Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ dược học của tác giả Nguyễn Thị Ngọc Hà, chuyên ngành Công nghệ Dược phẩm và Bào chế thuốc (mã số 62720402), thực hiện tại Trường Đại học Dược Hà Nội dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Nguyễn Đình Luyện và TS. Nguyễn Văn Hân (bảo vệ năm 2016), tập trung vào đề tài: "Nghiên cứu xây dựng quy trình tổng hợp levothyroxin mononatri và liothyronin mononatri từ L-tyrosin".

Về tính cấp thiết, levothyroxin (T4) và liothyronin (T3) là hai hormon chính do tuyến giáp tiết ra, đóng vai trò tăng cường chuyển hóa cơ bản và kích thích tăng trưởng. Thiếu hụt các hormon này gây ra bệnh suy giáp với các biểu hiện mệt mỏi, tăng cân, vận động chậm chạp, giảm trí nhớ, phù niêm mạc, suy tim và có thể dẫn đến hôn mê. Số liệu dịch tễ học được dẫn trong văn bản cho thấy khoảng 3% đến 5% dân số Việt Nam bị suy giáp. Với quy mô dân số khoảng 90 triệu người tại thời điểm nghiên cứu và liều điều trị duy trì trung bình 100 µg/ngày, nhu cầu tiêu thụ levothyroxin mononatri ước tính khoảng 98 kg/năm. Đa số bệnh nhân suy giáp phải sử dụng thuốc bổ sung hormon suốt đời. Tuy nhiên, toàn bộ nguồn nguyên liệu phục vụ sản xuất thuốc trong nước đều phải nhập khẩu.

Khoảng trống nghiên cứu được tác giả xác định là: các quy trình tổng hợp levothyroxin mononatri và liothyronin mononatri trên thế giới tuy đã được công bố nhưng khó áp dụng trực tiếp tại Việt Nam do sử dụng các hóa chất trung gian đắt tiền, tác nhân phản ứng độc hại (như kali cyanid), phản ứng qua nhiều giai đoạn racemic hóa đòi hỏi kỹ thuật phân lập đồng phân quang học phức tạp, hoặc sử dụng các dung môi chứa clo gây ô nhiễm môi trường. Việc nghiên cứu một quy trình phù hợp với điều kiện trang thiết bị và hóa chất trong nước nhằm chủ động nguồn nguyên liệu làm thuốc là yêu cầu thực tiễn, bám sát định hướng của Quyết định số 61/2007/QĐ-TTg ngày 07/05/2007 của Thủ tướng Chính phủ phê duyệt Chương trình nghiên cứu khoa học công nghệ trọng điểm quốc gia phát triển công nghiệp hóa dược đến năm 2020.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án gồm hai nội dung được đánh số cụ thể:

  1. Xây dựng được quy trình tổng hợp levothyroxin mononatri và liothyronin mononatri từ L-tyrosin quy mô phòng thí nghiệm.
  2. Đánh giá được độ ổn định và độc tính cấp của sản phẩm.

Đối tượng nghiên cứu là levothyroxin mononatri, liothyronin mononatri, nguyên liệu ban đầu L-tyrosin và hệ thống các hợp chất trung gian trong quá trình tổng hợp (3,5-diiodo-L-tyrosin, N-acetyl-3,5-diiodo-L-tyrosin ethyl ester, 3,5-dinitro-L-tyrosin, 3,5-diiodo-L-thyronin).

Phạm vi nghiên cứu được thực hiện ở quy mô thực nghiệm phòng thí nghiệm tại Bộ môn Công nghiệp Dược và Bộ môn Hóa Đại cương Vô cơ thuộc Trường Đại học Dược Hà Nội; phân tích cấu trúc phối hợp tại Viện Hóa học và Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam). Thời gian theo dõi độ ổn định thực hiện theo các phép thử lão hóa cấp tốc và dài hạn; thử nghiệm độc tính cấp thực hiện trên chuột nhắt trắng trong thời gian quan sát 72 giờ và 7 ngày.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Tổng quan tài liệu của luận án hệ thống hóa các nguồn tiếp cận sản xuất levothyroxin và liothyronin trong lịch sử cũng như các thành tựu tổng hợp hữu cơ hiện đại:

