Luận án tiến sĩ sàng lọc và nghiên cứu ảnh hưởng của đột biến điểm trên peptide tín hiệu đến khả năng tiết αamylase tái tổ hợp trong bacillus subtilis

Nghiên cứu đột biến điểm trên peptide tín hiệu ảnh hưởng đến tiết α-amylase tái tổ hợp trong Bacillus subtilis, phân tích tác động và hiệu quả.

• Tác giả: Nguyễn Thị Đà
• Người hướng dẫn: PGS. Trần Đình Mấn
• Trường học: Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Viện Công nghệ Sinh học
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Sàng lọc và nghiên cứu ảnh hưởng của đột biến điểm trên peptide tín hiệu đến khả năng tiết α-amylase tái tổ hợp trong Bacillus subtilis
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• Lời cảm ơn
• Lời cam đoan
• DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. QUÁ TRÌNH TIẾT PROTEIN Ở TẾ BÀO VI SINH VẬT
• 1.1.1. Quá trình tiết protein ở tế bào Eucaryotes
• 1.1.2. Quá trình tiết protein ở E. coli
• 1.1.3. Quá trình tiết protein trong Bacillus
• 1.1.4. Enzyme phân cắt peptide tín hiệu của Sec/P
• 1.2. HỆ BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP Ở VI SINH VẬT
• 1.2.1. Vai trò của Bacillus trong công nghiệp sản xuất enzyme
• 1.2.2. Hệ thống biểu hiện ở Bacillus
• 1.2.3. Đặc điểm di truyền của Bacillus subtilis
• 1.2.4. Hệ biểu hiện ở E. coli và vi sinh vật khác
• 1.3. CÁC YẾU TỐ LIÊN QUAN ĐẾN BIỂU HIỆN GEN Ở Bacillus subtilis
• 1.3.1. Lựa chọn promoter
• 1.3.2. Các vector biểu hiện ở Bacillus subtilis
• 1.3.3. Chọn trình tự peptide tín hiệu
• 1.3.4. Đột biến peptide tín hiệu
• 1.3.5. Sử dụng chủng chủ đã được cải biến di truyền
• 1.3.6. Cấu trúc của α – amylase
• 1.3.7. α-Amylase từ Bacillus
• 1.3.8. α-Amylase từ các vi sinh vật khác
• 1.3.9. α-Amylase tái tổ hợp trong vi sinh vật
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. CHỦNG VI SINH VẬT VÀ PLASMID
• 2.1.1. Chủng chủ dùng trong nghiên cứu
• 2.2. MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VÀ CÁC CHẤT BỔ SUNG
• 2.2.1. Môi trường nuôi cấy
• 2.2.2. Chất bổ sung
• 2.3. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ
• 2.3.1. Hóa chất và Kit
• 2.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.4.1. Phân lập chủng
• 2.4.2. Phương pháp xác định hoạt tính α – amylase
• 2.4.3. Phương pháp xác định hàm lượng protein hòa tan theo Lowry
• 2.4.4. Phương pháp thu amylase trong tế bào
• 2.4.5. Phương pháp phân loại chủng chọn lọc
• 2.4.6. Phương pháp tách chiết DNA
• 2.4.7. Biến nạp DNA plasmid vào chủng chủ
• 2.4.8. Kỹ thuật PCR
• 2.4.9. Cắt enzyme giới hạn và ligation DNA
• 2.4.10. Phản ứng loại đầu 5’ - Phosphat (Dephosphorylation)
• 2.4.11. Phân lập đoạn gen mã hóa peptide tín hiệu
• 2.4.12. Phương pháp megaprimer
• 2.4.13. Phương pháp tinh sạch DNA từ gel agarose
• 2.4.14. Phương pháp điện di DNA
• 2.4.15. Nghiên cứu điều kiện thu nhận α-amylase của chủng tái tổ hợp
• 2.4.16. Điện di SDS – PAGE
• 2.4.17. Xác định hoạt tính α – amylase trên gel polyacrylamid
• 2.4.18. Xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS CÓ KHẢ NĂNG TIẾT ALPHA AMYLASE MẠNH RA MÔI TRƯỜNG
• 3.1.1. Phân lập và tuyển chọn sơ bộ các chủng Bacillus có hoạt tính amylase
• 3.1.2. Sàng lọc bộ chủng phân lập thu các chủng thuộc chi Bacillus có hoạt tính amylase cao
• 3.1.3. Nghiên cứu đặc điểm phân loại của các chủng
• 3.2. PHÂN LẬP CÁC ĐOẠN GEN MÃ HÓA CHO TRÌNH TỰ PEPTIDE TÍN HIỆU CỦA ALPHA AMYLASE TỪ CÁC CHỦNG CHỌN LỌC
• 3.3. SÀNG LỌC THU PEPTIDE TÍN HIỆU MẠNH CỦA GEN α - AMYLASE
• 3.3.1. Tách các peptide tín hiệu và tạo tổ hợp với gen đích
• 3.3.2. Tạo vector mang tổ hợp gen đích
• 3.3.3. Đánh giá khả năng tiết của các tổ hợp gen đích trong chủng chủ B. subtilis
• 3.4. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG TIẾT AMYLASE CỦA CÁC CHỦNG TÁI TỔ HỢP MANG VECTOR BIỂU HIỆN CÓ CÁC PEPTIDE TÍN HIỆU ĐỘT BIẾN ĐƯỢC THIẾT KẾ
• 3.5. NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN ALPHA AMYLASE CỦA CHỦNG TÁI TỔ HỢP
• 3.5.1. Xác định động thái sinh trưởng và sinh tổng hợp α - amylase của chủng 168MpHVC1
• 3.5.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng và sinh amylase của chủng 168MpHVC1
• 3.5.3. Ảnh hưởng của nồng độ IPTG lên khả năng tiết amylase của chủng 168MpHVC1
• 3.5.4. Ảnh hưởng của nguồn N, C lên khả năng sinh trưởng và sinh amylase của chủng 168MpHVC1
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ
• 4.1. QUÁ TRÌNH TIẾT PROTEIN
• 4.1.1. Phân lập và thu các chủng tuyển chọn có hoạt tính α – amylase
• 4.1.2. Protein ngoại bào và hoạt tính α – amylase của các chủng tuyển chọn
• 4.1.3. Tách dòng các peptide tín hiệu ở Bacillus và đánh giá vai trò của các axit amin trong trình tự này với quá trình tiết protein
• 4.2. KHẢ NĂNG BIỂU HIỆN α–AMYLASE VỚI CÁC PROMOTER KHÁC NHAU
• 4.3. SÀNG LỌC CÁC PEPTIDE TÍN HIỆU VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG BIỂU HIỆN TRONG B. SUBTILIS
• 4.4. NGHIÊN CỨU TẠO MỘT SỐ ĐỘT BIẾN TRÊN PEPTIDE TÍN HIỆU VÀ ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG TIẾT PROTEIN ĐÍCH CỦA CHÚNG
• 4.5. NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY TĂNG TIẾT ENZYME
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• NHỮNG CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ TRONG THỜI GIAN THỰC HIỆN LUẬN ÁN
• TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu

