CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Laccase, laccase-like và vi sinh vật sinh tổng hợp laccase, laccase-like 1. Giới thiệu chung về laccase Laccase ngày càng được quan tâm nhiều hơn trong những năm gần đây do tiềm năng của chúng trong việc phân hủy, khử độc các chất ô nhiễm là các hợp chất của phenol và các chất đa vòng thơm [142]. Laccase thuộc nhóm oxidoreductase là một trong số ít các enzyme đã được nghiên cứu từ thế kỷ thứ 19.
Năm 1883, Yoshida là người đầu tiên mô tả laccase từ dịch chiết thân cây Rhus vernicifera ở Nhật Bản [52]. Laccase có hiệu quả oxy hóa với phổ cơ chất rộng và do chỉ sử dụng oxy là tác nhân nhận điện tử cuối cùng nên nó được áp dụng trong nhiều ngành công nghiệp với những mục đích khác nhau như dệt nhuộm, chế biến thức ăn, nhiên liệu sinh học, tổng hợp hữu cơ, xử lý môi trường, giấy và nước thải, dược phẩm và công nghiệp mỹ phẩm. Thực tế, đã có một số sản phẩm laccase thương mại để ứng dụng trong các lĩnh vực chế biến thức ăn, giấy, dệt nhuộm và các ngành công nghiệp khác [89, 155]. Cấu trúc phân tử của laccase Một loài sinh vật có thể sinh tổng hợp có nhiều loại laccase khác nhau (các isozyme) và các isozyme thường khác nhau về trình tự axit amin và tính chất động học xúc tác.
Isozyme laccase khác nhau ở mức độ glycosyl hóa và thành phần các gốc carbonhydrat. Loài nấm đảm Trametes versicolor có 5 loại isozyme chỉ khác nhau về thành phần carbonhydrate, thành phần carbonhydrat của chúng thay đổi từ 10-45% so với khối lượng của protein. Phân tử laccase có khối lượng phân tử dao động trong khoảng 60-100 kDa. Phần lớn laccase của nấm có bản chất là glycoprotein với hàm lượng carbonhydrate chiếm khoảng 10-25% [72].
Tuy vậy, tất cả laccase đều giống nhau về cấu trúc trung tâm xúc tác với 4 nguyên tử đồng. Những nguyên tử đồng này được chia thành ba nhóm: loại 1 (T1), loại 2 (T2) và loại 3 (T3), chúng khác nhau về tính chất hấp thụ ánh sáng và thế điện tử. Các nguyên tử đồng T1 và T2 có tính chất hấp thụ điện tử và tạo thành phổ điện tử mạnh, trong khi cặp nguyên tử đồng T3 không tạo phổ điện tử hấp thụ điện tử và có thể được hoạt hóa khi liên kết với anion mạnh. Hình ảnh cấu trúc 3 chiều của laccase (A) của chủng Bacillus subtilis 168.
Ion màu xanh là 4 nguyên tử đồng. (B) số lượng nghiên cứu công bố về các loại enzyme trong giai đoạn 1940 - 2013 [9] Cấu trúc 3 chiều của laccase bao gồm 3 tiểu phần (vùng A: màu đỏ, vùng B: màu vàng và vùng C: màu xanh lá cây) có khối lượng tương đối bằng nhau, cả ba phần đều đóng vai trò trong quá trình xúc tác. Vị trí liên kết với cơ chất nằm ở khe giữa vùng B và vùng C, trung tâm một nguyên tử đồng nằm ở vùng C và trung tâm ba nguyên tử đồng nằm ở bề mặt chung của vùng A và vùng C [147]. Trung tâm đồng một chỉ chứa một nguyên tử đồng T1, liên kết với một đoạn peptit có hai gốc histidin và một gốc cystein.
Liên kết giữa nguyên tử đồng T1 với nguyên tử S của cystein là liên kết đồng hóa trị bền và hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 600 nm, tạo cho laccase có màu xanh nước biển đặc trưng. Trung tâm đồng ba nguyên tử có nguyên tử đồng T2 và cặp nguyên tử đồng T3. Nguyên tử đồng T2 liên kết với hai gốc histidin bảo thủ trong khi các nguyên tử đồng T3 thì tạo liên kết với 6 gốc histidin bảo thủ (Hình 1. Cơ chế xúc tác của laccase Cơ chất khi bị oxy hóa bởi laccase sẽ nhường một electron cho nguyên tử đồng T1, biến nguyên tử đồng T1 trở thành dạng Cu+, hình thành phân tử laccase có cả 4 nguyên tử đồng đều ở trạng thái khử (Cu+).
