CHƯƠNG 1: TONG QUAN. SG co 212 91 91950191111 5111121 HH ng ng sở 3 1.1 Đại cương về vi khuẩn Bacillus subtilis .1 Lịch sử phát triỂn.3) Đặc điểm phân bồ.4 Đặc điểm hình thái. - G1261 9193193 E1 1E 2kg ng kg ng ri 4 1.5 Đặc điểm sinh hóa. -- G- c1 E251 21 9193151111 91 121kg ng kg ng ri 4 I.2_ Các phương pháp định danh Vi sinh Vat .1 Phương pháp truyền thống.2 Phương pháp sinh học phân tỬ.3 Phương pháp PCR — Giải trình tự Ø€n.
Một số phương pháp bảo quản vi sinh Vật.1 Phuong pháp cấy truyền Vi sinh vật .2 Giữ giống dưới lớp dầu khoáng. Giữ giống trong Cát.4 Giữ giống trên silicagen.-- ¿+55 2+ Set SE E111 212121111121 re 15 1.5 Giữ giống trên gelatin .6 Phuong pháp đông khô .7 Phuong pháp bao quan lạnh Sau.4 Các nghiên cứu trong va ngoài nước về hướng của dé tài.--------- 21 CHUONG 2: NGUYEN VAT LIEU VA PHƯƠNG PHÁP. Vật liệu thí nghiệm wo.2 Nội dung nghiÊn CỨU.3 Phương pháp thực hiện dé tài.1 Phân lap Bacillus sWfIÏIS. SH SH He 27 2.2 Định danh Bacillus subtilis bang phương pháp sinh hóa.
Định danh Bacillus subtilis bang phương pháp sinh học phân tử.4 Kiếm tra đặc tính sinh hoc đáp ứng yêu cau trong kiểm nghiệm dược phẩm. - c2 Q 0200102201211 11211 11 11 TK TT kh Thy chà nhe H 33 2.1 Kiểm tra khả năng nhạy cảm với kháng sinh bằng phương pháp F71 5871/1/8;/2BRRRRREREREREREREE.2 Thu nghiệm trên mot số mẫu thuốc kháng sinh.5 Khảo sát phương pháp bao quan đông khô.1 Khảo sát môi trường chất bảo VỆ.2 Khao sát thời gian đông lạnh.3 Khao sát quá trình đông khÔ. ca 37 CHUONG 3: KET QUÁ VA BAN LUẬN .-- G6 + k2 SE E2 vs cvseesxe 38 3.1 Phan lập Bacillus SHfHÏ1S .2 Định danh Bacillus subtilis bằng phương pháp sinh hóa. Định danh Bacillus subtilis bằng phương pháp sinh học phân tử.4 Kiểm tra đặc tinh sinh hoc đáp ứng yêu cau trong kiếm nghiệm dược phẩm.1 Kiểm tra khả năng nhạy cảm với kháng sinh.2 Thử nghiệm trên một số mẫu thuốc kháng sinh.5 Khảo sát phương pháp bao quản đông khô.1 Xây dựng đường chuẩn và đường cong sinh trưởng của 2 chủng phân lập 1.1 Đường cong SIHH [FHỞN.--c 5+ ke SE E11 S11 11111111 111111121 ckr 54 3.2 Khảo sát môi trường chất bảo VỆ.
Khảo sát thời gian đông lạnh .4 Khảo sát quá trình đông khô .6 Khảo sát điều kiện bảo quan sản phẩm đông khô. --- 5555: 59 3⁄7 Kiếm tra đặc tính chủng sau quá trình đông khô.- 2-2-2 eects 60 lil CHUONG 4: KET LUẬN VÀ KIÊN NGHI.ccccccsceccececcecscescesceceesscesceevecsacenees 63 AL K@tluan .cccccccccccccccscscsscscscscssssescscsesescscscscsesscscscsesssscscsesesssssscscsesssssscsesessss 63 TAI LIEU THAM KHẢO).- G- SG S1 13821158 5895353 18 9195191 91 H1 1n ng cọ 64 IV DANH MỤC BANG Bang 1. 1 Các phản ứng sinh hoá của Bacillus sUfIÏHS. 2 Một số phương pháp phân loại Vi sinh vật.
3 So sánh giữa phương pháp truyền thống và phương pháp sinh học phân tử ¬. 4 Thành phan phản ứng PCR .--- ¿2 252 S2 SE +E2E‡E£E2E£E E2 £zerxererred 12 Bảng 1. 5 Quy mô một số bộ sưu tập giống trên thế giới. 1 Thành phan phản ứng PCR.