Nghiên cứu tập trung vào ảnh hưởng của đột biến điểm trên peptide tín hiệu đến khả năng tiết α-amylase trong Bacillus subtilis. Peptide tín hiệu đóng vai trò quan trọng trong quá trình tiết protein ngoại bào, đặc biệt là enzyme α-amylase, một enzyme có ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp. Bacillus subtilis được chọn làm mô hình nghiên cứu do khả năng tiết protein cao và an toàn sinh học. Mục tiêu chính của nghiên cứu là tối ưu hóa quá trình tiết α-amylase thông qua việc đột biến peptide tín hiệu, từ đó nâng cao hiệu suất sản xuất enzyme.

1.1. Vai trò của peptide tín hiệu

Peptide tín hiệu là trình tự amino acid ngắn ở đầu N của protein, giúp định hướng protein đến màng tế bào để tiết ra ngoài. Trong Bacillus subtilis, peptide tín hiệu liên kết với các yếu tố vận chuyển như SecA và SRP để thực hiện quá trình tiết. Nghiên cứu đột biến điểm trên peptide tín hiệu nhằm tăng cường hiệu quả của quá trình này, từ đó cải thiện khả năng tiết α-amylase.

1.2. Ứng dụng của α amylase

α-Amylase là enzyme thủy phân tinh bột, được sử dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp như thực phẩm, dệt may, và dược phẩm. Việc tối ưu hóa quá trình tiết α-amylase từ Bacillus subtilis không chỉ giảm chi phí sản xuất mà còn tăng hiệu suất thu hồi enzyme, mang lại lợi ích kinh tế đáng kể.

II. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để tạo đột biến điểm trên peptide tín hiệu của gen mã hóa α-amylase. Các chủng Bacillus subtilis tái tổ hợp được tạo ra và đánh giá khả năng tiết enzyme. Quá trình nghiên cứu bao gồm phân lập chủng, tách dòng gen, tạo đột biến, và đánh giá hoạt tính enzyme.

2.1. Phân lập và tuyển chọn chủng

Các chủng Bacillus có khả năng tiết α-amylase cao được phân lập từ môi trường tự nhiên. Quá trình tuyển chọn dựa trên hoạt tính enzyme và đặc điểm di truyền. Các chủng được chọn sẽ là nguồn gen để tạo peptide tín hiệu đột biến.

2.2. Tạo đột biến điểm

Kỹ thuật megaprimer được sử dụng để tạo đột biến điểm trên peptide tín hiệu. Các đột biến được thiết kế để tăng cường khả năng liên kết với các yếu tố vận chuyển như SecA và SRP, từ đó cải thiện quá trình tiết α-amylase.

III. Kết quả và thảo luận

Nghiên cứu đã xác định được các đột biến điểm trên peptide tín hiệu giúp tăng cường khả năng tiết α-amylase trong Bacillus subtilis. Đột biến A31V được chứng minh là có hiệu quả cao nhất, làm tăng đáng kể hoạt tính enzyme tiết ra ngoài môi trường.

3.1. Đánh giá khả năng tiết enzyme

Các chủng tái tổ hợp mang peptide tín hiệu đột biến được đánh giá về khả năng tiết α-amylase. Kết quả cho thấy, đột biến A31V làm tăng hoạt tính enzyme lên đến 30% so với chủng không đột biến, chứng tỏ hiệu quả của việc tối ưu hóa peptide tín hiệu.

3.2. Ứng dụng thực tiễn

Nghiên cứu này có tiềm năng ứng dụng cao trong công nghiệp sản xuất enzyme. Việc tăng cường khả năng tiết α-amylase từ Bacillus subtilis giúp giảm chi phí sản xuất và tăng hiệu suất thu hồi enzyme, mang lại lợi ích kinh tế đáng kể.

IV. Kết luận và kiến nghị

Nghiên cứu đã thành công trong việc tạo đột biến điểm trên peptide tín hiệu để tăng cường khả năng tiết α-amylase trong Bacillus subtilis. Đột biến A31V được xác định là có hiệu quả cao nhất. Kết quả nghiên cứu mở ra hướng ứng dụng mới trong công nghiệp sản xuất enzyme, đặc biệt là α-amylase.

4.1. Hướng nghiên cứu tiếp theo

Cần tiếp tục nghiên cứu để tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy và biểu hiện enzyme. Ngoài ra, việc mở rộng nghiên cứu trên các loại enzyme khác cũng là hướng đi tiềm năng.

4.2. Ứng dụng công nghiệp

Kết quả nghiên cứu có thể được áp dụng trực tiếp trong các nhà máy sản xuất enzyme, giúp giảm chi phí và tăng hiệu suất sản xuất, đặc biệt trong các ngành công nghiệp thực phẩm và dệt may.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Trong bối cảnh thị trường enzyme công nghiệp toàn cầu ước tính đạt 1,6 tỷ USD (năm 2004) với amylase chiếm khoảng 30% tổng sản lượng enzyme, nhu cầu tối ưu hóa hệ biểu hiện protein tái tổ hợp ngày càng trở nên cấp thiết. Nghiên cứu của NCS. Nguyễn Thị Đà tại Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam tiếp cận một research gap cốt lõi: trong khi các nghiên cứu quốc tế đã công bố về vai trò của signal peptide (SP) đối với quá trình tiết enzyme, chưa có công trình nào hệ thống hóa dữ liệu về SP của gen α-amylase từ các chủng Bacillus hoang dại phân lập đặc hữu tại Việt Nam và đánh giá tác động của đột biến điểm lên hiệu suất tiết trong chủng chủ B. subtilis tái tổ hợp.

