấu trúc mô học, độ biệt hóa, kích thước u và xâm nhập mạch máu vi thể.
    • Mối tương quan giữa biểu hiện CD44 đơn lẻ với các đặc điểm bệnh học.
    • Mối tương quan giữa biểu hiện EpCAM đơn lẻ với các đặc điểm bệnh học.
    • Mối tương quan giữa các kiểu đồng biểu hiện (EpCAM/CK19, EpCAM/CD44, CK19/CD44, EpCAM/CK19/CD44) với các yếu tố tiên lượng giải phẫu bệnh xấu (độ biệt hóa kém, mức độ phân bào cao, xâm nhập mạch máu vi thể, hoại tử u).

Chương IV: Bàn luận

Chương IV phân tích và đối chiếu kết quả đạt được với y văn trong nước và quốc tế:

  1. Bàn luận về tỷ lệ biểu hiện đơn lẻ và đồng biểu hiện: So sánh tỷ lệ dương tính của EpCAM, CK19, CD44 trong nghiên cứu với các công bố quốc tế của Kim (2011), Govaere (2013), Matthai (2015), Sung (2015), Kumagai (2016), Noh (2018), Masato (2016), Lingala (2010), Luo (2016). Phân tích nguyên nhân dẫn đến sự tương đồng hoặc khác biệt (sự khác biệt về độ nhạy của dòng kháng thể Ber-EP4, A53-B/A2.26, SP37, hệ thống máy nhuộm tự động so với thủ công, và đặc điểm dịch tễ viêm gan siêu vi tại Việt Nam).
  2. Bàn luận về mối liên quan giữa dấu ấn tế bào gốc với đặc điểm giải phẫu bệnh:
    • Phân tích cơ chế sinh học phân tử giải thích tại sao sự hiện diện của CK19 phản ánh tính chất xâm lấn, độ biệt hóa kém và xâm nhập mạch máu vi thể thông qua con đường EMT.
    • Đánh giá vai trò của EpCAM như một chỉ dấu kích hoạt con đường Wnt/β-catenin, gắn liền với các khối u có độ ác tính cao.
    • Phân tích vai trò của CD44 trong tương tác chất nền ngoại bào và khả năng di căn.
    • Ý nghĩa của việc phối hợp bộ ba dấu ấn EpCAM/CK19/CD44 trong việc phân tầng nguy cơ mô bệnh học, hỗ trợ bác sĩ giải phẫu bệnh và ung bướu nhận diện nhóm bệnh nhân có tiên lượng xấu sau phẫu thuật cắt gan.

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt khoa học và thực tiễn

  1. Về mặt phương pháp và kỹ thuật:
    • Luận án đã xây dựng và chuẩn hóa thành công quy trình nhuộm hóa mô miễn dịch tự động trên hệ thống máy Ventana Benchmark XT cho bộ ba dấu ấn tế bào gốc ung thư (EpCAM dòng Ber-EP4, CK19 dòng A53-B/A2.26, CD44 dòng SP37) trên bệnh phẩm mô vùi nến UTBMTBG tại Việt Nam, đảm bảo tính ổn định và khả năng tái lập cao.
  2. Về mặt dữ liệu giải phẫu bệnh học:
    • Cung cấp bộ dữ liệu thực nghiệm đầu tiên tại Việt Nam về tỷ lệ biểu hiện đơn lẻ và các mô thức đồng biểu hiện (EpCAM/CK19, EpCAM/CD44, CK19/CD44 và EpCAM/CK19/CD44) của tế bào gốc ung thư trong UTBMTBG.
    • Xác lập các bằng chứng mô bệnh học về mối liên quan có ý nghĩa giữa kiểu biểu hiện/đồng biểu hiện của các dấu ấn này với các đặc điểm giải phẫu bệnh phản ánh độ ác tính cao (kích thước khối u, độ biệt hóa mô học theo WHO 2019, tình trạng xâm nhập mạch máu vi thể, mức độ phân bào và hoại tử mô u).
  3. Ý nghĩa định hướng ứng dụng lâm sàng:
    • Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở mô bệnh học hỗ trợ tiên lượng độ ác tính của khối u sau phẫu thuật, giúp phát hiện sớm các trường hợp có nguy cơ cao tái phát hoặc kháng trị liệu tại chỗ (như TACE, RFA).
    • Đóng góp dữ liệu tiền đề cho các nghiên cứu phát triển liệu pháp điều trị nhắm trúng đích vào tế bào gốc ung thư biểu hiện EpCAM hoặc CD44 trong tương lai.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