  • Phương pháp chiết xuất từ tuyến giáp động vật: Được ghi nhận qua các công trình sớm của Kendall, Harington và nhiều tác giả khác. Nhược điểm căn bản là nồng độ hormon trong mô tuyến giáp thấp, dịch chiết lẫn nhiều tạp chất protein và lipid, chi phí tinh chế cao, chế phẩm dạng bột giáp dễ nhiễm khuẩn, nấm mốc và khó phân liều chính xác. Do đó, tổng hợp hóa học trở thành con đường bắt buộc.
  • Phương pháp tổng hợp qua trung gian 3,5-diiodo-L-thyronin (T2): Luận án điểm lại các công trình kinh điển:
    • C. Harington và cộng sự (1927): Khởi đầu từ 4-methoxyphenol phản ứng với 1,2,3-triiodo-5-nitrobenzen tạo ether diaryl, khử hóa bằng SnCl2, cyano hóa qua muối diazo với KCN/CuSO4, khử hóa thành aldehyd, ngưng tụ azlacton với acid hippuric, thủy phân và khử hóa tạo hỗn hợp racemic 3,5-diiodo-D,L-thyronin rồi tách đồng phân. Phương pháp này hiệu suất thấp và dùng KCN độc hại.
    • A. David và cộng sự (1950): Phản ứng ghép giữa N-acetyl-3,5-diiodo-L-tyrosin ethyl ester và acid 4-methoxyphenylboronic với xúc tác Cu(OAc)2 trong pyridin, hiệu suất đạt 81%, nhưng acid arylboronic kém bền, đắt tiền và bắt buộc tinh chế qua sắc ký cột.
    • W. Siedel và cộng sự: Đi từ 4-hydroxy-3-iodo-5-nitrobenzaldehyd qua dẫn chất oxazon, khử nitro, diazo hóa, iod hóa, khử bằng HI/P tạo hỗn hợp racemic cần N-formyl hóa để tách đồng phân L-.
    • G. Hillmann (1956) cùng các đóng góp của F. Beringer và J. Plati: Ghép đôi este của L-tyrosin với muối 4,4'-dimethoxydiphenyliodoni halogenid (iodid hoặc bromid) xúc tác Mg hoặc bột Cu, thời gian phản ứng kéo dài (khoảng 80 giờ), hiệu suất trung bình khoảng 50%.
    • J. Chalmers và cộng sự (1949): Nitro hóa L-tyrosin thành dẫn chất 3,5-dinitro, bảo vệ nhóm chức tạo ethyl ester N-acetyl-3,5-dinitro-L-tyrosin, ghép với p-methoxyphenol trong pyridin có mặt p-toluensulfonyl clorid (TsCl) tạo diaryl ether (hiệu suất 68%), khử hóa bằng H2/Pd-C thành diamin, diazo hóa và iod hóa thành dẫn chất 3,5-diiodo, sau đó thủy phân và demethyl hóa thành T2. Nhóm tác giả Bracco (1998) cải tiến phản ứng ester hóa bằng SOCl2 và nâng hiệu suất tạo ether lên 89%, đồng thời tinh chế T4 và T3 qua trung gian muối dinatri trước khi chuyển về muối mononatri.
    • P. Anthony và P. Meltzer: Khử chọn lọc hai nguyên tử iod ở vị trí 3' và 5' của levothyroxin bằng HI 57% và H3PO2 để thu T2. Phương pháp này chỉ phù hợp chuyển hóa T4 thành T3, không giải quyết được nguồn tạo khung từ đầu.
    • Salamonczyk (1993): Đi qua dẫn chất epoxyd 5,7-diiodo-1-oxaspiro-2,5-bicyclooctan-4,7-dien-6-on phản ứng với 3,5-diiodo-L-tyrosin; L. Ginger (1951): Oxy hóa N-acetyl-3,5-diiodo-L-tyrosin ethyl ester bằng oxy phân tử xúc tác MnSO4.
  • Các phương pháp tạo liên kết diaryl ether: Tác giả khảo sát các phản ứng Ullmann cổ điển (xúc tác Cu, CuO, CuCl, CuBr, phối tử TMHD, N,N-dimethylglycin); phản ứng thế ái nhân trên nhân thơm (SNAr) có nhóm rút electron ortho-nitro hoặc tạo phức aren với kim loại chuyển tiếp Rutheni [RuCp+PF6-] (nghiên cứu của Pearson và cộng sự); phản ứng ghép với muối diaryliodoni; phản ứng oxy hóa phenol bằng muối thali (III); và các hệ xúc tác mới CuI kết hợp Fe(acac)3 của Xiaoyan Liu (2010), Ying-Peng Zhang (2014).

