MỞ ĐẦU Protein là sản phẩm của gene, đƣợc sử dụng trong nhiều lĩnh vực của đời sống đặc biệt là trong công nghiệp dƣợc phẩm, công nghiệp enzyme, công nghiệp chế biến các sản phẩm nông nghiệp… Protein đƣợc tế bào sinh vật sinh ra tồn tại ở hai dạng chính là protein nội bào (intracellular) và protein ngoại bào (extracellular) tùy theo chức năng của chúng. Protein là một trong những sản phẩm quan trọng trong công nghệ DNA tái tổ hợp, đƣợc biểu hiện trong tế bào chủng chủ cả ở Eucaryote và Procaryote. Ở chủng tái tổ hợp mục tiêu cần đạt là tăng cƣờng quá trình biểu hiện protein đƣợc ở mức độ cao. Tuy nhiên, khi protein ở trong tế bào quá lớn sẽ tạo ra áp lực cho tế bào dẫn đến tế bào bị phá vỡ.
Tăng quá trình tiết protein ngoại bào sẽ giúp giảm áp lực cho tế bào làm tăng khả năng biểu hiện của protein tái tổ hợp. Các protein ngoại bào đƣợc vi sinh vật tiết ra môi tƣờng theo nhiều cơ chế khác nhau và phụ thuộc vào nhiều yếu tố trong đó có vai trò của trình tự peptide tín hiệu. Xây dựng một hệ thống biểu hiện tốt và tăng cƣờng khả năng tiết protein nhằm cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất, các sản phẩm đƣợc tạo ra nhiều hơn, giảm giá thành để có thể ứng dụng trong sản xuất và đời sống đã đƣợc quan tâm nghiên cứu. Amylase là một trong những protein - enzyme tái tổ hợp đầu tiên đƣợc thu nhận.
Thị trƣờng tiêu thụ enzyme thế giới ƣớc tính đạt 1.6 tỷ USD cho các ngành: công nghiệp thực phẩm (29%), thức ăn gia súc (15%) và các ngành công nghiệp khác (56%). Trong đó, amylase chiếm khoảng 30% sản phẩm enzyme trên toàn thế giới. Vai trò ứng dụng của amylase đặc biệt là α-amylase đƣợc biết đến trong rất nhiều ngành công nghiệp nhƣ: thực phẩm, rƣợu - bia, lên men, dệt, tẩy, giấy, dƣợc phẩm và công nghiệp hóa học, lâm sàng, y học và phân tích hóa học… vì vậy nhu cầu về amylase nói chung và α-amylase nói riêng không ngừng tăng lên. Ở vi sinh vật, α-amylase có mặt ở rất nhiều nhóm nhƣ trong vi khuẩn cổ, nấm men, nấm mốc, vi khuẩn…Trong đó, đƣợc quan tâm nhiều nhất là các chủng thuộc nhóm Bacillus vì chúng có khả năng tiết protein trong đó có α-amylase ra ngoài môi trƣờng và có 2 thể đạt đến tới nồng độ cao nên thuận tiện cho việc thu hồi sau lên men.
Hoạt tính của enzyme tiết ra ngoài môi trƣờng nuôi cấy, phụ thuộc vào thời gian cảm ứng, loại peptide tín hiệu và khối lƣợng phân tử của enzyme. Sử dụng kỹ thuật gen để đi sâu nghiên cứu về cấu trúc và cơ chế tiết enzyme ra ngoài môi trƣờng cũng nhƣ tạo đột biến trong trình tự peptide tín hiệu đã tạo đƣợc chủng tái tổ hợp có khả năng tăng cƣờng biểu hiện hoạt tính α–amylase. Với mong muốn xây dựng đƣợc hệ biểu hiện enzyme có hiệu quả ở Bacillus dựa trên sàng lọc các peptide tín hiệu của gen α-amylase từ các chủng thuộc chi Bacillus hoang dại phân lập ở Việt Nam, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Sàng lọc và nghiên cứu ảnh hưởng của đột biến điểm trên peptide tín hiệu đến khả năng tiết α-amylase tái tổ hợp trong Bacillus subtilis” Mục tiêu nghiên cứu: - Có đƣợc cơ sở dự liệu về trình tự peptide tín hiệu của gene α–amylase từ các chủng thuộc chi Bacillus. - Tạo đƣợc hệ biểu hiện mang trình tự peptide tín hiệu đột biến làm tăng khả năng tiết α-amylase ngoại bào ở chủng Bacillus tái tổ hợp.