Research questions của luận án được xác định như sau: (RQ1) Trình tự SP của gen α-amylase từ các chủng Bacillus bản địa Việt Nam có đặc điểm cấu trúc như thế nào và SP nào có hiệu quả tiết vượt trội? (RQ2) Đột biến điểm tại vị trí nào trên SP sẽ làm tăng đáng kể khả năng tiết α-amylase ngoại bào trong B. subtilis tái tổ hợp? (RQ3) Điều kiện nuôi cấy tối ưu nào cho phép tối đa hóa sản lượng enzyme từ chủng tái tổ hợp tốt nhất?

Khung lý thuyết vận dụng học thuyết tiết protein theo Sec/P (Secretory Pathway) của Tjalsma và cộng sự (2000, 2004), kết hợp với mô hình cấu trúc ba vùng SP (N-region, H-region, C-region) theo van Roosmalen et al. (2004) và nguyên lý đột biến điểm định hướng (site-directed mutagenesis - SDM) theo Borchert & Nagarajan (1991). Phạm vi nghiên cứu bao gồm 130 chủng Bacillus phân lập từ mẫu đất thu thập tại nhiều địa điểm trên lãnh thổ Việt Nam, với trọng tâm là 3 chủng điển hình mang SP có hoạt tính cao nhất.

---

Literature Review và Positioning

Các dòng nghiên cứu chính

Nghiên cứu về hệ biểu hiện protein tái tổ hợp trong Bacillus subtilis có thể phân thành ba dòng chính trong tài liệu quốc tế. Dòng thứ nhất tập trung vào tối ưu hóa promoter: Phan et al. (2012) và Vavrová et al. chứng minh promoter Pgrac (182 bp, dựa trên operon groESL có σA) cho mức biểu hiện protein vượt trội so với Pspac khi cảm ứng bằng IPTG. Dòng thứ hai nghiên cứu sàng lọc và kỹ thuật SP: Brockmeier et al. (2006), Eggert et al. và Jonet et al. (2012) đồng thuận rằng mức tiết protein tái tổ hợp phụ thuộc trực tiếp vào loại SP được gắn với gen đích — một phát hiện đặt nền móng cho hướng nghiên cứu sàng lọc SP. Dòng thứ ba khai thác đột biến SP: Borchert & Nagarajan (1991a) sử dụng levansucrase của B. amyloliquefaciens làm mô hình, Caspers et al. (2010a, 2010b) và Ismail et al. (2011) mở rộng sang các enzyme công nghiệp, Han et al. nghiên cứu tác động đột biến lên từng vùng SP.

Tranh luận đối lập trong tài liệu

Tồn tại hai quan điểm đối lập đáng chú ý. Quan điểm thứ nhất (Gennity et al., 1990; Chen & Nagarajan, 1994) khẳng định điện tích dương ở vùng N là điều kiện cần thiết cho quá trình tiết; điện tích bằng không hoặc âm làm giảm bài tiết protein. Quan điểm đối lập từ Brockmeier et al. (2006b) cho thấy sự hiện diện của điện tích dương không hoàn toàn bắt buộc — "một preprotein không mang điện tích dương vẫn được nhận biết bởi bộ máy vận chuyển, tuy nhiên chúng sẽ được tiết rất chậm." Luận án này định vị nghiên cứu tại giao điểm của hai quan điểm, cung cấp bằng chứng thực nghiệm từ hệ SP Bacillus bản địa để làm sáng tỏ tranh luận trong bối cảnh sinh thái đặc thù.

So sánh với nghiên cứu quốc tế

So sánh với nghiên cứu của Yang et al. tại Trung Quốc — biểu hiện α-amylase kiềm của B. alcalophilus JN21 trong B. subtilis W600 đạt 415 U/ml (lên men 3 lít: 441 U/ml, cao hơn 79 lần chủng gốc) — và nghiên cứu của Bukhari & Rehman (2015) phân lập B. subtilis 10-R sinh α-amylase hoạt động ở dải 25–80°C, nghiên cứu Việt Nam cung cấp góc nhìn bổ sung: thay vì tối ưu hóa điều kiện lên men, nghiên cứu này can thiệp vào cấp độ phân tử qua đột biến SP để nâng hiệu suất tiết — một tiếp cận ít được khai thác ở khu vực Đông Nam Á.

---

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

Đóng góp cho lý thuyết

Luận án mở rộng lý thuyết Sec/P secretion pathway (Tjalsma et al., 2000a) theo hai hướng mới. Thứ nhất, xác minh rằng trong bộ gen SP của các chủng Bacillus hoang dại Việt Nam, cấu trúc ba vùng N-H-C với đặc điểm: vùng N (1–5 aa, chứa Lys/Arg), vùng H (~19 aa, cấu trúc xoắn α với Gly/Pro tại điểm bẻ gãy), và vùng C (3–7 aa, chứa motif Ala-X-Ala tại vị trí -1 và -3) được bảo thủ cao trong quần thể phân lập tại Việt Nam — phù hợp với mô hình lý thuyết của Dalbey & Von Heijne (2002) nhưng có sai biệt địa phương cụ thể về tần suất axit amin. Thứ hai, phát hiện đột biến A31V tại vùng C của SP — thay thế Alanine bằng Valine tại vị trí 31 — cải thiện đáng kể hiệu suất tiết α-amylase, cung cấp bằng chứng thực nghiệm mới về vai trò của vị trí -3 trong nhận biết SPase, bổ sung vào lý thuyết AXA rule của Nielsen et al. (1997a).

Khung phân tích tích hợp

Khung phân tích tích hợp ba lý thuyết: (1) Lý thuyết Sec/P secretion (Tjalsma et al., 2000); (2) Signal peptide tripartite structure theory (van Roosmalen et al., 2004); (3) Site-directed mutagenesis framework (Borchert & Nagarajan, 1991). Tiếp cận phân tích mới là kết hợp in silico (BLAST, SignalP) với in vitro (megaprimer PCR, SDS-PAGE) và in vivo (biểu hiện trong B. subtilis 168M) trong một pipeline liên tục từ sàng lọc chủng đến tối ưu hóa điều kiện biểu hiện.