Khoảng trống nghiên cứu được luận án giải quyết là: Lựa chọn, so sánh thực nghiệm các hướng tạo liên kết diaryl ether khả thi, thiết lập quy trình từng bước từ L-tyrosin bảo tồn cấu hình L- không qua tách racemic, cải tiến điều kiện phản ứng (loại bỏ dung môi chlor hữu cơ độc hại, kiểm soát phản ứng khử hóa nhóm nitro, diazo hóa và iod hóa), đồng thời tối ưu hóa quy trình tinh chế tạo muối mononatri qua muối dinatri để loại bỏ triệt để tạp chất phân hủy và tạp chất đồng phân.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết của luận án dựa trên hóa học hữu cơ tổng hợp và hóa dược, bao gồm:

  • Lý thuyết phản ứng thế ái nhân trên nhân thơm (SNAr) được hoạt hóa bởi hai nhóm nitro ở vị trí ortho đối với nhóm phenolic ether.
  • Cơ chế bảo vệ và giải phóng nhóm chức trong hóa học amino acid (acetyl hóa nhóm -NH2, ester hóa nhóm -COOH, demethyl hóa liên kết methoxy ether bằng acid hydroiodic).
  • Phản ứng khử hóa chọn lọc nhóm nitro thơm thành nhóm amin bằng hydro phân tử xúc tác kim loại quý (Pd/C).
  • Phản ứng diazo hóa amin thơm bậc một tạo muối diazoni và phản ứng thế nhóm diazo bằng iodid (phản ứng thế ái nhân kiểu Sandmeyer không cần xúc tác đồng).
  • Phản ứng thế ái điện tử của iod vào vòng phenol giàu electron của 3,5-diiodo-L-thyronin tạo dẫn chất triiodo và tetraiodo.
  • Cơ sở hóa lý của quá trình tạo muối: Chuyển đổi cân bằng giữa dạng acid tự do, muối dinatri tan tốt và muối mononatri kết tinh nhằm đạt độ tinh khiết hóa học và dược dụng.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm được triển khai cụ thể:

  • Phương pháp tổng hợp hóa dược: Tiến hành các phản ứng theo chuỗi tổng hợp hữu cơ nhiều bước ở quy mô phòng thí nghiệm; khảo sát ảnh hưởng của dung môi, tỷ lệ tác nhân, nhiệt độ và thời gian phản ứng để tối ưu hóa hiệu suất từng giai đoạn.
  • Phương pháp kiểm tra, giám sát phản ứng và tinh chế: Sử dụng sắc ký lớp mỏng (SKLM) với các hệ dung môi thích hợp để kiểm tra tiến trình phản ứng và độ tinh khiết sơ bộ; tinh chế sản phẩm trung gian và sản phẩm cuối bằng phương pháp kết tinh lại trong các hệ dung môi chọn lọc.
  • Phương pháp phân tích xác định cấu trúc:
    • Đo nhiệt độ nóng chảy trên thiết bị chuyên dụng.
    • Đo góc quay cực riêng để xác nhận cấu hình quang học.
    • Phổ hồng ngoại (IR): Ghi trên máy quang phổ phân tích các nhóm chức đặc trưng (-OH, -NH2, -COOH, -NHAc, C-O-C, C-I).
    • Phổ khối lượng (MS): Ghi phổ ion hóa phun mù điện tử (ESI-MS) hoặc ion hóa va chạm điện tử (EI-MS) xác định khối lượng phân tử [M+H]+, [M+Na]+.
    • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Ghi phổ 1H-NMR và 13C-NMR tại Viện Hóa học (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) nhằm xác định vị trí liên kết và số lượng proton, carbon.
  • Phương pháp kiểm nghiệm chất lượng: Thẩm định chỉ tiêu tiêu chuẩn dược dụng theo Dược điển Anh (BP 2010) đối với levothyroxin mononatri và Dược điển Mỹ (USP 34) đối với liothyronin mononatri, sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) định lượng hoạt chất và tạp chất liên quan.
  • Phương pháp đánh giá độ ổn định: Đánh giá theo hướng dẫn của ICH/Bộ Y tế qua hai phép thử: lão hóa cấp tốc (nhiệt độ 40 ± 2°C, độ ẩm tương đối 75 ± 5%) và dài hạn (nhiệt độ 30 ± 2°C, độ ẩm tương đối 75 ± 5%); ngoại suy tuổi thọ sản phẩm.
  • Phương pháp đánh giá độc tính cấp: Thử nghiệm trên chuột nhắt trắng khỏe mạnh theo hướng dẫn của OECD; theo dõi số lượng chuột chết trong vòng 72 giờ và các biểu hiện trạng thái chung trong 7 ngày.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan về levothyroxin và liothyronin