2 Danh mục các loại kháng sinh và phương pháp thực hiện. 3 Môi trường chất bảo vệ của Bacillus subtilis. 1 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của 2 chủng VT1 và PLI. 2 Kết quả định danh bang kit Api 20E chủng VT1 và PLI.
3 Kết quả định danh bang kit Api 50 CHB chủng VT1 và PLI. 4 Kết quả định danh bang kit Vitek chủng VT1 và PLI. 5 Kết quả giải trình tự gen mã hoá chol6S rARN của 2 chủng VT1 và PLI ii. 6 Kết quả định danh.
7 Các đặc tính sinh học của chủng Bacillus subtilis trong kiểm nghiệm a0. 8 Đường kính vòng vô khuẩn của các chủng vi khuẩn. 9 Kết quả kháng sinh đồ của chủng B. subtilis VT1 và PLI.
10 Đường kính vòng vô khuẩn ching Bacillus subtilis với kháng sinh ErythrOMycin. HT TT ng nh 52 Bang 3. 11 Đường kính vòng vô khuẩn ching Bacillus subtilis với kháng sinh SDITAIVCIH. SG SG Q9 Thìn.
12 Nông độ vi khuẩn chủng VT1, PLI trước và sau đông lạnh. 13 Nong độ vi khuẩn trước và sau đông lạnh trong 2 giờ và 16 giờ. 14 Nông độ vi khuẩn VT1 và PLI sau đông khô. 15 Nong độ vi khuẩn VTI và PLI sau thời gian bao quan 1 tháng ở các nhiệt độ khác nhau.
16 Dac tính sinh hóa của chủng VT1 và PLT sau đông khô. 61 DANH MUC HINH Hình |. 1 Cac bước trong phan ứng PCTR. 2 Bản đồ primer cho gen 16S rARN.
3 Các bước của quá trình đông khô. 2 Điện di trên gel aØarOS€. 1 Chung vi khuẩn phân lập trên môi trường lỏng TSB và môi trường thạch iiiiiiddaáaáddddddii'Á. 2 Hình thái khuân lạc VT1 và PL1 trên môi trường MYP.
3 Chủng VT1 và PLI dưới kính hiễn vi. 4 Chung VT1 và PLI dưới kính hién vi điện tử quét. 5 Phản ứng Catalase của chung VT1 và chủng PLI. 6 Kit Api 50 CHB va Api 20 E trước và sau khi ủ 24 giờ.
7 Kết quả điện di chủng Bacillus subtilis VT1 và PLA. 10 Cây phan loại của chủng VT 1. 11 Cây phân loại của chủng PUI. 12 Vòng vô khuẩn của các chủng B.
subtilis ATCC 6633, PLI, VTI1. 13 Vòng vô khuẩn của chủng Bacillus subtilis VT1 với kháng sinh Spiramycin và chung Bacillus subtilis PL1 voi Erythromycin. 14 Kết quả điện di chủng Bacillus subtilis VT1 và PL1 sau đông khô. 61 DANH MUC DO THI Đồ thi 3.
1 Đường cong sinh trưởng của chủng VT1 và PLI. 2 Đường chuẩn của chủng PL. 3 Đường chuẩn của chủng VT l.- - ¿5c tt 2e 3E 2 EErrrkrrerrrererred 55 Đồ thị 3. 4 Nong độ vi khuẩn sau đông lạnh.
ee eeeecccccccecneeeseeeeeceeeeeeeeeeeeeeeeeas 56 Đồ thị 3. 5 Nong độ vi khuẩn sau đông lạnh theo thời gian.------- 5: 58 PHAN MỞ DAU Thuốc là một loại hàng hóa đặc biệt có quan hệ, ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe, thậm chí đến cả tính mạng của người bệnh hoặc người sử dụng thuốc. Bên cạnh nhiệm vụ hàng dau của ngành y tế là tìm ra những phương thức mới dé phòng và chữa bệnh thì một trong những mục tiêu hiện nay là tạo ra được những sản phẩm thuốc có chất lượng cao, ôn định, giá cả hợp ly cho người sử dung. Do đó, đảm bảo chất lượng thuốc là công việc rất quan trọng.
Chất chuẩn, chất đối chiếu là một trong những yếu tố không thé thiếu trong công tác kiểm nghiệm dược phẩm. Do là loại hàng hóa đặc biệt nên quy trình kiểm nghiệm cũng được quy định nghiêm ngặt. Chủng vi sinh vật chuẩn sử dụng phải theo quy định của Dược điển hoặc các chủng có đặc tính tương đương với chủng chuẩn trong Dược điển. Việc mua bán khó khăn vì thủ tục nhập khẩu (do là một mặt hang đặc biệt nhạy cảm), lại rất dat tiền.
