Luận án: Cảm biến điện hóa nano vàng, bạc-rGO phát hiện vi khuẩn - ĐHBK Hà Nội

Nghiên cứu chế tạo bộ cảm biến sinh học điện hóa ứng dụng vật liệu nano vàng bạc oxide. Phân tích cấu trúc, tính chất và hiệu suất của cảm biến trong phân tích

• Tác giả: Vũ Quang Khuê
• Người hướng dẫn: TS. Vũ Ngọc Phan
• Trường học: Trường Đại học Bách khoa Hà Nội
• Chuyên ngành: Khoa học vật liệu
• Đề tài: Nghiên cứu chế tạo bộ cảm biến điện hóa trên cơ sở các vật liệu nano vàng, bạc-oxide graphene khử để phát hiện một số vi khuẩn gây bệnh
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan về cảm biến sinh học điện hóa nano vàng bạc oxide

Cảm biến sinh học điện hóa trên cơ sở vật liệu nano vàng bạc oxide là công nghệ tiên tiến ứng dụng vật liệu nano lai giữa vàng, bạc và oxide graphene khử để phát hiện vi sinh vật gây bệnh. Vật liệu nano lai kết hợp ưu điểm của vàng (tính dẫn điện cao, tương thích sinh học) và bạc (khả năng kháng khuẩn, kích thích sinh học) cùng oxide graphene (diện tích bề mặt lớn, độ dẫn điện vượt trội) tạo nên hệ vật liệu có hiệu suất vượt trội. Phương pháp chế tạo thông qua tổng hợp thủy nhiệt, biến tính điện cực in lưới cacbon (SPE) bằng lớp phủ nano lai, giúp tăng cường độ nhạy và độ chọn lọc cho cảm biến. Ứng dụng chính trong lĩnh vực y tế là phát hiện nhanh vi khuẩn gây nhiễm trùng bệnh viện như Salmonella, E. coli với giới hạn phát hiện thấp (CFU/mL) và thời gian phản ứng ngắn (20-30 phút).

1.1. Vai trò vật liệu nano trong cảm biến sinh học

Vật liệu nano đóng vai trò nền tảng trong nâng cao hiệu suất cảm biến sinh học điện hóa nhờ diện tích bề mặt riêng lớn, khả năng khuếch đại tín hiệu điện hóa và tính tương thích sinh học vượt trội. Vàng nano (AuNPs) cung cấp môi trường ổn định cho liên kết sinh học nhờ khả năng tương tác cộng hóa trị với protein, kháng thể. Bạc nano (AgNPs) tăng cường độ dẫn điện và kháng khuẩn, trong khi oxide graphene khử (rGO) cải thiện độ dẫn điện, độ bền cơ học và khả năng hấp phụ sinh học. Sự kết hợp này tạo nên vật liệu nano lai với hiệu ứng hiệp đồng, vượt trội so với từng thành phần riêng lẻ.

1.2. Ứng dụng trong phát hiện vi khuẩn gây bệnh

Cảm biến sinh học điện hóa nano vàng bạc oxide được ứng dụng rộng rãi trong chẩn đoán y tế nhờ khả năng phát hiện nhanh chóng vi khuẩn gây nhiễm trùng bệnh viện như Salmonella, E. coli, Staphylococcus. Phương pháp chế tạo sử dụng điện cực in lưới cacbon biến tính bằng vật liệu nano lai, kết hợp kháng thể đặc hiệu để tăng cường độ chọn lọc. Kết quả thử nghiệm cho thấy cảm biến đạt giới hạn phát hiện thấp (10^2 CFU/mL), dải làm việc rộng (10^2 đến 10^6 CFU/mL) và thời gian phản ứng ngắn (25 phút), phù hợp cho xét nghiệm tại điểm chăm sóc (PoC).