Chương này trình bày chi tiết về cấu trúc hóa học, tính chất lý hóa, tác dụng sinh học và dược lý của levothyroxin (T4) và liothyronin (T3). T4 có công thức phân tử C15H11I4NO4 (M = 776,87), nhiệt độ nóng chảy 235-236°C; dạng muối T4 mononatri hydrat C15H11I4NNaO4.xH2O (M = 799,0 dạng khan). T3 có công thức C15H12I3NO4 (M = 650,97), nhiệt độ nóng chảy 236-237°C; muối T3 mononatri hydrat C15H12I3NNaO3.xH2O (M = 673,0 dạng khan). Cả hai hoạt chất đều thể hiện tính chất của một alpha-amino acid, hợp chất iod hữu cơ và nhóm -OH phenol.

Chương 1 hệ thống hóa và phân tích ưu, nhược điểm của các phương pháp tổng hợp hóa học T4 và T3 trên thế giới. Tác giả chứng minh rằng con đường tổng hợp qua hợp chất trung gian then chốt 3,5-diiodo-L-thyronin (chất 6, ký hiệu T2) là hướng tiếp cận khả thi nhất. Đi sâu vào phản ứng tạo liên kết diaryl ether – bước mấu chốt quyết định thành bại của toàn bộ quy trình, chương 1 so sánh các giải pháp: phản ứng Ullmann cổ điển dùng xúc tác Cu, phản ứng ghép với acid arylboronic xúc tác Cu(OAc)2, phản ứng thế ái nhân thơm (SNAr) có nhóm kích hoạt ortho-nitro, phức aren của Rutheni [RuCp+PF6-], phản ứng với muối iodoni, và phản ứng oxy hóa phenol. Từ phân tích lý thuyết và điều kiện thực tế trong nước, tác giả lựa chọn định hướng nghiên cứu tổng hợp T2 từ nguồn nguyên liệu sẵn có là L-tyrosin, khảo sát thực nghiệm các phương án tạo liên kết diaryl ether để chọn ra con đường tối ưu.

Chương 2: Nguyên liệu, trang thiết bị và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết danh mục hóa chất, dung môi và thiết bị sử dụng. Hóa chất chính gồm: L-tyrosin, anisol, 4-methoxyphenol, anhydrid acetic, thionyl clorid (SOCl2), acid p-toluensulfonic (TsOH), p-toluensulfonyl clorid (TsCl), pyridin, xúc tác Pd/C 10%, natri nitrit (NaNO2), iod, kali iodid, acid hydroiodic 57% (HI), acid acetic băng, natri hydroxyd, natri carbonat... Trang thiết bị gồm: hệ thống phản ứng hồi lưu, máy cô quay chân không, cân phân tích, tủ sấy, tủ vi khí hậu thử độ ổn định, máy đo điểm nóng chảy Buchi, máy quang phổ hồng ngoại FTIR, máy khối phổ ESI-MS, máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker 500 MHz, hệ thống HPLC sắc ký lỏng hiệu năng cao.

Nội dung nghiên cứu được bố cục thành các phần:

  • Khảo sát thực nghiệm 3 con đường tổng hợp chất trung gian O-methyl-N-acetyl-3,5-diiodo-L-thyronin ethyl ester (chất 5).
  • Nghiên cứu thủy phân và demethyl hóa chất 5 điều chế chất 6 (T2).
  • Nghiên cứu phản ứng iod hóa chất 6 điều chế T4 và T3, tinh chế tạo muối mononatri.
  • Triển khai quy trình lặp lại trên nhiều mẻ để khẳng định tính ổn định.
  • Thẩm định tiêu chuẩn chất lượng sản phẩm theo BP 2010 và USP 34.
  • Theo dõi độ ổn định và đánh giá độc tính cấp trên động vật thí nghiệm.