Boundary conditions được xác định rõ: kết quả áp dụng cho SP của gen α-amylase trong hệ biểu hiện Sec/P của B. subtilis 168M; không trực tiếp áp dụng cho con đường tiết Tat/P, ABC transporter, hoặc các chủng chủ khác như E. coli hay nấm men.

---

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu áp dụng triết học thực chứng (positivism) với thiết kế thực nghiệm thuần túy, kết hợp phương pháp phân tích định lượng (đo hoạt tính enzyme, điện di SDS-PAGE) và định tính (phân loại hình thái, phân tích cây phát sinh loài). Thiết kế đa giai đoạn gồm: giai đoạn I (sàng lọc chủng), giai đoạn II (tách dòng và đánh giá SP), giai đoạn III (tạo đột biến và sàng lọc), giai đoạn IV (tối ưu hóa điều kiện biểu hiện).

Quy mô mẫu: Từ 130 chủng Bacillus phân lập ban đầu từ nhiều mẫu đất trên toàn quốc, sàng lọc xuống còn 3 chủng điển hình (DA23, D5-2, CN1-5) mang SP α-amylase có hoạt tính cao nhất. Tiêu chí lựa chọn bao gồm: hoạt tính amylase trên môi trường LB tinh bột, xác nhận phân loại bằng giải trình tự gen 16S rRNA và xây dựng cây phát sinh loài.

Quy trình nghiên cứu rigorous

Phương pháp megaprimer được sử dụng để tạo tổ hợp gen giữa SP quan tâm và gen trưởng thành (mature gene) của α-amylase chủng 3BT2 (B. licheniformis), sau đó clone vào vector biểu hiện pHV33 mang promoter Pgrac. Chiến lược triangulation phương pháp bao gồm: (a) Phân tích in silico điểm phân cắt SPase bằng công cụ SignalP; (b) Xác nhận in vitro bằng điện di SDS-PAGE và đo hoạt tính theo phương pháp Lowry; (c) Xác nhận in vivo trong chủng chủ B. subtilis 168M.

Đột biến điểm được tạo bằng phương pháp SDM (site-directed mutagenesis) với thiết kế đột biến dựa trên phân tích cấu trúc ba vùng SP: (i) đột biến thay đổi điện tích vùng N; (ii) đột biến tăng/giảm kỵ nước vùng H; (iii) đột biến tại vị trí nhận biết phân cắt SPase ở vùng C. Kết quả chủng tái tổ hợp 168MpHVC1 mang SP đột biến A31V được chọn làm đối tượng tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy.

Validity: Sử dụng kháng sinh chọn lọc và cắt kiểm tra enzyme giới hạn (BamHI, XbaI) để xác nhận cấu trúc plasmid; Reliability: Mỗi thí nghiệm lặp lại ít nhất 3 lần; hoạt tính enzyme được chuẩn hóa theo hàm lượng protein tổng số xác định bằng phương pháp Lowry với BSA làm chuẩn.

Phân tích dữ liệu

Phần mềm BLAST (NCBI) phân tích tương đồng trình tự; điện di SDS-PAGE với thuốc nhuộm Coomassie Blue; xác định hoạt tính α-amylase trên gel polyacrylamid; cảm ứng biểu hiện bằng IPTG ở các nồng độ khảo sát; đánh giá ảnh hưởng của nguồn C (tinh bột, glucose, sucrose) và nguồn N lên sinh trưởng và sinh tổng hợp amylase. Phân tích thống kê xử lý số liệu bằng phần mềm thống kê sinh học chuẩn.

---

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

Phát hiện 1: Từ 130 chủng Bacillus phân lập tại Việt Nam, sàng lọc xác định được 3 chủng điển hình (DA23, D5-2, CN1-5) với hoạt tính α-amylase ngoại bào vượt trội trên môi trường LB tinh bột. Phân tích 16S rRNA xây dựng cây phát sinh loài xác nhận phân loại và tính đặc hữu của các chủng này trong quần thể vi khuẩn đất Việt Nam.

Phát hiện 2: Ba SP của các chủng DA23, D5-2 và CN1-5 được tách dòng thành công và phân tích so sánh trình tự nucleotide lẫn protein cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa giữa các SP, đặc biệt tại điểm phân cắt SPase. Phân tích điểm phân cắt xác nhận motif Ala-X-Ala tại vị trí -1/-3 theo đúng dự đoán lý thuyết (Dalbey & Von Heijne, 2002), với tỷ lệ 71% A-X-A và 18% V-X-A như mô tả trong tài liệu.

Phát hiện 3: Sàng lọc khả năng tiết của các tổ hợp SP-gen đích trong chủng chủ B. subtilis 168M cho thấy SP từ chủng D5-2 (chủng 168MSusigD52) có khả năng tiết α-amylase vượt trội so với hai SP còn lại, khẳng định kết luận của Eggert et al. và Brockmeier (2006): "mức độ tiết protein tái tổ hợp quan tâm phụ thuộc vào loại SP mà gen đó được gắn."

Phát hiện 4 — đột phá chính: Đột biến điểm A31V trên SP — thay thế Alanine bằng Valine tại vị trí 31 thuộc vùng C gần điểm phân cắt SPase — làm tăng đáng kể khả năng tiết α-amylase ngoại bào trong B. subtilis 168M so với SP tự nhiên. Đây là kết quả đột phá, cung cấp bằng chứng trực tiếp về vai trò của axit amin tại vùng C trong động học phân cắt SPase, bổ sung vào lý thuyết về tính linh hoạt của vị trí -3 (Tjalsma et al., 2000a).

Phát hiện 5: Tối ưu hóa điều kiện biểu hiện của chủng 168MpHVC1 xác định: nhiệt độ nuôi cấy tối ưu, nồng độ IPTG cảm ứng tối ưu, nguồn C và N thích hợp nhất cho sản xuất α-amylase, cung cấp quy trình nuôi cấy hoàn chỉnh có thể áp dụng trực tiếp vào sản xuất.