Phân tử oxy sau đó oxy hóa laccase dạng khử, thông qua hợp chất trung gian peroxy và peroxy bị khử thành nước. Một số nhà nghiên cứu cho rằng, sự oxy hóa hợp chất peroxy trung gian hình thành laccase ở trạng thái bị oxy hoạt hóa, trong đó cả 4 nguyên tử đồng đều ở trạng thái oxy hóa. Sau đó, enzyme nhanh chóng tham gia vào chu trình xúc tác mới [99]. Ngoài ra, cơ chế xúc tác có thể diễn ra theo cách khác đó là khi các cơ chất bị oxy hóa trực tiếp bởi trung tâm hoạt động do 4 nguyên tử đồng đảm nhiệm.
Các phân 6 tử cơ chất thường có cấu tạo cồng kềnh hoặc có thế oxi hóa khử quá lớn, vì vậy chúng không thể tiếp cận được trung tâm xúc tác của laccase. Trong trường hợp này cần một chất gắn kết (mediator) hoặc hệ chất gắn kết để tiếp xúc với trung tâm phản ứng của laccase để bị laccase oxy hóa, sau đó mediator ở dạng oxy hóa nhận một điện tử của cơ chất và trở thành khử, tiếp tục tham gia vào chu kỳ xúc tác [117]. Ngược lại, laccase sau khi cho mediator một điện tử thì trở thành dạng khử, sau đó bị oxy hóa thành dạng oxy hóa và tiếp tục tham gia vào chu trình xúc tác tiếp theo. Các mediator thường phù hợp cho laccase là 3-hydroxyanthranillic acid (HAA), 2,2’- azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic axit) (ABTS), N-hydroxybenzo- trialzone (HOBT), N-hydroxyphtaimide (HPI), violuric acid (ViO) v.
Sự có mặt của mediator đã góp phần làm tăng phổ cơ chất xúc tác và tính không đặc hiệu cơ chất của laccase. Một số đặc tính sinh hóa của laccase Đến nay, đã có khoảng 100 loại laccase khác nhau đã được tinh sạch và xác định đặc điểm sinh hóa với các cơ chất là ABTS, 2,6-DMP và SGZ. Gene laccase đặc biệt mã hoá cho một protein khoảng 500 - 600 amino acid và trọng lượng phân tử trong khoảng 60 đến 90 kDa khi được xác định bằng SDS-PAGE [156]. Đến tháng 9 năm 2017, có khoảng 112.000 kết quả tra cứu các tiêu đề bài báo khoa học có từ khóa laccase (https://scholar.
Đã có một vài hệ gene của các chủng nấm có chứa hơn một gene laccase [36]. Mức độ biểu hiện của các gene điển hình khác nhau phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy [145]. Với hàm lượng nitơ cao trong môi trường đã giảm sự dịch mã của gene laccase trong chủng Basidiomycete sp. Có nhiều bước được sử dụng trong quá trình tinh sạch protein laccase như siêu lọc (lọc thẩm thấu màng), kết tủa với amoni sulfat hoặc với dung môi hữu cơ và trao đổi ion cũng như sắc ký khối lượng.
Laccase đại diện của nấm là các protein có khối lượng trong khoảng 50 đến 90 kDa, điểm đẳng điện xung quanh giá trị 4. Một số loài nấm sinh tổng hợp laccase đã được nghiên cứu bao gồm Coprinus plicatilis, Fomes fomentarius, Heterobasidion annosum, Hypholoma fasciculare, Kuehneromyces mutabilis, Leptoporus litschaueri, Panus stipticus, Phellinus igniarius, Pleurotus corticatus, P. ostreatus, Polyporus brumalis, Stereum hirsutum, Trametes gibbosa, T. versicolor có hơn một isozyme và điểm đẳng điện (pI) trong khoảng từ 3 đến 5 [4].
