Đặt vấn đề Cúm là một căn bệnh nguy hiểm gây tử vong cao và hằng năm trên thế giới đã có hơn nửa tỷ ngƣời mắc bệnh. Hiện nay, virus cúm A/H5N1- chủng virus nguy hiểm nhất ở ền trên 40 quốc gia ở châu Á, Trung đông, châu Âu và châu Phi ớc ta, dịch cúm gia cầm H5N1 xảy ra từ những tháng cuối năm 2003 gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi gia cầm và ảnh hƣởng đến sức khoẻ con ngƣời. Việt Nam và Indonesia là hai quốc gia có số ngƣời nhiễm virus cúm A/H5N1 và có tỷ lệ tử vong cao nhất so với các quốc gia trên thế giới. Chính vì vậy nghiên cứu làm sáng tỏ bệnh cúm A/H5N1 và nhân tố gây bệnh để xây dựng biện pháp phòng và khống chế bệnh là yêu cầu thực tiễn đặt ra.
Dịch cúm gia cầm diễn biến ngày càng phức tạp vì hệ gen của virus cúm A luôn biến đổi. Bên cạnh đó, nguồn tàng trữ và lây lan bệnh là chim di cƣ và thủy cầm rất khó kiểm soát và khống chế. Hiện nay, việc phòng chống virus cúm A nói chung và H5N1 nói riêng, bên cạnh các biện pháp phòng chống dịch nhƣ tiêu độc, xử lý gia cầm bị bệnh, thanh lý gia cầm nhiễm hoặc nguy cơ nhiễm thì biện pháp sử dụng vaccine vẫn là hƣớng thiết yếu nhất để khống chế và ngăn chặn sự lây lan dịch sang ngƣời. Ngoài các loại vaccine truyền thống, vaccine thế hệ mới đƣợc tạo ra bằng các phƣơng pháp tái tổ hợp và di truyền ngƣợc đang đƣợc sử dụng rộng rãi, tuy nhiên, nhƣ mức độ an toàn thấp , các nhà khoa học trên thế giới vẫn đang tiếp tục phát triển những loại vaccine mới có tính ƣu việt hơn, rẻ hơn, dễ bảo quản, an toàn và hiệu quả hơn.
Vaccine ăn đƣợc từ thực vật là vaccine tác động vào thể dịch, kích thích cả hệ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.vn/ 2 thống miễn dịch thể dịch và miễn dịch tế bào. Vaccine thực vật có hoạt tính tƣơng tự nhƣ vaccine thông thƣờng, chỉ khác là vaccine này đƣợc thực vật sản xuất trong những phần ăn đƣợc nhƣ lá, củ, quả và hạt. Vaccine thực vật có một số ƣu điểm nổi bật so với các loại vaccine khác ở chỗ có thể ăn tƣơi hoặc nấu chín; dễ dàng sản xuất khối lƣợng lớn bằng cách tăng diện tích trồng cây chuyển gen có khả năng sản xuất kháng nguyên; vaccine thực vật ổn định, , dễ bảo quản, dễ sử dụng và có hiệu quả kinh tế. Ở Việt Nam, đậu tƣơng là cây có giá trị kinh tế cao, hạt đậu tƣơng là nguồn thực phẩm chính cho vật nuôi và con ngƣời.
Sự biểu hiện thành công gen gus trên cây đậu tƣơng là cơ sở của việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen để sản xuất các chất có dƣợc tính nhƣ vaccine trong hạt đậu tƣơng. Với ƣu điểm nổi bật nhƣ sản xuất đơn giản, giá thành thấp, hiệu quả cao trong phòng bệnh và có độ an toàn, vaccine sản xuất từ thực vật đƣợc xem là hƣớng đi phù hợp trong chiến lƣợc chăm sóc sức khoẻ cộng đồng ở các quốc gia đang phát triển. Xuất phát từ lý do trên chúng tôi đã tiến hành đề tài luận án là: “Nghiên cứu chuyển gen mã hóa protein bề mặt của virus H5N1 vào cây đậu tương phục vụ sản xuất vaccine thực vật”. Mục tiêu nghiên cứu Thiết kế đƣợc vector mang cấu trúc gen HA, đoạn gen HA1 của virus cúm A/H5N1.