Implications đa chiều

Theoretical advances: Bổ sung dữ liệu thực nghiệm về vai trò vùng C của SP trong Sec/P (lý thuyết Tjalsma et al., 2000) và cung cấp bằng chứng mới cho lý thuyết AXA rule (Nielsen et al., 1997a). Kết quả cũng hỗ trợ quan điểm của Brockmeier et al. (2006b) rằng cấu trúc vùng H cần duy trì liên tục, không gián đoạn để đảm bảo tiết hiệu quả.

Methodological innovations: Pipeline tích hợp (sàng lọc → tách dòng SP → megaprimer PCR → SDM → biểu hiện → tối ưu hóa) có thể được áp dụng cho bất kỳ enzyme nào cần tăng cường tiết trong Bacillus. Phương pháp này khả thi trong điều kiện phòng thí nghiệm tiêu chuẩn tại các nước đang phát triển.

Practical applications: Chủng tái tổ hợp 168MpHVC1 có tiềm năng ứng dụng trực tiếp trong sản xuất α-amylase bền nhiệt phục vụ ngành dệt (đề tài mã số CNSHCB/2010-5), chế biến tinh bột, và công nghiệp thực phẩm.

Policy recommendations: Kết quả ủng hộ chiến lược đầu tư vào sàng lọc nguồn gen vi sinh vật bản địa Việt Nam như một tài nguyên sinh học có giá trị thay vì phụ thuộc vào chủng vi sinh vật nhập khẩu.

---

Limitations và Future Research

Nghiên cứu thừa nhận bốn hạn chế chính. Thứ nhất, quy mô nghiên cứu dừng ở 130 chủng phân lập từ mẫu đất — chưa khai thác các hệ sinh thái đặc biệt như suối nước nóng hay môi trường biển nơi Trần Đình Mấn và cs. (2004, 2011) đã tìm thấy các chủng Bacillus sinh α-amylase bền nhiệt đặc sắc. Thứ hai, nghiên cứu chỉ đánh giá đột biến điểm đơn lẻ (A31V); tác động của đột biến kép hoặc tổ hợp đột biến chưa được khảo sát. Thứ ba, điều kiện nuôi cấy được tối ưu ở quy mô bình lắc phòng thí nghiệm — cần scale-up ở bioreactor để xác nhận tính ổn định công nghiệp. Thứ tư, cơ chế phân tử của việc A31V cải thiện nhận biết SPase chưa được làm rõ bằng phương pháp cấu trúc học (crystallography hoặc cryo-EM).

Chương trình nghiên cứu tương lai đề xuất 5 hướng: (1) Khảo sát đột biến bão hòa (saturation mutagenesis) tại toàn bộ vùng C để lập bản đồ đầy đủ các vị trí tăng cường tiết; (2) Áp dụng pipeline SP-screening cho các enzyme công nghiệp khác (protease, lipase, xylanase); (3) Nghiên cứu sử dụng chủng chủ cải biến B. subtilis W800 (đã xóa 8 gen protease) để giảm thiểu proteolysis protein tái tổ hợp; (4) Tích hợp tối ưu hóa SP với tối ưu hóa codon (codon optimization) để tăng hiệu suất dịch mã; (5) Lên men fed-batch quy mô pilot (50–200 lít) để xác nhận khả năng thương mại hóa.

---

Tác động và ảnh hưởng

Academic impact: Nghiên cứu đóng góp vào ngân hàng dữ liệu SP của gen α-amylase từ Bacillus Việt Nam — một khoảng trống rõ ràng trong tài liệu khoa học khu vực Đông Nam Á. Kết quả dự kiến được trích dẫn trong các nghiên cứu về protein secretion engineering tại các phòng thí nghiệm trong nước và quốc tế.

Industry transformation: Kết quả trực tiếp phục vụ hai ngành: (a) Ngành dệt — α-amylase bền nhiệt tái tổ hợp thay thế hóa chất trong quá trình hồ vải; (b) Ngành chế biến tinh bột và thực phẩm — enzyme với hoạt tính cao hơn giúp giảm chi phí sản xuất. Với bối cảnh 50–60% enzyme thương mại toàn cầu được sản xuất từ Bacillus (Gupta et al.), việc cải thiện hệ biểu hiện có tác động kinh tế trực tiếp và đo lường được.

Societal benefits: Giảm phụ thuộc vào enzyme nhập khẩu, phát triển năng lực sản xuất enzyme công nghiệp trong nước, hỗ trợ mục tiêu phát triển công nghiệp sinh học của Đề án Phát triển và Ứng dụng CNSH trong công nghiệp chế biến.

International relevance: Tiếp cận sàng lọc SP từ nguồn gen bản địa có thể được tái hiện tại các quốc gia nhiệt đới khác có đa dạng vi sinh vật đất phong phú chưa được khai thác. Kết quả so sánh thuận lợi với nghiên cứu của Brockmeier et al. (2006) tại Đức và Yang et al. tại Trung Quốc về độ ổn định và mức cải thiện tiết enzyme.

---

Đối tượng hưởng lợi

Nghiên cứu sinh và nhà khoa học: Pipeline phương pháp hoàn chỉnh từ sàng lọc chủng → tách dòng SP → SDM → biểu hiện có thể được tái sử dụng ngay lập tức cho các enzyme công nghiệp khác. Dữ liệu về 3 SP đặc hữu Việt Nam lấp đầy khoảng trống trong cơ sở dữ liệu khu vực.

Học giả cấp cao: Bằng chứng thực nghiệm về đột biến A31V mở ra tranh luận về cơ chế nhận biết SPase tại vùng C, kích thích các nghiên cứu cơ bản về protein translocation. Kết quả bổ sung vào hệ thống lý thuyết Sec/P của Tjalsma et al. với dữ liệu từ quần thể vi sinh vật nhiệt đới.

Doanh nghiệp R&D ngành enzyme: Chủng 168MpHVC1 với điều kiện nuôi cấy được tối ưu hóa sẵn sàng cho thử nghiệm scale-up, cung cấp điểm khởi đầu kỹ thuật rõ ràng. Chi phí sản xuất có thể giảm đáng kể khi enzyme được tiết trực tiếp ra môi trường, loại bỏ bước phá vỡ tế bào tốn kém.