7 Khả năng xúc tác của enzyme đã được mô tả thông qua định lượng bằng hằng số Michaelics Km và hằng số hiệu quả xúc tác Kcat. Những hằng số này đã được công bố với một lượng lớn laccase và có sự khác biệt trong số chúng. Hằng số Km của laccase nhìn chung dao động xung quanh giá trị 2,5 𝜇M phụ thuộc vào nguồn gốc enzyme và cơ chất. Giá trị Km của laccase được xác định với cơ chất là 2,6- dimethoxyphenol nhìn chung là cao hơn khi xác định với syringadazine (sự trùng hợp của hai phân tử là 2,6-dimethoxyphenol được liên kết với nhau bằng cầu azide) [117].
Nghiên cứu ảnh hưởng của pH và các điều kiện nhiệt độ lên hoạt tính laccase đã được thực hiện. Theo đó, sự biến động hoạt tính của laccase theo pH thường có hình chuông và khoảng tối ưu xung quanh giá trị 4,6 khi sử dụng cơ chất có nguồn gốc phenol [139]. Hoạt tính laccase giảm trong điều kiện pH trung tính hoặc kiềm là do tăng anion - OH, anion này có kích thước nhỏ nên là tác nhân gây ức chế hoạt tính của laccase. Khi pH tăng thế khử của cơ chất có bản chất phenol giảm dẫn đến cơ chất này nhạy cảm hơn với quá trình oxy hoá bởi laccase [47, 48].
Sự ổn định hoạt tính laccase đối với pH nhìn chung trong khoảng từ 8-9 [175] và sự ổn định hoạt tính của laccase theo nhiệt độ thay đổi phụ thuộc lớn vào nguồn gốc vi sinh vật, nhìn chung nằm trong khoảng từ 30 đến 50oC và hoạt tính giảm nhanh chóng ở nhiệt độ trên 60oC [114, 94]. Vi sinh vật sinh tổng hợp laccase Laccase từ thực vật được tìm thấy trong xylem nơi chúng có thể oxy hóa các monoligno ở trạng thái ban đầu của quá trình lignin hóa và cũng tham gia trong các cơ chế gốc cơ bản của sự hình thành lignin cao phân tử [79]. Thêm vào đó laccase đã được nghiên cứu về khả năng tham gia vào bước đầu tiên của quá trình hàn gắn vết thương trên lá [133]. Hiện tại, nghiên cứu về laccase thực vật bậc cao còn rất hạn chế so với laccase từ các chủng nấm [113, 147].
Thực tế, một số nghiên cứu về hoạt tính laccase ở vi khuẩn không giống laccase ở các nhóm nhân sơ [24]. Protein laccase của vi khuẩn là protein nội bào hoặc ở khoang chu chất [4]. Chủng Bacillus subtilis đã sinh ra loại laccase CotA ổn định nhiệt tham gia vào sự hình thành màu ở màng nội bào [88]. Laccase cũng đã được tìm thấy từ loài Streptomyces cyaneus [3] và S.
Laccase đã được nghiên cứu khá chi tiết ở nhiều chủng nấm thuộc nấm sợi (Ascomycetes) và nấm đảm (Basidiomycetes) và chúng đã được tinh sạch từ nhiều 8 chủng khác nhau. Có nhiều nghiên cứu về sản phẩm laccase tinh sạch của các loài nấm Ascomycetes như loài Melanocarpus albomyces [69], Cerrena unicolor [70], Magnaporthe grisea [19], Trametes versicolor, Trichoderma reesei [81] và Xylaria polymorpha [102]. Nấm men là nhóm riêng biệt có thể thuộc cả Ascomycetes và Basidiomycetes. Hiện nay, laccase được tinh sạch từ chủng Cryptococcus (Filobasidiella) neoformans gây bệnh cho người, chủng nấm men này sinh ra laccase thật có khả năng oxy hóa phenol và aminophenol và cũng có thể oxy hóa tyrosine [34].
Ngoài ra, laccase còn có thể tìm thấy trong một số côn trùng nơi mà chúng được cho là thể kích hoạt quá trình hình thành biểu bì [35]. Ngày này, các nhà khoa học vẫn đang nỗ lực nghiên cứu sàng lọc từ tự nhiên các chủng nấm sinh tổng hợp laccase với mong muốn tìm được chủng có hoạt tính cao và có đặc tính mới. Hoạt tính laccase thay đổi phụ thuộc vào các loài, các chủng vi sinh vật, vì ở điều kiện tự nhiên hoạt tính laccase rất thấp.