Chương 3: Thực nghiệm và kết quả nghiên cứu

Chương 3 là phần thực nghiệm trọng tâm của luận án, tập trung giải quyết các bài toán công nghệ cụ thể:

1. Tổng hợp chất trung gian O-methyl-N-acetyl-3,5-diiodo-L-thyronin ethyl ester (chất 5): Tác giả tiến hành khảo nghiệm 3 phương pháp khác nhau để so sánh hiệu quả:

  • Phương pháp 1 (phương pháp mới ứng dụng phản ứng tạo ether Ullmann): Điều chế N-acetyl-3,5-diiodo-L-tyrosin ethyl ester (chất 4) từ L-tyrosin qua 3 bước (iod hóa, N-acetyl hóa và ester hóa), sau đó thực hiện phản ứng ghép đôi Ullmann giữa chất 4 và 4-methoxyphenol. Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng (xúc tác CuI, Cu2O, hệ CuI/Fe(acac)3, base K2CO3, Cs2CO3, dung môi DMF, NMP) được trình bày tại Bảng 3.1. Tuy nhiên, hiệu suất tạo ether ở phương pháp này thấp, khó tinh chế do sự cản trở không gian của hai nguyên tử iod ở vị trí ortho.
  • Phương pháp 2 (theo con đường dẫn chất nitro của J. Chalmers cải tiến):
    • Nitro hóa L-tyrosin bằng hỗn hợp HNO3/H2SO4 thu được 3,5-dinitro-L-tyrosin (chất 25).
    • N-acetyl hóa bằng Ac2O trong môi trường kiềm tạo 3,5-dinitro-N-acetyl-L-tyrosin (chất 34).
    • Ester hóa nhóm carboxyl của chất 34 với ethanol dùng tác nhân SOCl2 tạo 3,5-dinitro-N-acetyl-L-tyrosin ethyl ester (chất 26) cho hiệu suất cao hơn hẳn so với xúc tác TsOH truyền thống.
    • Phản ứng ghép tạo ether giữa chất 26 và p-methoxyphenol trong pyridin có mặt TsCl tạo 3,5-dinitro-O-(p-methoxyphenyl)-N-acetyl-L-tyrosin ethyl ester (chất 27). Hiệu suất các mẻ dao động ổn định (Bảng 3.10).
    • Khử hóa chất 27 bằng H2 xúc tác Pd/C 10% tạo dẫn chất 3,5-diamino (chất 28). Khảo sát dung môi khử hóa (Bảng 3.2, Bảng 3.11) cho thấy hỗn hợp ethanol - ethyl acetat cho hiệu suất chuyển hóa tối ưu.
    • Diazo hóa chất 28 bằng NaNO2 trong môi trường acid, sau đó cho phản ứng thế ái nhân với dung dịch KI/I2 (KI3) tạo thành hợp chất diiodo 5 (Bảng 3.12).
  • Phương pháp 3 (theo con đường muối iodoni của G. Hillmann): Điều chế muối 4,4'-dimethoxydiphenyliodoni iodid (chất 33) hoặc bromid (chất 24) từ anisol, sau đó phản ứng với chất 4. Quá trình tổng hợp muối iodoni có hiệu suất thấp (11-44%), phản ứng ghép cần thời gian dài, hiệu suất chỉ đạt khoảng 50%.

Từ kết quả so sánh, luận án chọn phương pháp dẫn chất nitro cải tiến làm quy trình chuẩn để triển khai.

Bảng tổng hợp so sánh ba con đường tạo hợp chất trung gian diaryl ether trong luận án:

Tiêu chí so sánh Con đường 1 (Ullmann cải tiến) Con đường 2 (Dẫn chất nitro - Chalmers) Con đường 3 (Muối iodoni - Hillmann)
Nguyên liệu ghép Chất 4 + 4-methoxyphenol Chất 26 + p-methoxyphenol Chất 4 + Muối iodoni (24/33)
Tác nhân / Xúc tác CuI, Cu2O hoặc CuI/Fe(acac)3 TsCl trong pyridin Bột Mg hoặc bột Cu
Điều kiện phản ứng Nhiệt độ cao (120-135°C), 12-24 giờ Nhiệt độ 60-70°C, kiểm soát môi trường base Hồi lưu trong methanol, 80 giờ
Hiệu suất giai đoạn ghép Thấp, nhiều sản phẩm phụ Cao (khoảng 85 - 89%) Trung bình (~50%)
Độ phức tạp tinh chế Phải tách qua cột sắc ký Kết tinh lại trong dung môi hữu cơ Chiết rửa phức tạp, hiệu suất thu hồi thấp
Tính khả thi triển khai Khó mở rộng quy mô Ổn định, nguyên liệu dễ tìm, dễ kiểm soát Hiệu suất tổng hợp muối iodoni ban đầu thấp