Tạo đƣợc cây đậu tƣơng chuyển gen mang cấu trúc đoạn gen HA1 và biểu hiện đƣợc protein tái tổ hợp HA1 ở hạt đậu tƣơng. Nội dung nghiên cứu 3. Thiết kế và tổng hợp gen HA và đoạn gen HA1 có khả năng biểu hiện tối ƣu ở thực vật, nhân dòng gen HA và đoạn gen HA1 trong tế bào vi khuẩn E.coli và tạo vector chuyển gen mang cấu trúc gen HA và đoạn gen HA1. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.
Biến nạp cấu trúc vector chuyển gen mang gen HA và đoạn gen HA1 vào vi khuẩn A. Lây nhiễm vi khuẩn A. tumefaciens tái tổ hợp vào mô lá thuốc lá và tái sinh tạo cây thuốc lá chuyển gen mang gen HA và đoạn gen HA1; 3. Phát triển hệ thống tái sinh đa chồi phục vụ chuyển gen ở cây đậu tƣơng; 3.
Chuyển cấu trúc vector mang gen gus biểu hiện ở hạt vào cây đậu tƣơng. Đánh giá hiệu quả chuyển gen gus ở giống đậu tƣơng ĐT12 và DT84; 3. Chuyển cấu trúc vector mang đoạn gen HA1 vào cây đậu tƣơng và phân tích sự có mặt của đoạn gen chuyển HA1 ở cây đậu tƣơng của thế hệ T0; 3. Phân tích dòng cây đậu tƣơng chuyển gen ở thế hệ T1 bằng kỹ thuật PCR và lai Western blot để xác định sự biểu hiện của protein HA1 ở hạt đậu tƣơng.
Những đóng góp mới của luận án 4. Hai cấu trúc vector mang gen HA và mang đoạn gen HA1 biểu hiện trong hạt thực vật đã đƣợc thiết kế thành công và tạo đƣợc chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang cấu trúc gen HA, đoạn gen HA1 của virus cúm A/H5N1. G ĐT12 n gen gus giai đoạn hạt là ĐT12 4,3 % với giống DT84. Chuyển thành công cấu trúc SLHEP-HA1 vào cây đậu tƣơng và thu đƣợc 8 dòng cây đậu tƣơng ở thế hệ T0 mang cấu trúc SLHEP-HA1 biểu hi trong hạt.
pPhân tích cây đậu tƣơng ở thế hệ T1và T2 đã xác định đƣợc sự di truyền của gen chuyển HA1 qua 3 thế hệ T0, T1 và T2 4. Ở thế hệ T1 đã thu đƣợc dòng đậu tƣơng H11 chuyển gen mang đoạn gen HA1 và biểu hiện thành công protein HA1 trong hạt của dòng đậu tƣơng H11. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn Về khoa học: Đã thiết kế đƣợc vector chuyển gen mang cấu trúc gen HA và đoạn gen HA1 biểu hiện ở hạt thực vật.
Biểu hiện thành công gen gus ở hạt. Đã hoàn thiện đƣợc quy trình tái sinh đa chồi ở cây đậu tƣơng. Với việc lây nhiễm vi khuẩn A. tumefaciens tái tổ hợp vào mô đậu tƣơng đã tổn thƣơng, tạo cây đậu tƣơng chuyển gen và đã biểu hiện thành công protein HA1 của virus H5N1 trong hạt đậu tƣơng.
Về thực tiễn: Với kết quả protein HA1 đã đƣợc biểu hiện thành công trong hạt đậu tƣơng ở thế hệ T1 là cơ sở của việc tiếp tục kiểm tra đáp ứng khả năng miễn dịch của gia cầm, đồng thời làm tiền đề cho việc nghiên cứu sản xuất vaccine ăn đƣợc ở thực vật. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.vn/ 5 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. BỆNH CÚM GIA CẦM VÀ VIRUS CÚM A/H5N1 1. Bệnh cúm gia cầm và dịch bệnh cúm A/H5N1 Cúm gia cầm (Avian Influenza, AI) là bệnh truyền nhiễm cấp tính của gia cầm, do nhóm virus cúm A thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra [38].
Đây là nhóm virus có biên độ rộng, đƣợc phân chia thành nhiều phân type khác nhau dựa trên kháng nguyên HA và NA có trên bề mặt capsid của hạt virus. Nhóm virus cúm A có 16 phân type HA (từ H1 đến H16) và 9 phân type NA (từ N1 đến N9) và sự tái tổ hợp giữa các phân type HA và NA sẽ tạo ra nhiều phân type khác nhau về độc tính và khả năng gây bệnh [42]. Virus cúm A/H5N1 có độc lực cao và gây bệnh trên ngƣời vào những năm 1996-2008 [106]. Chủng virus cúm A/H5N1 đƣợc phát hiện lần đầu tiên gây bệnh dịch trên gà tại Scotland vào năm 1959.