  • Thiết kế nghiên cứu hồi cứu mô tả cắt ngang: Nghiên cứu được thực hiện trên các khối nến lưu trữ từ giai đoạn 2010–2012 tại một trung tâm đơn lẻ (Đại học Y Dược TP.HCM), chưa bao gồm theo dõi dọc tiến cứu về thời gian sống còn toàn bộ (Overall Survival - OS) và thời gian sống không bệnh tái phát (Disease-Free Survival - DFS) của toàn bộ đoàn hệ.
  • Số lượng dấu ấn khảo sát: Luận án tập trung khảo sát 3 dấu ấn chủ đạo (EpCAM, CK19, CD44), chưa thể bao quát toàn bộ các dấu ấn tế bào gốc ung thư gan khác đã được báo cáo trong y văn (như CD133, CD90, CD24, ALDH, OV6).
  • Phạm vi đối tượng: Tiêu chuẩn chọn mẫu chỉ bao gồm các bệnh nhân có chỉ định phẫu thuật cắt u, loại trừ các trường hợp giai đoạn muộn không còn khả năng phẫu thuật hoặc đã điều trị can thiệp trước mổ.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

  • Mở rộng các nghiên cứu đoàn hệ tiến cứu với cỡ mẫu lớn hơn tại nhiều trung tâm, kết hợp theo dõi dài hạn để đánh giá trực tiếp mối tương quan giữa kiểu đồng biểu hiện bộ ba dấu ấn EpCAM/CK19/CD44 với tỷ lệ tái phát sau mổ và thời gian sống còn của bệnh nhân.
  • Nghiên cứu kết hợp thêm các dấu ấn tế bào gốc ung thư khác (như CD133, CD90, ALDH) và các xét nghiệm sinh học phân tử (đột biến gen, giải trình tự RNA) nhằm xây dựng bảng phân loại phân tử chi tiết hơn cho bệnh nhân UTBMTBG tại Việt Nam.
  • Triển khai các nghiên cứu thực nghiệm tiền lâm sàng đánh giá độ nhạy cảm của các dòng tế bào UTBMTBG mang kiểu hình EpCAM+/CD44+ đối với các thuốc điều trị trúng đích hoặc kháng thể đơn dòng.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu chuyên khảo có giá trị ứng dụng cụ thể cho nhiều đối tượng trong ngành y tế:

  • Đối với bác sĩ và nghiên cứu sinh chuyên ngành Giải phẫu bệnh: Cung cấp quy trình chi tiết, thông số chuẩn hóa kỹ thuật nhuộm hóa mô miễn dịch tự động (nồng độ kháng thể, dung dịch bộc lộ kháng nguyên, thời gian ủ) và tiêu chuẩn đánh giá bán định lượng (IS, PS, TIS) cho các dấu ấn EpCAM, CK19, CD44; tài liệu tham khảo cập nhật về phân loại giải phẫu bệnh học UTBMTBG theo WHO 2019.
  • Đối với bác sĩ Ung bướu và Phẫu thuật Gan Mật: Giúp hiểu rõ hơn về tính không đồng nhất của khối u gan và ý nghĩa tiên lượng của kiểu hình tế bào gốc ung thư, từ đó có thêm cơ sở định hướng chiến lược theo dõi tái phát chặt chẽ cho bệnh nhân sau mổ.
  • Đối với giảng viên và sinh viên y khoa: Là nguồn tài liệu học tập toàn diện về cơ chế bệnh sinh phân tử, lý thuyết tế bào gốc ung thư và bệnh học vi thể của ung thư biểu mô tế bào gan.