Mặt khác, theo quy định thì việc cấy truyền chủng vi sinh vật nhiều lần là không được phép. Chính vì vậy mà các cơ sở y tế trên thế giới cũng phải tự xây dựng bộ sưu tập vi sinh vật đối chiếu dé đáp ứng nhu cau của chính mình. Hiện nay, trong nước chưa có cơ quan nào chuyên cung cấp nguồn chủng chuẩn vi sinh vật cho ngành dược. Đa số chủng vi sinh vật chuẩn đang sử dụng trong ngành dược được lẫy từ các nguồn xin - cho thiếu rõ ràng hoặc được mua về từ các ngân hàng chủng quốc tế có uy tín.
Do đó, chúng ta chưa thể chủ động nguồn chủng chuẩn này. Nắm được nhu cầu này, xuất phát từ công việc thực tế tại Viện kiểm nghiệm Thuốc thành phố Hỗ Chí Minh, chúng tôi tiến hành nghiên cứu để phân lập, định danh và xây dựng nguồn chủng chuẩn vi sinh vật tương đương với ATCC để phục vụ cho công tác kiếm nghiệm dược phẩm. Có nhiều chủng chuẩn vi sinh vật khác nhau can thiết cho công tác kiếm nghiệm dược phẩm, Bacillus subtilis được sử dụng trong phép thử giới hạn nhiễm khuan, phép thử xác định hoạt lực kháng sinh bằng phương pháp thử vi sinh vật, kiểm nghiệm sản phẩm probiotic, kiểm tra chất lượng môi trường nuôi cay. - Trong phép thử giới hạn nhiễm khuẩn: chủng chuẩn được dùng làm đối chứng dương trong các phan ứng sinh hóa phát hiện vi sinh vật gây bệnh, kiểm tra tính có giá trị của phương pháp đếm trong định lượng vi sinh vật.
- Trong phép thử xác định hoạt lực thuốc kháng sinh bằng phương pháp thử vi sinh vật và xác định hiệu quả kháng khuẩn của chất bảo quản: được đánh giá dựa trên khả năng ức chế hoặc tiêu diệt chủng vi sinh vật ở điều kiện thích hợp. - Trong kiếm nghiệm sản phẩm probiotic, chủng chuẩn được làm chứng dương trong định danh loài. - Ngoài ra, chủng chuẩn còn được sử dụng để kiểm tra chất lượng của các loại môi trường nuôi cấy. Với những ứng dụng trên thì chủng Bacillus subtilis chuan là một trong những điều kiện bắt buộc của phép thử vi sinh.
Với tình hình kinh tế chung của nước ta, việc mua chủng vi sinh vật từ nước ngoài đồng thời tuân thủ đúng quy định quốc tế khi sử dụng là thiếu khả thi. Vì thế, tự nghiên cứu và xây dựng một bộ sưu tập chung vi sinh vat có đặc tính tương đương với các chủng chuẩn quốc tế dé phục vụ cho ngành là một nhu cầu thực tiễn và cấp thiết. Việc xây dựng này không chỉ phục vụ cho công tác kiểm nghiệm mà còn cho cả công tác nghiên cứu sâu về chuyên môn. Do đó, Bộ Y tế đã giao cho Viện kiểm nghiệm Thuốc thành phố Hỗ Chí Minh thực hiện dự án khoa học công nghệ mang tên “Xây dựng một số chủng vi sinh vật đối chiếu sử dụng trong kiếm nghiệm dược phẩm”.
Với cơ sở vật chất hiện tại và yều cầu cấp thiết của Viện kiểm nghiệm Thuốc thành phố Hồ Chí Minh và thời gian thực hiện luận văn, tôi đặt ra mục tiêu nghiên cứu bước đầu chủng Bacillus subtilis dé có kinh nghiệm thực tiễn về cách thức xây dựng bộ sưu tập chủng vi sinh đối chiếu với dé tài “Thiết lập chủng Bacillus subtilis đôi chiêu sử dụng trong kiêm nghiệm dược phâm”. CHUONG 1: TONG QUAN 1.1 Dai cương về vi khuẩn Bacillus subtilis 1.1 Lich sử phát triển Bacillus subtilis được phát hiện lần đầu tiên trong phân ngựa (1941) bởi Tổ chức y học Nazi của Duc. Luc dau, chu yếu được sử dụng để phòng bệnh Ii cho các binh sĩ Đức chiến dau ở Bắc Phi. Việc sử dụng để điều trị bệnh phải đợi đến những năm 1949 — 1957 khi Henry, Albot và các cộng sự tách được các chủng thuần khiết của Bacillus subtilis.
Từ đó, “subtilistherapie” có nghĩa là thuốc Subtilin ra đời trị các chứng viêm ruột, viêm đại tràng, chống tiêu chảy do rối loạn tiêu hoá.