Nội dung luận án: - Phân lập tuyển chọn các chủng Bacillus có khả năng sinh α-amylase ngoại bào cao. - Tách các trình tự peptide tín hiệu của gen α-amylase từ chủng chọn lọc - Gây đột biến hoặc thay thế các peptide tín hiệu đã đƣợc đột biến định hƣớng - Tạo các chủng tái tổ hợp với các peptide tín hiệu đột biến và sàng lọc các chủng có khả năng tiết α-amylase cao. - Nghiên cứu điều kiện biểu hiện α-amylase của chủng tái tổ hợp thu đƣợc. Những đóng góp mới của luận án - Đã xác định đƣợc dữ liệu khoa học về peptide tín hiệu của gen α --amylase từ 3 chủng điển hình trong số 130 chủng Bacillus phân lập tại Việt Nam.
- Tạo đƣợc các đột biến điểm và xác định đƣợc đột biến A31V giúp tăng cƣờng tiết α - amylase trong Bacillus subtilis. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. QUÁ TRÌNH TIẾT PROTEIN Ở TẾ BÀO VI SINH VẬT 1. Quá trình tiết protein ở tế bào Eucaryotes Các preprotein hình thành trong nấm men ít nhất có hai con đƣờng vận chuyển một đƣờng qua SRP trung gian và một con đƣờng độc lập khác.
Vận chuyển protein qua SRP trung gian vẫn chƣa đƣợc mô tả rõ ràng nhƣng phức hợp vận chuyển protein của S. cerevisiae xuất hiện 5 polypeptide khác nhau: Sec61, Sec62, Sec63, và 2 protein phát hiện thêm gần đây. Protein Sec61 có một số trình tự kỵ nƣớc liên kết với ER và liên kết trực tiếp với protein tiết trong quá trình vận chuyển, tƣơng tự nhƣ TRAM trong tế bào động vật có vú nhƣng trình tự của Sec61 không có bất kỳ điểm tƣơng đồng nào với TRAM mà chúng lại có một số điểm tƣơng đồng với protein SecY ở E. Trong suốt hoặc ngay sau khi vận chuyển protein trong tế bào động vật có vú và trong S.
cerevisiae, các peptide tín hiệu đƣợc loại bởi SPase. Hai phức hợp chuỗi các enzyme phân cắt tín hiệu (SPase) của động vật có vú và nấm men có tƣơng đồng với Sec11 (YaDeau et al. Trong khoang lƣới nội chất của ER của cả tế bào nấm men và động vật có vú đều có BiP (Binding immunoglobulin protein), một loại protein đóng vai trò quan trọng trong quá trình gấp cuộn của các protein tiết. cerevisiae (Kar2) tƣơng tác với protein trong bƣớc sớm quá trình vận chuyển protein qua màng.
BiP rất cần thiết cho sự sinh trƣởng của tế bào nấm men (Simonen & Palva, 1993) 1. Quá trình tiết protein ở E. coli, khoảng 50% protein của tế bào đƣợc tiết ra ngoài môi trƣờng với hơn 90% protein đƣợc vận chuyển thông qua Sec/P (Low et al. Các SP đƣợc cho là hỗ trợ liên kết với các nhân tố tham gia quá trình tiết nhƣ: SecB, GroEL, DnaK và DnaJ và trong đó SecB đóng vai trò là nhân tố chính.
Liên kết của SecB ngăn preprotein gấp cuộn khi chƣa thể hiện chức năng. GroEL, DnaK, và 4 DnaJ còn có một số chức năng khác trong tế bào E. coli ngoài vai trò trong quá trình tiết protein. Phức hợp preprotein với các nhân tố tiết đƣợc vận chuyển đến màng tế bào bởi ái lực của SecA với SP và SecB.
SecA là protein màng ngoại vi và có ái lực đối với với phần protein trƣởng thành của preprotein (Simonen & Palva, 1993). Ngoài chức năng vận chuyển, SecA còn tham gia liên kết và thủy phân ATP nhằm cung cấp năng lƣợng cho quá trình chuyển vận qua màng. Một số protein trên màng SecY, SecE cùng với SecA hình thành nên hệ vận chuyển ở E. Chuỗi polypeptide có thể trƣợt qua màng tế bào trên bề mặt của phức hợp SecY/E.