Sau đó, cúm A/H5N1 đã tái xuất hiện tại Quảng Đông (1996) và Hồng Kông (1997) với sự biến đổi sâu sắc, không những gây chết gia cầm mà còn thích ứng trên ngƣời và gây chết ngƣời bệnh [142]. Năm 2003, virus H5N1 gây ra dịch cúm trên gia cầm tại Hồng Kông, Trung Quốc và lây lan sang hàng chục quốc gia ở châu Á, châu Âu và châu Phi, trong đó có Việt Nam. Cấu trúc virus cúm A/H5N1 vẫn nhƣ trƣớc đó, nhƣng xét về độc lực, loài vật chủ nhiễm bệnh, tính kháng nguyên- miễn dịch và mức độ truyền lây có nhiều nét đặc trƣng hơn và khác với những biến chủng H5N1 trƣớc đây. Các chủng virus cúm A/H5N1 thuộc phân dòng Thanh Hải (nguồn gốc vùng Bắc Trung Quốc) xuất hiện cuối năm 2005, bắt đầu lan sang một số nƣớc vùng Trung Á, Nga rồi tràn ngập vào các nƣớc Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.vn/ 6 vùng Tây Á, bao gồm cả Thổ Nhĩ Kỳ, các nƣớc Bắc-Trung Phi, trong đó Ai Cập và Nigeria là các nƣớc chịu thiệt hại nhiều nhất [25].
Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đến tháng 3/2013, đã có tới 622 trƣờng hợp mắc cúm A/H5N1, trong đó có 371 trƣờng hợp đã tử vong, chiếm 59,65%. Trong đó quốc gia có số ngƣời mắc bệnh và số tử vong cao là các nƣớc Ai cập, Indonesia và Việt Nam. Kết quả điều tra dịch tễ học cho thấy, hầu hết những ca nhiễm cúm gia cầm H5N1 trên ngƣời đều có liên quan đến tiếp xúc với gia cầm bị bệnh hoặc trung gian qua thực phẩm chế biến từ gia cầm bị bệnh hoặc qua tiếp xúc trực tiếp nhƣ giết mổ, vận chuyển, mua bán gia cầm. Việt Nam đƣợc WHO xác định là quốc gia “điểm nóng” do virus cúm A/H5N1 có các điều kiện thuận lợi để tiến hóa thích nghi lây nhiễm và trở thành virus của ngƣời.
Ở Việt Nam, đại dịch bùng phát từ năm 2003, đã tái phát qua bốn đợt dịch. Đợt thứ nhất xảy ra ở 57 tỉnh, thành phố; đợt dịch thứ tƣ gần đây nhất xảy ra ở 21 tỉnh, thành phố, đã tiêu hủy trên 50 triệu gia cầm các loại, thiệt hại lên đến hàng ngàn tỷ đồng [9]. Qua điều tra dịch tễ, các trƣờng hợp nhiễm cúm A/H5N1 trên ngƣời đƣợc ghi nhận đồng thời với thời điểm có dịch cúm trên gia cầm. Mặc dù số ca nhiễm ít nhƣng tỷ lệ tử vong rất cao (59%) và chi phí điều trị rất tốn kém, do vậy biện pháp tốt nhất là dự phòng để tránh mắc bệnh [7].
Đặc tính của virus cúm A/H5N1 Virus cúm A/H5N1 mẫn cảm với nhiệt độ, với các dung môi hòa tan lipid, với các loại hóa chất sát trùng và oxy hóa, với formaldehyde và với các tia phóng xạ. Các hạt virus tồn tại trong pH từ 6,5 đến 7,9. Trong điều kiện quá acid hoặc quá kiềm đều làm giảm khả năng lây nhiễm. Virus A/H5N1 bị bất hoạt dƣới ánh sáng trực tiếp sau 40 giờ, tồn tại đƣợc 15 ngày ánh sáng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.vn/ 7 thƣờng, tia tử ngoại bất hoạt đƣợc virus nhƣng không phá hủy đƣợc kháng nguyên của virus.