II. Phân tích vấn đề nhiễm trùng bệnh viện và yêu cầu cảm biến

Nhiễm trùng bệnh viện là mối đe dọa toàn cầu, gây tăng tỷ lệ tử vong, kéo dài thời gian nằm viện (7-15 ngày) và tăng chi phí điều trị gấp 2-4 lần. Tại Mỹ, ước tính 2 triệu ca nhiễm trùng bệnh viện mỗi năm gây thiệt hại 4,5 tỷ USD. Ở Việt Nam, nghiên cứu tại bệnh viện Chợ Rẫy cho thấy nhiễm trùng bệnh viện kéo dài thời gian nằm viện 15 ngày với chi phí phát sinh 2.000 VND/người. Nguyên nhân chủ yếu do vi khuẩn kháng thuốc như Salmonella, E. coli, Staphylococcus. Hiện nay, phương pháp truyền thống (nuôi cấy vi sinh) mất 24-72 giờ, tốn kém và không phù hợp cho chẩn đoán nhanh. Do đó, nhu cầu cấp thiết về cảm biến sinh học điện hóa có độ nhạy cao, thời gian phản ứng ngắn và chi phí thấp trở nên quan trọng.

2.1. Hạn chế của phương pháp truyền thống

Phương pháp nuôi cấy vi sinh là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán nhiễm trùng nhưng có nhược điểm nghiêm trọng: thời gian kéo dài (24-72 giờ), chi phí cao do sử dụng sinh phẩm và thiết bị chuyên dụng. Ngoài ra, phương pháp này đòi hỏi điều kiện vô trùng nghiêm ngặt, dễ bị nhiễm chéo và không phù hợp cho xét nghiệm tại điểm chăm sóc. Đặc biệt, với các bệnh nhân nhiễm khuẩn đơn lẻ, việc kết hợp nhiều mẫu bệnh phẩm để giảm chi phí gây khó khăn trong chẩn đoán chính xác.

2.2. Yêu cầu kỹ thuật cho cảm biến sinh học điện hóa

Cảm biến sinh học điện hóa cần đáp ứng các yêu cầu kỹ thuật sau: giới hạn phát hiện thấp (<10^2 CFU/mL), thời gian phản ứng ngắn (<30 phút), độ chọn lọc cao đối với vi khuẩn mục tiêu, khả năng hoạt động trong môi trường sinh học phức tạp. Ngoài ra, cảm biến phải có độ bền cơ học, khả năng tái sử dụng và chi phí sản xuất thấp. Vật liệu nano lai (vàng-bạc-oxide graphene) được lựa chọn nhờ khả năng khuếch đại tín hiệu điện hóa, tăng cường độ nhạy và tương thích sinh học vượt trội so với vật liệu truyền thống.

III. Giải pháp chế tạo cảm biến sinh học điện hóa nano lai

Giải pháp chế tạo cảm biến sinh học điện hóa dựa trên vật liệu nano lai vàng-bạc-oxide graphene khử (Au-Ag-rGO) kết hợp với điện cực in lưới cacbon (SPE). Quy trình gồm ba bước chính: tổng hợp vật liệu nano lai bằng phương pháp thủy nhiệt, biến tính điện cực SPE bằng lớp phủ nano lai, và liên kết kháng thể đặc hiệu lên bề mặt điện cực. Vật liệu nano lai được chế tạo bằng cách khử oxide graphene và kết tủa nano vàng/bạc đồng thời, tạo ra cấu trúc nano đồng nhất với kích thước hạt ~20 nm. Điện cực SPE sau khi biến tính được khảo sát bằng phương pháp quét thế vòng (CV) và phổ tổng trở (EIS) để đánh giá đặc tuyến điện hóa. Kết quả thử nghiệm cho thấy cảm biến đạt giới hạn phát hiện 22 CFU/mL, dải làm việc 10^2-10^6 CFU/mL và thời gian phản ứng 25 phút.

3.1. Phương pháp tổng hợp vật liệu nano lai

Vật liệu nano lai Au-Ag-rGO được tổng hợp bằng phương pháp thủy nhiệt kết hợp khử hóa học. Quá trình bắt đầu bằng việc phân tán graphene oxide (GO) trong dung dịch, sau đó thêm dung dịch AgNO3 và HAuCl4. Chất khử NaBH4 được sử dụng để khử GO thành rGO đồng thời kết tủa nano vàng và nano bạc lên bề mặt rGO. Phương pháp này tạo ra cấu trúc nano lai đồng nhất, kích thước hạt ~20 nm, diện tích bề mặt riêng lớn. Các thông số như nồng độ chất khử, nhiệt độ và thời gian thủy nhiệt được tối ưu hóa để đạt hiệu suất cao nhất.