Phần xúc tác của các enzyme phân cắt peptide tín hiệu nằm ở phía bào chất và quá trình phân cắt SP có thể xảy ra trong hoặc ngay sau quá trình vận chuyển. Chức năng của 2 protein SecD và SecF trên màng chƣa đƣợc biết rõ, tuy nhiên chúng có thể đóng vai trò trong việc hỗ trợ quá trình gấp cuộn của protein khi mới đƣợc vận chuyển lên periplasmic tƣơng tự với protein BiP của động vật có vú và của tế bào nấm men (Simonen & Palva, 1993). Quá trình tiết protein trong Bacillus 1. Các con đường vận chuyển protein trong Bacillus Quá trình tiết protein ở Bacillus là hệ thống tiết protein của vi khuẩn đầu tiên đƣợc nghiên cứu.
Bacillus là vi khuẩn G+ nên có cơ chế tiết điển hình đƣợc biết đến là khác so với E. cerevisiae và động vật có vú. Tế bào của Bacillus đƣợc bao quanh bởi màng tế bào chất, đƣợc bao phủ bởi một thành tế bào dày (10 đến 50 nm) bao gồm chủ yếu là các chuỗi peptidoglycan và teichoic hoặc teichuronic acid (Chu H. Theo Tjalsma et al., 2004; Fu et al., 2007, bốn con đƣờng tiết protein đƣợc biết có mặt trong vi khuẩn Gram âm và Gram dƣơng đó là: Sec-SRP, Tat, qua nhân tố vận chuyển ATP binding cassette (ABC- transporter) và con đƣờng Pseudopillin (Com pathway).
Các SP của Bacillus đã có rất nhiều công trình công bố (Kolkman et al., 2008; Igarashi et al., 1998; Borchert & Nagarajan, 1991a; Heng et al., 2005b; Low et al., 2012; Tjalsma et al., 2000a; Jonet et al., 2012; Sakakibara et al. Các con đƣờng tiết protein trong Bacillus cũng nhƣ các enzym phân 5 cắt tín hiệu tham gia trong các con đƣờng này đƣợc thể hiện trên Hình 1.1, Cơ chế tiết đƣợc thể hiện trên hình 1. Các con đƣờng tiết protein của vi khuẩn (Nguồn: Tjalsma et al., 2000a, 2004) Trong Sec/P, ribosome liên kết với đầu N của SP nhờ Ffh protein. Protein Ffh, Hbsu và scRNA là các hợp phần trong phức hợp SRP (signal recognition particle) tham gia trong quá trình vận chuyển, sau đó phức hợp SRP-precusor sẽ tƣơng tác với SecA nhờ các liên kết với SP.
Cụm liên kết SRP – Precusor – SecA đƣợc đƣa tới vị trí màng tế bào và tƣơng tác với các yếu tố protein vận chuyển trên màng SecYEG, SecE, SecG và các protein hỗ trợ SecDF, SpoIIIJ và YqjG. Sau đó, SP sẽ đƣợc phân cắt bởi một enzyme trên màng là SPase I (SipS-W), Precusor protein đƣợc đƣa ra qua các Sec-pore bởi SecA chủ yếu nhờ vào nguồn năng lƣợng 6 ATP và các điện tử trên kênh dẫn truyền. Đoạn SP bị phân cắt bởi 2 SPase là SppA và TepA, các exoprotein sẽ đƣợc vận chuyển qua màng tế bào do đó nó đƣợc điều khiển bởi WprA, một protease trên màng tế bào và đƣợc tăng cƣờng tạo ra nhờ xúc tác của PrsA, một lipoprotein trên màng tế bào. BdbB và BdbC là các protein tham gia giúp cho việc hình thành các cầu nối disulfide (prophage-derived disulfide bond formation protein) trong quá trình hình thành cấu trúc protein.
Một số protease ở thành tế bào tích điện âm chính vì vậy các ion Ca2+ và Fe3+ rất cần thiết cho việc ổn định hoạt tính của một số exoprotein.Sơ đồ cơ chế tiết protein ngoại bào theo Sec/P ở B. Đích vận chuyển protein trong Bacillus Cấu trúc của lớp màng tế bào của Bacilli không có lớp màng ngoài (OM - Outer membrane) cho nên sau khi tổng hợp các protein có thể đƣợc giữ lại trong tế 7 bào chất hoặc vận chuyển vào CM hoặc chúng sẽ đƣợc vận chuyển qua CM vào thành tế bào, sau đó protein có thể vẫn giữ trên thành hoặc tiết ra môi trƣờng nuôi cấy (Tjalsma et al.