Nhà hoạch định chính sách: Nghiên cứu minh chứng giá trị của đầu tư vào sàng lọc tài nguyên vi sinh vật bản địa theo Đề án Phát triển và Ứng dụng CNSH — mỗi chủng Bacillus phân lập từ đất Việt Nam là tiềm năng công nghiệp chờ được khai thác.

---

Câu hỏi chuyên sâu

1. Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất? Phát hiện đột biến A31V tăng tiết α-amylase mở rộng lý thuyết Sec/P của Tjalsma et al. (2000) bằng cách cung cấp bằng chứng trực tiếp rằng vị trí -3 trong motif AXA của vùng C không chỉ là điểm nhận biết cắt mà còn là điểm điều chỉnh hiệu suất tiết — một sắc thái chưa được phân tích đầy đủ trong tài liệu Bacillus.

2. Innovation về phương pháp? Phương pháp megaprimer tạo tổ hợp SP-mature gene kết hợp với hệ vector pHV33-Pgrac đã được tối ưu cho B. subtilis 168M. So với Borchert & Nagarajan (1991) — sử dụng levansucrase làm mô hình duy nhất — và Caspers et al. (2010) — tập trung vào một số SP đã biết — nghiên cứu này sàng lọc đồng thời từ nguồn gen hoang dại, tích hợp in silico và in vivo trong một quy trình liên tục.

3. Phát hiện bất ngờ nhất? Việc đột biến A31V — một thay đổi bảo thủ (Ala→Val, cùng nhóm kỵ nước nhỏ, không tích điện) tại vùng C — lại có tác động rõ rệt đến hiệu suất tiết. Điều này bất ngờ vì theo lý thuyết của Dalbey & Von Heijne (2002), vị trí -3 thường được thay thế bởi Val, Thr, Leu hoặc Ile với tác động trung tính — nhưng kết quả cho thấy trong context của SP chủng D5-2, thay thế này có lợi đáng kể.

4. Replication protocol? Quy trình được mô tả đầy đủ: danh sách chủng vi sinh vật và plasmid sử dụng, các primer PCR, thành phần megaprimer, điều kiện biến nạp, môi trường nuôi cấy và chất bổ sung — đủ để các phòng thí nghiệm khác tái hiện với chủng chủ B. subtilis 168M tiêu chuẩn.

5. Chương trình nghiên cứu 10 năm? Giai đoạn 2018–2023: hoàn thiện saturation mutagenesis vùng C và xác nhận scale-up bioreactor. Giai đoạn 2023–2028: mở rộng sang sàng lọc SP từ vi sinh vật ưa nhiệt ở suối nước nóng Việt Nam, phát triển nền tảng SP-library quốc gia. Năm 2028 trở đi: tích hợp AI-driven protein engineering để thiết kế SP tổng hợp tối ưu cho từng enzyme đích.

---

Kết luận

Luận án đóng góp 6 thành tựu khoa học cụ thể và có thể đo lường được:

1. Xây dựng cơ sở dữ liệu SP bản địa: Xác định và phân tích đặc điểm trình tự SP của gen α-amylase từ 3 chủng điển hình trong tổng số 130 chủng Bacillus phân lập tại Việt Nam — tài nguyên dữ liệu chưa từng có trong tài liệu khoa học nước nhà.

2. Xác lập đột biến tăng tiết: Xác định đột biến điểm A31V có khả năng tăng cường tiết α-amylase trong B. subtilis tái tổ hợp, đóng góp bằng chứng thực nghiệm mới cho lý thuyết Sec/P (Tjalsma et al., 2000).

3. Tạo hệ biểu hiện hoàn chỉnh: Chủng tái tổ hợp 168MpHVC1 mang vector pHVgrac với SP đột biến A31V và điều kiện biểu hiện được tối ưu hóa — một sản phẩm công nghệ sẵn sàng cho ứng dụng.

4. Phát triển pipeline phương pháp: Quy trình tích hợp từ sàng lọc chủng → phân tích SP → SDM → biểu hiện → tối ưu hóa có thể tái sử dụng cho các enzyme công nghiệp khác trong Bacillus.

5. Mở ra 3 dòng nghiên cứu mới: (a) Sàng lọc SP từ vi sinh vật ưa nhiệt đặc hữu Việt Nam; (b) Đột biến tổ hợp đa vị trí trên SP Bacillus; (c) Thiết kế SP tổng hợp dựa trên dữ liệu bản địa.

6. Đóng góp thực tiễn công nghiệp: Giảm chi phí sản xuất α-amylase phục vụ ngành dệt và chế biến tinh bột trong nước, hỗ trợ mục tiêu tự chủ enzyme công nghiệp theo Đề án phát triển CNSH Việt Nam.

Tiến độ khoa học của nghiên cứu này nằm ở việc dịch chuyển paradigm từ "sử dụng SP có sẵn trong tài liệu quốc tế" sang "khai thác và tối ưu hóa SP từ nguồn gen vi sinh vật đặc hữu bản địa" — một hướng tiếp cận có ý nghĩa chiến lược cho sự phát triển độc lập của công nghiệp enzyme Việt Nam và có thể nhân rộng sang các quốc gia nhiệt đới có đa dạng sinh học vi sinh vật phong phú chưa được khai thác đầy đủ.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Protein là sản phẩm của gene, đƣợc sử dụng trong nhiều lĩnh vực của đời sống đặc biệt là trong công nghiệp dƣợc phẩm, công nghiệp enzyme, công nghiệp chế biến các sản phẩm nông nghiệp… Protein đƣợc tế bào sinh vật sinh ra tồn tại ở hai dạng chính là protein nội bào (intracellular) và protein ngoại bào (extracellular) tùy theo chức năng của chúng. Protein là một trong những sản phẩm quan trọng trong công nghệ DNA tái tổ hợp, đƣợc biểu hiện trong tế bào chủng chủ cả ở Eucaryote và Procaryote. Ở chủng tái tổ hợp mục tiêu cần đạt là tăng cƣờng quá trình biểu hiện protein đƣợc ở mức độ cao. Tuy nhiên, khi protein ở trong tế bào quá lớn sẽ tạo ra áp lực cho tế bào dẫn đến tế bào bị phá vỡ.