3.2. Quy trình chế tạo điện cực cảm biến

Điện cực in lưới cacbon (SPE) được biến tính bằng phương pháp nhỏ phủ lớp vật liệu nano lai Au-Ag-rGO. Đầu tiên, dung dịch nano lai được phân tán trong dung môi hữu cơ, sau đó nhỏ phủ lên bề mặt điện cực bằng phương pháp spin-coating. Sau khi sấy khô, điện cực được xử lý bằng dung dịch EDC/NHS để kích hoạt nhóm carboxyl, tạo liên kết cộng hóa trị với kháng thể vi khuẩn. Quá trình liên kết kháng thể được tối ưu hóa về nồng độ, thời gian ủ và pH dung dịch để đạt hiệu suất tối đa. Đặc tuyến điện hóa của điện cực biến tính được khảo sát bằng phương pháp CV và EIS trong dung dịch K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6.

IV. Kết quả ứng dụng và triển vọng phát triển

Kết quả thử nghiệm cho thấy cảm biến sinh học điện hóa nano vàng bạc oxide đạt hiệu suất vượt trội trong phát hiện vi khuẩn Salmonella với giới hạn phát hiện 22 CFU/mL, dải làm việc 10^2-10^6 CFU/mL và thời gian phản ứng 25 phút. Cảm biến thể hiện độ chọn lọc cao đối với vi khuẩn mục tiêu, khả năng hoạt động ổn định trong môi trường sinh học phức tạp. Thiết bị đo kiểm được xây dựng theo cấu trúc PoC (Point-of-Care) cho phép kiểm soát quá trình gây bệnh tại chỗ, giảm thiểu chi phí và thời gian chẩn đoán. Kết quả nghiên cứu mở ra triển vọng ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực y tế, đặc biệt là phát hiện nhanh vi khuẩn gây nhiễm trùng bệnh viện. Ngoài ra, công nghệ này có thể mở rộng cho phát hiện các tác nhân gây bệnh khác như virus, nấm.

4.1. Hiệu suất cảm biến trong thử nghiệm thực tế

Trong thử nghiệm thực tế, cảm biến sinh học điện hóa nano vàng bạc oxide được đánh giá trên mẫu bệnh phẩm lâm sàng tại bệnh viện Chợ Rẫy. Kết quả cho thấy cảm biến phát hiện chính xác vi khuẩn Salmonella trong 25 phút với độ nhạy 95% và độ đặc hiệu 98%. Giới hạn phát hiện thấp (22 CFU/mL) cho phép phát hiện sớm vi khuẩn ngay cả khi nồng độ thấp. Cảm biến hoạt động ổn định trong môi trường sinh học phức tạp, không bị ảnh hưởng bởi các thành phần trong mẫu bệnh phẩm như protein, tế bào máu.

4.2. Triển vọng thương mại hóa và nghiên cứu tiếp theo

Triển vọng thương mại hóa cảm biến sinh học điện hóa nano vàng bạc oxide là rất lớn nhờ chi phí sản xuất thấp, hiệu suất cao và khả năng ứng dụng rộng rãi. Công nghệ này có thể được tích hợp vào các thiết bị di động hoặc hệ thống xét nghiệm tự động tại bệnh viện. Nghiên cứu tiếp theo tập trung vào cải thiện độ bền của cảm biến, mở rộng phạm vi phát hiện cho nhiều loại vi khuẩn khác nhau, và phát triển phương pháp sản xuất quy mô công nghiệp. Ngoài ra, việc kết hợp cảm biến với trí tuệ nhân tạo (AI) có thể nâng cao khả năng phân tích dữ liệu và chẩn đoán tự động.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1 tổng quan lý thuyết cơ bản về cảm biến sinh học điện hóa và nhiễm trùng bệnh viện bao gồm: nguyên lý hoạt động và cấu tạo của cảm biến sinh học, vật liệu nano vàng, vật liệu nano lai bạc/graphenen oxít, các phương pháp cố định kháng thể trên bề mặt cảm biến, các kỹ thuật phân tích điện hóa. Hơn nữa, nội dung của chương còn đề cập đến tính cấp thiết và vai trò ứng dụng của cảm biến sinh học và thiết bị cầm tay trong việc phát hiện các vi khuẩn gây bệnh như Salmonella, E.coli, và MRSA gây nhiễm trùng bệnh viện. Luận giải các công trình nghiên cứu đã được công bố gần đây để tham khảo, so sánh làm cơ sở cho các nội dung nghiên cứu của luận án. Cảm biến sinh học và nhiễm trùng bệnh viện 1.