2. Tổng hợp 3,5-diiodo-L-thyronin (chất 6 - T2): Demethyl hóa và đồng thời thủy phân giải phóng nhóm bảo vệ N-acetyl và ethyl ester của chất 5 bằng cách đun hồi lưu trong dung dịch acid hydroiodic (HI 57%) và acid acetic băng (AcOH). Kết quả phản ứng đạt hiệu suất cao, sản phẩm kết tinh ổn định (Bảng 3.13).

3. Tổng hợp và tinh chế levothyroxin mononatri (T4 Na): Thực hiện phản ứng iod hóa T2 với tác nhân iod hóa (I2/KI) theo tỷ lệ mol thích hợp (khoảng 2 đương lượng I2) trong môi trường amin (methylamin hoặc ethylamin). Để loại bỏ các tạp chất T2 chưa phản ứng và tạp chất triiodo, luận án áp dụng quy trình tinh chế tạo muối dinatri tan tốt trong dung dịch kiềm, lọc loại tạp không tan, sau đó acid hóa về dạng acid tự do rồi tạo muối mononatri bằng dung dịch Na2CO3 bão hòa. Hiệu suất và độ tinh khiết các mẻ được ghi nhận chi tiết tại Bảng 3.14.

4. Tổng hợp và tinh chế liothyronin mononatri (T3 Na): Tiến hành iod hóa T2 với 1 đương lượng I2/KI trong dung môi base amin. Quá trình kiểm soát tỷ lệ mol nghiêm ngặt để hạn chế phản ứng tạo T4. Sản phẩm cũng được tinh chế qua quy trình chuyển dịch muối dinatri về mononatri tương tự (Bảng 3.15).

5. Kiểm tra chất lượng, độ ổn định và độc tính cấp:

  • Kiểm nghiệm chất lượng: Ba mẻ sản phẩm T3 Na được kiểm tra đạt toàn bộ các chỉ tiêu theo USP 34 (Bảng 3.16); ba mẻ sản phẩm T4 Na đạt đầy đủ tiêu chuẩn theo BP 2010 (Bảng 3.17) về cảm quan, độ tan, định tính, độ trong, tạp chất liên quan và hàm lượng hoạt chất (đạt khoảng 97,0 - 102,0%).
  • Thử nghiệm độ ổn định: Các bảng số liệu lão hóa cấp tốc (Bảng 3.18 đến 3.20 cho T4 Na; Bảng 3.24 đến 3.26 cho T3 Na) và dài hạn (Bảng 3.21 đến 3.23 cho T4 Na; Bảng 3.27 đến 3.29 cho T3 Na) cho thấy các chỉ tiêu về ngoại quan, hàm lượng và tạp chất liên quan thay đổi trong giới hạn cho phép. Đồ thị ngoại suy tuổi thọ (Hình 3.12, 3.13) xác định tuổi thọ của cả hai hoạt chất đạt trên 24 tháng.
  • Thử nghiệm độc tính cấp: Kết quả theo dõi chuột nhắt trắng uống liều thử nghiệm cao nhất (Bảng 3.30 và 3.31) ghi nhận 0/10 chuột chết sau 72 giờ và toàn bộ chuột phát triển bình thường sau 7 ngày, chứng minh nguyên liệu có độ an toàn cấp tính cao.

Chương 4: Khẳng định cấu trúc

Chương 4 tập trung giải thích cơ chế các phản ứng hóa học và biện giải dữ liệu phổ để khẳng định cấu trúc các hợp chất trung gian và hai sản phẩm cuối:

  • Cơ chế phản ứng: Làm sáng tỏ cơ chế phản ứng ester hóa với SOCl2 (Hình 4.2), cơ chế thế ái nhân SNAr tạo ether diaryl (Hình 4.1, Hình 4.3), cơ chế demethyl hóa và cắt đứt liên kết ester, amid bằng acid mạnh HI (Hình 4.4), cơ chế iod hóa thế ái điện tử vòng thơm tạo T3, T4 (Hình 4.5) và cơ chế chọn lọc tạo muối mononatri qua trung gian dinatri (Hình 4.6).
  • Dữ liệu phổ hồng ngoại (IR): Xác định các đỉnh hấp thụ đặc trưng: liên kết C-O ether của chất 5 xuất hiện rõ nét (Hình 4.7); nhóm NH3+ và COO- dạng lưỡng cực của chất 6 (Hình 4.8); các nhóm NH2, C=O carboxylat và dao động biến dạng của liên kết C-I trên phổ đồ T4 Na (Hình 4.9). Dữ liệu chi tiết tổng hợp tại Bảng 3.6.
  • Dữ liệu phổ khối lượng (MS): Ghi nhận các pic ion phân tử đặc trưng [M+H]+ và [M+Na]+ (Hình 4.10, Bảng 3.7) hoàn toàn trùng khớp với khối lượng phân tử tính toán của từng dẫn chất trung gian và sản phẩm cuối.
  • Dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR và 13C-NMR): Phân tích và gán đầy đủ độ chuyển dịch hóa học (ppm), hằng số tương tác spin-spin (J, Hz) của từng proton trên khung thơm và mạch nhánh amino acid (Hình 4.11, Hình 4.12, Bảng 3.8 và Bảng 3.9). Kết quả NMR khẳng định phân tử không bị biến đổi cấu hình tại carbon bất đối xứng, giữ nguyên cấu hình đồng phân quang học (2S) tương ứng với dãy L- tự nhiên.

Kết quả và những đóng góp mới

Luận án tự nêu các đóng góp mới về mặt khoa học lý luận và thực tiễn công nghệ:

  1. Đóng góp về mặt khoa học lý luận:
    • Đã khảo sát, phân tích và so sánh thực nghiệm một cách có hệ thống 3 con đường tạo liên kết diaryl ether trong tổng hợp hormon tuyến giáp, chứng minh tính ưu việt của con đường qua dẫn chất dinitro-L-tyrosin cải tiến đối với các hợp chất có nhóm thế cản trở không gian lớn.
    • Làm sáng tỏ quy luật phản ứng iod hóa chọn lọc trên nhân thơm của 3,5-diiodo-L-thyronin và cơ chế làm sạch tạp chất thông qua chu trình chuyển dịch muối "dinatri - dạng acid - mononatri".
    • Cung cấp bộ dữ liệu phổ nghiệm hoàn chỉnh (IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR) phục vụ định danh chính xác các chất trung gian và hai dược chất T3 Na, T4 Na.
  2. Đóng góp về mặt thực tiễn:
    • Xây dựng thành công quy trình tổng hợp levothyroxin mononatri và liothyronin mononatri từ nguồn nguyên liệu ban đầu L-tyrosin ở quy mô phòng thí nghiệm, quy trình có tính lặp lại tốt, sử dụng hóa chất và dung môi dễ tiếp cận, không dùng các hóa chất cực độc như KCN.
    • Sản phẩm tổng hợp được kiểm nghiệm đạt tiêu chuẩn chất lượng theo các dược điển quốc tế hiện hành (BP 2010 đối với levothyroxin natri và USP 34 đối với liothyronin natri).
    • Đã chứng minh sản phẩm tổng hợp có độ ổn định cao, xác định tuổi thọ ngoại suy đạt trên 2 năm và an toàn về mặt độc tính cấp trên động vật thực nghiệm, tạo tiền đề công nghệ cho việc tự chủ nguồn nguyên liệu hóa dược trong nước.

Về mặt kiến nghị, tác giả đề xuất:

  • Tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện và nâng quy mô quy trình tổng hợp lên quy mô pilot (quy mô xưởng thử nghiệm).
  • Nghiên cứu các giải pháp thu hồi, tái sử dụng dung môi hữu cơ và lượng iod dư thừa nhằm giảm chi phí sản xuất và giảm tải tác động môi trường.
  • Triển khai nghiên cứu ứng dụng nguyên liệu tổng hợp được vào bào chế các dạng thuốc viên nén phục vụ điều trị lâm sàng.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Căn cứ vào nội dung và phạm vi nghiên cứu được trình bày trong luận án, các hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp theo bao gồm:

  • Hạn chế:
    • Toàn bộ nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm, chưa tiến hành thử nghiệm ở quy mô sản xuất bán công nghiệp để đánh giá các thông số truyền nhiệt, khuấy trộn và động học phản ứng mẻ lớn.
    • Quy trình tổng hợp trải qua nhiều giai đoạn trung gian; giai đoạn demethyl hóa vẫn phải sử dụng acid hydroiodic (HI) nồng độ cao ở điều kiện đun hồi lưu kéo dài, đây là tác nhân có tính ăn mòn thiết bị và chi phí tương đối lớn.
    • Luận án chưa khảo sát sâu phương án thu hồi triệt để lượng iod dư ở các khâu iodo hóa để tối ưu hóa bài toán kinh tế kỹ thuật.
  • Hướng nghiên cứu tiếp:
    • Mở rộng quy mô tổng hợp lên cấp độ pilot từ 100g đến 1kg/mẻ nhằm thẩm định độ tin cậy và hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất công nghiệp.
    • Khảo sát các hệ tác nhân mới thay thế HI trong phản ứng demethyl hóa để tăng tính thân thiện môi trường và giảm chi phí thiết bị.
    • Tiến hành các thử nghiệm dược lý tiền lâm sàng chuyên sâu và xây dựng hồ sơ tiêu chuẩn cơ sở phục vụ đăng ký nguyên liệu làm thuốc.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo có giá trị trong các lĩnh vực:

  • Đối với nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên chuyên ngành Hóa dược, Hóa hữu cơ, Công nghệ Dược phẩm: Luận án cung cấp phương pháp luận thực nghiệm chặt chẽ về chuỗi phản ứng bảo vệ nhóm chức, phản ứng tạo liên kết diaryl ether khó, phản ứng diazo hóa - iod hóa, và phương pháp phân tích, quy gán tín hiệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR), phổ khối lượng (MS) cho các phân tử hữu cơ bất đối xứng mang nhiều nguyên tử iod. Phần tổng quan về phản ứng tạo ether diaryl (Chương 1) và phần biện giải phổ (Chương 4) là tài liệu học thuật rất hữu ích.
  • Đối với các viện nghiên cứu và doanh nghiệp sản xuất hóa dược: Quy trình chi tiết từng bước, thông số dung môi, tỷ lệ mol tác nhân, phương pháp kết tinh làm sạch muối mononatri qua dinatri ở Chương 3 là cơ sở kỹ thuật trực tiếp để các kỹ sư công nghệ chuyển giao và phát triển quy trình sản xuất nguyên liệu thuốc điều trị suy giáp.
  • Đối với người làm công tác quản lý và kiểm nghiệm dược phẩm: Các bảng dữ liệu thẩm định tiêu chuẩn chất lượng theo BP 2010 và USP 34, cùng phương pháp đánh giá độ ổn định và độc tính cấp là tài liệu đối sánh tin cậy trong xây dựng tiêu chuẩn cơ sở và kiểm soát chất lượng nguyên liệu hormon tuyến giáp lưu hành trên thị trường.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao tác giả lựa chọn nguyên liệu khởi đầu là L-tyrosin thay vì chiết xuất từ tuyến giáp động vật hay đi từ các chất nhân thơm đơn giản khác? L-tyrosin là một alpha-amino acid sẵn có, giá thành rẻ, có thể sản xuất bằng phương pháp thủy phân các nguồn keratin phong phú trong nước (như sừng, tóc). Sử dụng L-tyrosin giúp giữ nguyên khung carbon và cấu hình quang học dạng L- (tâm bất đối xứng S), tránh được giai đoạn tách hỗn hợp racemic phức tạp vốn gây suy giảm hiệu suất nghiêm trọng ở các phương pháp đi từ nhân thơm đơn giản (như phương pháp của C. Harington hay W. Siedel). So với chiết xuất từ tuyến giáp động vật, con đường tổng hợp hóa học từ L-tyrosin loại bỏ hoàn toàn nguy cơ nhiễm khuẩn, nấm mốc, lẫn tạp chất protein và khắc phục được khó khăn khi phân liều.

2. Trong ba con đường tạo hợp chất diaryl ether được khảo sát thực nghiệm, tại sao luận án lại chọn con đường qua dẫn chất nitro theo Chalmers? Khảo sát thực nghiệm của luận án cho thấy: phản ứng Ullmann cổ điển (con đường 1) giữa N-acetyl-3,5-diiodo-L-tyrosin ethyl ester với 4-methoxyphenol cho