Tăng quá trình tiết protein ngoại bào sẽ giúp giảm áp lực cho tế bào làm tăng khả năng biểu hiện của protein tái tổ hợp. Các protein ngoại bào đƣợc vi sinh vật tiết ra môi tƣờng theo nhiều cơ chế khác nhau và phụ thuộc vào nhiều yếu tố trong đó có vai trò của trình tự peptide tín hiệu. Xây dựng một hệ thống biểu hiện tốt và tăng cƣờng khả năng tiết protein nhằm cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất, các sản phẩm đƣợc tạo ra nhiều hơn, giảm giá thành để có thể ứng dụng trong sản xuất và đời sống đã đƣợc quan tâm nghiên cứu. Amylase là một trong những protein - enzyme tái tổ hợp đầu tiên đƣợc thu nhận.

Thị trƣờng tiêu thụ enzyme thế giới ƣớc tính đạt 1.6 tỷ USD cho các ngành: công nghiệp thực phẩm (29%), thức ăn gia súc (15%) và các ngành công nghiệp khác (56%). Trong đó, amylase chiếm khoảng 30% sản phẩm enzyme trên toàn thế giới. Vai trò ứng dụng của amylase đặc biệt là α-amylase đƣợc biết đến trong rất nhiều ngành công nghiệp nhƣ: thực phẩm, rƣợu - bia, lên men, dệt, tẩy, giấy, dƣợc phẩm và công nghiệp hóa học, lâm sàng, y học và phân tích hóa học… vì vậy nhu cầu về amylase nói chung và α-amylase nói riêng không ngừng tăng lên. Ở vi sinh vật, α-amylase có mặt ở rất nhiều nhóm nhƣ trong vi khuẩn cổ, nấm men, nấm mốc, vi khuẩn…Trong đó, đƣợc quan tâm nhiều nhất là các chủng thuộc nhóm Bacillus vì chúng có khả năng tiết protein trong đó có α-amylase ra ngoài môi trƣờng và có 2 thể đạt đến tới nồng độ cao nên thuận tiện cho việc thu hồi sau lên men.

Hoạt tính của enzyme tiết ra ngoài môi trƣờng nuôi cấy, phụ thuộc vào thời gian cảm ứng, loại peptide tín hiệu và khối lƣợng phân tử của enzyme. Sử dụng kỹ thuật gen để đi sâu nghiên cứu về cấu trúc và cơ chế tiết enzyme ra ngoài môi trƣờng cũng nhƣ tạo đột biến trong trình tự peptide tín hiệu đã tạo đƣợc chủng tái tổ hợp có khả năng tăng cƣờng biểu hiện hoạt tính α–amylase. Với mong muốn xây dựng đƣợc hệ biểu hiện enzyme có hiệu quả ở Bacillus dựa trên sàng lọc các peptide tín hiệu của gen α-amylase từ các chủng thuộc chi Bacillus hoang dại phân lập ở Việt Nam, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Sàng lọc và nghiên cứu ảnh hưởng của đột biến điểm trên peptide tín hiệu đến khả năng tiết α-amylase tái tổ hợp trong Bacillus subtilis” Mục tiêu nghiên cứu: - Có đƣợc cơ sở dự liệu về trình tự peptide tín hiệu của gene α–amylase từ các chủng thuộc chi Bacillus. - Tạo đƣợc hệ biểu hiện mang trình tự peptide tín hiệu đột biến làm tăng khả năng tiết α-amylase ngoại bào ở chủng Bacillus tái tổ hợp.

Nội dung luận án: - Phân lập tuyển chọn các chủng Bacillus có khả năng sinh α-amylase ngoại bào cao. - Tách các trình tự peptide tín hiệu của gen α-amylase từ chủng chọn lọc - Gây đột biến hoặc thay thế các peptide tín hiệu đã đƣợc đột biến định hƣớng - Tạo các chủng tái tổ hợp với các peptide tín hiệu đột biến và sàng lọc các chủng có khả năng tiết α-amylase cao. - Nghiên cứu điều kiện biểu hiện α-amylase của chủng tái tổ hợp thu đƣợc. Những đóng góp mới của luận án - Đã xác định đƣợc dữ liệu khoa học về peptide tín hiệu của gen α --amylase từ 3 chủng điển hình trong số 130 chủng Bacillus phân lập tại Việt Nam.

- Tạo đƣợc các đột biến điểm và xác định đƣợc đột biến A31V giúp tăng cƣờng tiết α - amylase trong Bacillus subtilis. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. QUÁ TRÌNH TIẾT PROTEIN Ở TẾ BÀO VI SINH VẬT 1. Quá trình tiết protein ở tế bào Eucaryotes Các preprotein hình thành trong nấm men ít nhất có hai con đƣờng vận chuyển một đƣờng qua SRP trung gian và một con đƣờng độc lập khác.

Vận chuyển protein qua SRP trung gian vẫn chƣa đƣợc mô tả rõ ràng nhƣng phức hợp vận chuyển protein của S. cerevisiae xuất hiện 5 polypeptide khác nhau: Sec61, Sec62, Sec63, và 2 protein phát hiện thêm gần đây. Protein Sec61 có một số trình tự kỵ nƣớc liên kết với ER và liên kết trực tiếp với protein tiết trong quá trình vận chuyển, tƣơng tự nhƣ TRAM trong tế bào động vật có vú nhƣng trình tự của Sec61 không có bất kỳ điểm tƣơng đồng nào với TRAM mà chúng lại có một số điểm tƣơng đồng với protein SecY ở E. Trong suốt hoặc ngay sau khi vận chuyển protein trong tế bào động vật có vú và trong S.

cerevisiae, các peptide tín hiệu đƣợc loại bởi SPase. Hai phức hợp chuỗi các enzyme phân cắt tín hiệu (SPase) của động vật có vú và nấm men có tƣơng đồng với Sec11 (YaDeau et al. Trong khoang lƣới nội chất của ER của cả tế bào nấm men và động vật có vú đều có BiP (Binding immunoglobulin protein), một loại protein đóng vai trò quan trọng trong quá trình gấp cuộn của các protein tiết. cerevisiae (Kar2) tƣơng tác với protein trong bƣớc sớm quá trình vận chuyển protein qua màng.