Cảm biến sinh học và cảm biến sinh học điện hóa Cảm biến sinh học được khái niệm là một linh kiện tích hợp độc lập, nhỏ gọn, có khả năng dò tìm sự thay đổi từ các phản ứng sinh học và chuyển đổi thành tín hiệu điện ở đầu ra. Các yếu tố nhận biết sinh học có thể là enzyme, thụ thể, peptide, oligonucleotide, tế bào sống, kháng thể hoặc kháng nguyên [18]. Trong đó, nếu yếu tố nhận biết sinh học là kháng thể hay đoạn kháng thể thì được gọi là cảm biến miễn dịch hay cảm biến dựa trên kháng thể. Cấu tạo của cảm biến sinh học gồm 02 thành phần chính: phần tử nhận biết sinh học (bioreceptor) và bộ chuyển đổi tín hiệu (transducer) [18].

Phần tử nhận biết thực chất là các chất sinh học hoặc các thực thể sinh học, hoạt động như một yếu tố nhận biết, được liên kết với bộ chuyển đổi một cách trực tiếp hoặc gián tiếp. Phần tử sinh học được sử dụng chủ yếu là enzyme, DNA, RNA, kháng thể. Phần tử chuyển đổi có khả năng chuyển tín hiệu không điện từ các tương tác sinh hoá thành tín hiệu điện. Tuỳ thuộc vào phương pháp chuyển đổi tín hiệu mà người ta có thể có các bộ chuyển đổi thành các tín hiệu như điện, quang, nhiệt, từ hay cơ [19],[16],[18].

Nguyên lý hoạt động của cảm biến sinh học được biểu diễn như Hình 1.1: Nguyên lý hoạt động của cảm biến sinh học (A), cảm biến điện hóa (B) Cảm biến sinh học điện hóa (Hình 1.1B) được phát triển dựa trên sự tương tác của các thành phần sinh học được cố định trên bề mặt bộ chuyển đổi với thành phần sinh học cần phân tích sẽ làm thay đổi các tín hiệu sinh hoá ở lân cận bề mặt bộ chuyển đổi [22]. Sự thay đổi các tín hiệu này sẽ được nhận biết bằng bộ chuyển đổi tín hiệu và được xác định bằng các phương pháp đo điện thế, dòng điện, tổng trở 7 hay độ dẫn [23]. Mỗi phần tử nhận biết sinh học khác nhau chỉ cho phép nhận biết được một loại đối tượng đích đặc hiệu [24],[25]. Nếu không có đối tượng phân tích phù hợp với thành phần cảm nhận sinh học thì không có sự thay đổi tín hiệu điện ở đầu ra của cảm biến hoặc chỉ đơn thuần là tạo nhiễu trong quá trình đo.

Cảm biến miễn dịch là một loại cảm biến sinh học trên cơ sở kháng thể [26]. Tuy nhiên, hiểu theo nghĩa đầy đủ hơn thì cảm biến miễn dịch là một loại cảm biến sinh học được phát triển trên cơ sở phản ứng đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể. Trong đó, kháng thể hay phức hợp gắn kháng thể hoặc kháng nguyên được lựa chọn để cố định lên bề mặt phần tử chuyển đổi và đóng vai trò là yếu tố nhận biết sinh học (phần tử dò) nhằm phát hiện phần tử kháng nguyên còn lại (phần tử đích) [27].2: Công trình công bố quốc tế giai đoạn 2009-2019 liên quan đến cảm biến sinh học (A), cảm biến miễn dịch (B) Tra cứu trên trang “website: www.com”, nghiên cứu sinh đã tổng hợp phân tích mối liên hệ trong 10 năm (2009-2019) từ những công trình nghiên cứu công bố quốc tế liên quan đến cảm biến sinh học. Với từ khóa “Biosensor” cảm biến sinh học đã có 92.169 công trình công bố được tìm thấy (Hình 1.2 A), với từ khóa “Immunosensor” cảm biến miễn dịch có kết quả tương ứng là 9.798 công trình, tăng nhanh trong 3 năm trở lại đây (Hình 1.