Câu hỏi thường gặp

1. Ba dấu ấn tế bào gốc ung thư được lựa chọn nghiên cứu trong luận án là gì và cơ sở lựa chọn từng dấu ấn?

Ba dấu ấn được lựa chọn gồm:

  • CK19: Dấu ấn biểu hiện đặc tính biệt hóa kém, xâm lấn, di căn; theo phân loại của WHO (2019), UTBMTBG dương tính với CK19 có tiên lượng xấu và kháng với các biện pháp can thiệp tại chỗ như TACE, RFA.
  • CD44: Glycoprotein bề mặt tế bào quan trọng giúp tăng khả năng nhận diện tế bào gốc ung thư gan khi phối hợp với các dấu ấn khác; biểu hiện CD44 là một yếu tố tiên lượng xấu và liên quan đến tính kháng hóa trị.
  • EpCAM: Không biểu hiện ở tế bào gan trưởng thành bình thường nhưng biểu hiện rõ trong mô gan tiền ung thư và ung thư; EpCAM đóng vai trò trong sự khởi phát u và là mục tiêu tiềm năng cho điều trị trúng đích.

2. Cỡ mẫu nghiên cứu được xác định như thế nào và số lượng mẫu thực tế là bao nhiêu?

Cỡ mẫu nghiên cứu được tính toán theo công thức ước lượng một tỷ lệ trong nghiên cứu cắt ngang mô tả với mức tin cậy 95% ($Z_{1-\alpha/2} = 1,96$), sai số tuyệt đối $d = 0,1$. Dựa trên tỷ lệ ước đoán từ y văn cho từng dấu ấn ($p_{\text{EpCAM}} = 56% \rightarrow n \ge 95$; $p_{\text{CK19}} = 30% \rightarrow n \ge 81$; $p_{\text{CD44}} = 70% \rightarrow n \ge 81$), tác giả đã chọn cỡ mẫu thực tế là 100 trường hợp bệnh phẩm UTBMTBG đúc khối nến, đáp ứng yêu cầu thống kê.

3. Quy trình nhuộm hóa mô miễn dịch tự động trong luận án sử dụng các thông số kỹ thuật nào?

Quy trình được thực hiện trên hệ thống tự động Ventana Benchmark XT với các lát cắt mô dày 3 µm:

  • EpCAM: Kháng thể đơn dòng Ber-EP4 (nồng độ 4,96 µg/ml), bộc lộ kháng nguyên bằng dung dịch CC1 ở 95°C trong 30 phút, ủ kháng thể ở 37°C trong 16 phút.
  • CK19: Kháng thể đơn dòng A53-B/A2.26 (nồng độ 0,23 µg/ml), bộc lộ kháng nguyên bằng dung dịch CC1 ở 95°C trong 30 phút, ủ kháng thể ở 37°C trong 16 phút.
  • CD44: Kháng thể đơn dòng SP37 (nồng độ 0,70 µg/ml), bộc lộ kháng nguyên bằng dung dịch CC2 ở 95°C trong 30 phút, ủ kháng thể ở 37°C trong 16 phút.
  • Cả ba dấu ấn đều sử dụng bộ phát hiện DAB kit.

4. Mẫu mô nào được tác giả sử dụng làm chứng dương và chứng âm trong kỹ thuật nhuộm?

  • Chứng dương: Mô carcinôm tuyến đại tràng được dùng làm chứng dương cho nhuộm EpCAM và CK19; mô amiđan bình thường được dùng làm chứng dương cho nhuộm CD44.
  • Chứng âm: Tiêu bản không phủ kháng thể thứ nhất mà thay thế bằng dung dịch đệm PBS.

5. Độ biệt hóa và các cấu trúc vi thể của UTBMTBG được đánh giá dựa trên tiêu chuẩn nào?

Độ biệt hóa và cấu trúc vi thể được đánh giá theo bảng phân loại u hệ tiêu hóa của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO 2019):

  • Độ biệt hóa: Chia thành 3 mức độ (biệt hóa tốt, biệt hóa vừa, biệt hóa kém) dựa trên so sánh hình thái tế bào u với tế bào gan lành tính.
  • Cấu trúc mô học: Gồm 4 dạng chủ yếu (dạng bè, dạng đặc, dạng giả tuyến, dạng bè to >10 lớp tế bào) và dạng hỗn hợp.
  • Mức độ phân bào: Đếm trên 10 quang trường lớn (QTx400), phân thành mức độ thấp (<10 phân bào) và mức độ cao ($\ge 10$ phân bào).

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Tiền Thanh Liêm là