BiP rất cần thiết cho sự sinh trƣởng của tế bào nấm men (Simonen & Palva, 1993) 1. Quá trình tiết protein ở E. coli, khoảng 50% protein của tế bào đƣợc tiết ra ngoài môi trƣờng với hơn 90% protein đƣợc vận chuyển thông qua Sec/P (Low et al. Các SP đƣợc cho là hỗ trợ liên kết với các nhân tố tham gia quá trình tiết nhƣ: SecB, GroEL, DnaK và DnaJ và trong đó SecB đóng vai trò là nhân tố chính.

Liên kết của SecB ngăn preprotein gấp cuộn khi chƣa thể hiện chức năng. GroEL, DnaK, và 4 DnaJ còn có một số chức năng khác trong tế bào E. coli ngoài vai trò trong quá trình tiết protein. Phức hợp preprotein với các nhân tố tiết đƣợc vận chuyển đến màng tế bào bởi ái lực của SecA với SP và SecB.

SecA là protein màng ngoại vi và có ái lực đối với với phần protein trƣởng thành của preprotein (Simonen & Palva, 1993). Ngoài chức năng vận chuyển, SecA còn tham gia liên kết và thủy phân ATP nhằm cung cấp năng lƣợng cho quá trình chuyển vận qua màng. Một số protein trên màng SecY, SecE cùng với SecA hình thành nên hệ vận chuyển ở E. Chuỗi polypeptide có thể trƣợt qua màng tế bào trên bề mặt của phức hợp SecY/E.

Phần xúc tác của các enzyme phân cắt peptide tín hiệu nằm ở phía bào chất và quá trình phân cắt SP có thể xảy ra trong hoặc ngay sau quá trình vận chuyển. Chức năng của 2 protein SecD và SecF trên màng chƣa đƣợc biết rõ, tuy nhiên chúng có thể đóng vai trò trong việc hỗ trợ quá trình gấp cuộn của protein khi mới đƣợc vận chuyển lên periplasmic tƣơng tự với protein BiP của động vật có vú và của tế bào nấm men (Simonen & Palva, 1993). Quá trình tiết protein trong Bacillus 1. Các con đường vận chuyển protein trong Bacillus Quá trình tiết protein ở Bacillus là hệ thống tiết protein của vi khuẩn đầu tiên đƣợc nghiên cứu.

Bacillus là vi khuẩn G+ nên có cơ chế tiết điển hình đƣợc biết đến là khác so với E. cerevisiae và động vật có vú. Tế bào của Bacillus đƣợc bao quanh bởi màng tế bào chất, đƣợc bao phủ bởi một thành tế bào dày (10 đến 50 nm) bao gồm chủ yếu là các chuỗi peptidoglycan và teichoic hoặc teichuronic acid (Chu H. Theo Tjalsma et al., 2004; Fu et al., 2007, bốn con đƣờng tiết protein đƣợc biết có mặt trong vi khuẩn Gram âm và Gram dƣơng đó là: Sec-SRP, Tat, qua nhân tố vận chuyển ATP binding cassette (ABC- transporter) và con đƣờng Pseudopillin (Com pathway).

Các SP của Bacillus đã có rất nhiều công trình công bố (Kolkman et al., 2008; Igarashi et al., 1998; Borchert & Nagarajan, 1991a; Heng et al., 2005b; Low et al., 2012; Tjalsma et al., 2000a; Jonet et al., 2012; Sakakibara et al. Các con đƣờng tiết protein trong Bacillus cũng nhƣ các enzym phân 5 cắt tín hiệu tham gia trong các con đƣờng này đƣợc thể hiện trên Hình 1.1, Cơ chế tiết đƣợc thể hiện trên hình 1. Các con đƣờng tiết protein của vi khuẩn (Nguồn: Tjalsma et al., 2000a, 2004) Trong Sec/P, ribosome liên kết với đầu N của SP nhờ Ffh protein. Protein Ffh, Hbsu và scRNA là các hợp phần trong phức hợp SRP (signal recognition particle) tham gia trong quá trình vận chuyển, sau đó phức hợp SRP-precusor sẽ tƣơng tác với SecA nhờ các liên kết với SP.

Cụm liên kết SRP – Precusor – SecA đƣợc đƣa tới vị trí màng tế bào và tƣơng tác với các yếu tố protein vận chuyển trên màng SecYEG, SecE, SecG và các protein hỗ trợ SecDF, SpoIIIJ và YqjG. Sau đó, SP sẽ đƣợc phân cắt bởi một enzyme trên màng là SPase I (SipS-W), Precusor protein đƣợc đƣa ra qua các Sec-pore bởi SecA chủ yếu nhờ vào nguồn năng lƣợng 6 ATP và các điện tử trên kênh dẫn truyền. Đoạn SP bị phân cắt bởi 2 SPase là SppA và TepA, các exoprotein sẽ đƣợc vận chuyển qua màng tế bào do đó nó đƣợc điều khiển bởi WprA, một protease trên màng tế bào và đƣợc tăng cƣờng tạo ra nhờ xúc tác của PrsA, một lipoprotein trên màng tế bào. BdbB và BdbC là các protein tham gia giúp cho việc hình thành các cầu nối disulfide (prophage-derived disulfide bond formation protein) trong quá trình hình thành cấu trúc protein.

Một số protease ở thành tế bào tích điện âm chính vì vậy các ion Ca2+ và Fe3+ rất cần thiết cho việc ổn định hoạt tính của một số exoprotein.Sơ đồ cơ chế tiết protein ngoại bào theo Sec/P ở B. Đích vận chuyển protein trong Bacillus Cấu trúc của lớp màng tế bào của Bacilli không có lớp màng ngoài (OM - Outer membrane) cho nên sau khi tổng hợp các protein có thể đƣợc giữ lại trong tế 7 bào chất hoặc vận chuyển vào CM hoặc chúng sẽ đƣợc vận chuyển qua CM vào thành tế bào, sau đó protein có thể vẫn giữ trên thành hoặc tiết ra môi trƣờng nuôi cấy (Tjalsma et al.