Kết quả cho thấy sự quan tâm của các nhà khoa học trong việc nghiên cứu, tìm kiếm những phương pháp nghiên cứu mới nhằm dần thay thế các phương pháp truyền thống trong việc phát hiện, chẩn đoán các tác nhân gây bệnh nói riêng và ứng dụng trong việc nâng cao chất lượng cuộc sống cho con người như kiểm soát môi trường, bệnh tật lây nhiễm, phát hiện sớm các mầm bệnh nguy hiểm…trong đó, cảm biến sinh học điện hóa sẽ được kỳ vọng phát triển trong nhiều năm tới nhằm dần hoàn toàn thay thế các phương pháp phát hiện vi khuẩn truyền thống [28]. Thị trường cảm biến sinh học trên toàn thế giới đã đạt tới 11.4 tỷ USD vào năm 2018 [29]. Trong lĩnh vực y tế dự phòng và chăm sóc sức khỏe, cảm biến sinh học được xác định là phương pháp phát hiện, kiểm tra, chẩn đoán sớm dịch bệnh. Trong đó, cảm biến sinh học điện hóa được chứng minh là thiết bị phân tích có triển vọng lớn để thay thế một phần hay toàn phần những thiết bị và phương pháp chẩn đoán truyền thống trong các phòng 8 thí nghiệm nhằm phát hiện nhanh, chính xác các tác nhân gây nhiễm trùng bệnh viện [30],[31],[32],[33].

Ngoài ra cảm biến điện hóa còn được ứng dụng ở nhiều lĩnh vực khác nhau như: kiểm soát ô nhiễm môi trường [34], an toàn thực phẩm[33],[35], chẩn đoán các tác nhân gây ung thư [7]. Tình hình nghiên cứu cảm biến sinh học trong và ngoài nước Các phương pháp phân tích sinh học truyền thống đang được sử dụng để chẩn đoán có kết quả phân tích chính xác và rất tin cậy. Tuy nhiên, những phương pháp này (PCR, ELISA…) là những phương pháp phân tích phức tạp đòi hỏi kỹ thuật viên có tay nghề cao, các trang thiết bị và phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn và được đặt ở các trung tâm phân tích, nghiên cứu tập trung. Yêu cầu các sinh phẩm và hóa chất đặc hiệu khi thực hiện quá trình phân tích.

Các phương pháp truyền thống trong quá trình phân tích đều mất hàng giờ, hàng ngày để thực hiện, đồng thời các thiết bị chẩn đoán, phân tích được khuyến cáo không được di chuyển khỏi phòng thí nghiệm để đảm bảo tính chính xác và mức độ an toàn sinh học [36],[37]. Đây là lý do cho thấy cần thiết nghiên cứu, tìm hiểu các phương pháp mới trong trường hợp thực hiện các chiến dịch phân tích lưu động. Cảm biến điện hóa là một trong những phương pháp với mục đích nhằm dần bổ sung hoặc thay thế để khắc phục những hạn chế của phương pháp truyền thống. Ưu điểm của thiết bị này là nhỏ gọn, có thời gian phân tích nhanh, độ nhạy cao, chi phí thấp và đặc biệt là khả năng linh động của thiết bị [6],[67],[87].

Cảm biến sinh học nói chung và cảm biến sinh học điện hóa nói riêng đang là hướng nghiên cứu của các nhà khoa học trong và ngoài nước. Sự kết hợp điện cực SPE cacbon và ứng dụng của vật liệu nano, công nghệ điện tử, vật lý và sinh học đã mang lại những thành công ban đầu trong quá trình chế tạo cảm biến sinh học điện hóa, quá trình này đã dần tiếp cận ứng dụng và đáp ứng nhu cầu của thị trường hiện nay. So với các phương pháp truyền thống, khả năng lưu động, tiết kiệm năng lượng và thời gian phân tích nhanh là một ưu thế chính của cảm biến sinh học điện hóa [40].1 Tổng hợp một số kết quả nghiên cứu công bố quốc tế liên quan đến luận án.1: Tổng hợp một số kết quả nghiên cứu trên thế giới về cảm biến điện hóa phát hiện vi khuẩn Salmonella Thời Tài liệu Vật liệu biến Phương pháp Giới hạn gian Dải làm việc tham tính dò tìm phát hiện phát khảo hiện Hạt nano Thay đổi màu 96% and 97% // 15 phút [41] vàng sắc Hạt nano Khuếch đại 7,4× 108-7,4 7,4 × 101 120 phút [42] Fe3O4 HCR ×101 CFU/mL CFU/mL Màng vàng CV và DPV 5-30 M 0,208 M 60 phút [43] 9 AuNPs/ MBs DPV 103 - 106 143 90 phút [44] tế bào/ mL tế bào/mL GCE DPV và EIS 10 - 400 pM 2,1 pM // [45] AuNPs DPV 1,0 × 10-11-0,5 50 (±2,1) 60 phút [46] × 10-8 M pM Hạt vàng liên DPV 10,0-100,0 7,7 72 phút [47] kết kháng thể tế bào mL-1 tế bào/mL Ab2 và hạt từ liên kết kháng thể Ab1 Trong thời gian gần đây, Việt Nam đã có nhiều nhà khoa học và các nhóm nghiên cứu về cảm biến sinh học đáng được ghi nhận. Đầu tiên kể đến là nhóm nghiên cứu cảm biến sinh học thuộc trường Đại học Bách Khoa Hà Nội với định hướng của các cảm biến sinh học dựa trên cấu trúc vi điện cực để phát hiện lượng dư thuốc trừ sâu, phát hiện sự chuyển đổi gen trong cây trồng [48].

Trong kỹ thuật y sinh, bước đầu đã phối hợp với Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương đã chế tạo được thiết bị chẩn đoán nhằm phát hiện nhanh vi rút viêm não Nhật Bản [49]. Trong lĩnh vực phát hiện vi khuẩn gây bệnh, TS. Nguyễn Thị Thủy và cộng sự đã chế tạo thành công bộ cảm biến điện hóa trên cơ sở cấu trúc FET biến tính MWNCTs phát hiện vi khuẩn E. Trần Thị Luyến và cộng sự đã chế tạo thành công bộ cảm biến DNA tích hợp với hệ vi lưu, bình phản ứng mini trên cơ sở biến tính Ppy để phát hiện vi rút Newcastle kết quả cho giới hạn phát hiện 102 EID 50/mL trong 60 phút [51].2: Tổng hợp một số kết quả nghiên cứu cảm biến sinh học điện hóa ở Việt Nam Tài Vật liệu biến Phương Giới hạn Thời gian liệu Dải làm việc tính/ tác nhân pháp dò tìm phát hiện phát hiện tham khảo APTES-GA- Đo thế vi sai 25 ng/mL - 10 ng/mL 20 phút [49] PrA/ 1g/mL Vi rút VNNB MWCNTs/ Đo dòng 0,5 pM - 1 1 nM 10 phút [50] E.coli O157 :H7 nM Polyaniline/ Đo thế vi sai 5 ng/mL-15 10 ng/mL // [52] Kháng nguyên ng/mL JEV Polyaniline- CV 10 nM-50 490 pM // [53] MWCNTs/ nM Vi rút HPV 10 Dây nano Pt/ CV 2 mM // [54] Glucose Màng Ppy/ CV 2 nM-17 nM 2 nM // [55] Vi rút Herpes Dây Ppy/ CV 20 pM-20 10 pM // [51] Vi rút nM Newcastle Bên cạnh đó, các nhóm nghiên cứu khác cũng đạt được nhiều kết quả tốt, thu hút được sự quan tâm của quốc tế như các nhóm thuộc Trung tâm nghiên cứu thuộc phòng thí nghiệm nano của trường Đại học Quốc gia TP.