Tổng quan luận án

Nấm mối (Termitomyces sp.) là loại nấm ăn và nấm dược liệu có giá trị dinh dưỡng cao, chứa đầy đủ các acid amin thiết yếu, khoáng chất cùng nhiều hoạt chất sinh học có tác dụng chống oxy hóa, kháng khuẩn và hỗ trợ miễn dịch. Trong tự nhiên, nấm mối sống cộng sinh bắt buộc với các loài mối thuộc phân họ Macrotermitinae (họ Termitidae); quả thể của nấm chỉ hình thành từ các tổ mối ngầm dưới đất. Do đặc điểm sinh học và cơ chế biến dưỡng đặc thù, cho đến nay nấm mối vẫn chưa thể nhân tạo hóa để sản xuất quả thể theo phương pháp nuôi trồng truyền thống. Bên cạnh đó, điều kiện thời tiết bất lợi và tác động của ô nhiễm môi trường do hoạt động sản xuất nông nghiệp đã làm cho sản lượng nấm mối ngoài tự nhiên suy giảm đáng kể. Trong bối cảnh thành phần sinh hóa cơ bản của hệ sợi nấm (mycelium) và quả thể ở nhiều loài nấm có sự tương đồng lớn, việc nghiên cứu công nghệ lên men chìm (submerged fermentation) nhằm thu nhận sinh khối hệ sợi nấm mối được xác định là hướng tiếp cận kỹ thuật để chủ động nguồn nguyên liệu ổn định.

Khoảng trống nghiên cứu được luận án giải quyết là việc thiếu hụt một quy trình công nghệ hoàn chỉnh, có khả năng nhân giống dịch thể đa cấp và vận hành ổn định trên hệ thống thiết bị nuôi cấy sinh học (Bioreactor) quy mô 60 lít tại Việt Nam, đồng thời chưa có đầy đủ dữ liệu định lượng về thành phần dinh dưỡng, hoạt tính sinh học và mức độ an toàn độc tính của sinh khối Termitomyces clypeatus.

Mục tiêu nghiên cứu: Tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy nấm mối được phân lập từ tự nhiên bằng hệ thống lên men sinh học và đánh giá thành phần dinh dưỡng cũng như hoạt tính sinh học của dịch và cao sinh khối nấm mối.

Nội dung nghiên cứu:

  1. Phân lập, định danh và giữ giống nấm mối.
  2. Khảo sát môi trường nhân giống nấm mối cấp 1, cấp 2 dạng dịch thể.
  3. Nghiên cứu quy trình công nghệ sản xuất sinh khối hệ sợi nấm mối trong Bioreactor 60 lít.
  4. Phân tích thành phần dinh dưỡng và khảo sát hoạt tính sinh học của sinh khối hệ sợi nấm mối.
  5. Sản xuất và thử nghiệm độc tính tế bào, độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của sản phẩm cao sinh khối.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Giống nấm mối thuần khiết được phân lập từ nguồn nấm mối mọc tự nhiên ở Việt Nam và các điều kiện nuôi cấy dịch thể hệ sợi nấm mối.
  • Phạm vi nghiên cứu: Nguồn mẫu nấm mối được thu thập tại khu vực phía Nam (trong đó có tỉnh Bình Dương); quy trình công nghệ sản xuất sinh khối hệ sợi được thiết lập và thử nghiệm trên hệ thống nuôi cấy sinh học (Bioreactor) thể tích 60 lít.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã tổng thuật hệ thống các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế liên quan đến phân loại học, chu trình sinh học, quan hệ cộng sinh, thành phần hóa học, hoạt tính sinh học và công nghệ nuôi cấy chìm của chi nấm mối (Termitomyces):

  • Phân loại học và hình thái học: Tác giả điểm lại hệ thống phân loại sinh giới từ Linnaeus (1753), Whittaker (1969) đến Woese (1977); vị trí phân loại của chi Termitomyces thuộc họ Lyophyllaceae, bộ Agaricales, lớp Basidiomycetes (Trịnh Tam Kiệt, 2011, 2012, 2013, 2014; Lê Xuân Thám, 2013). Đặc điểm hình thái quả thể của 25 loài nấm mối được tổng hợp từ các nghiên cứu quốc tế như Tibuhwa et al. (2010), Pegler & Vanhaecke (1994), Karun & Sridhar (2013), Otieno (1968), Wei et al. (2006).
  • Mối quan hệ cộng sinh giữa mối và nấm mối: Các giả thuyết và cơ chế tương tác dinh dưỡng được phân tích dựa trên công trình của Grassé & Noirot (1958), Martin & Martin (1978), Rouland (1991), Crosland et al. (1994), Aanen & Eggleton (2005), Nobre & Aanen (2012), Yang et al. (2012), và Zeleke et al. (2013). Các nghiên cứu ghi nhận mối ăn nốt nấm chứa hệ sợi và bào tử vô tính, nấm cung cấp các enzyme phân giải (như xylanase) hỗ trợ tiêu hóa chất xơ.
  • Giá trị dinh dưỡng và dược tính: Luận án dẫn chứng các công bố về hàm lượng protein, carbohydrate, acid amin và khoáng chất của Termitomyces từ Ogundana & Fagade (1982), Alofe et al. (1996), Mondal et al. (2006), Gbolagade et al. (2006), Zhao et al. (1997), Nakalembe & Kabasa (2013). Về hoạt tính sinh học, tác giả điểm lại các nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hóa (Mau et al., 2004; Pattanayak et al., 2015), tác dụng giảm đau và kháng viêm của dịch chiết T. albuminosus (Lu et al., 2008), khả năng làm lành vết loét dạ dày của dịch chiết giàu polysaccharide từ T. eurhizus (Chatterjee et al., 2013), và khả năng ức chế tế bào ung thư HepG2 của enzyme alkaline phosphatase (AkP) tinh khiết từ T. clypeatus (Majumder et al., 2016).
  • Công nghệ nuôi cấy chìm và hệ thống Bioreactor: Tổng quan các thông số môi trường, nguồn carbon (glucose, maltose, lactose), nguồn nitơ (pepton, yeast extract), khoáng chất (KH2PO4, MgSO4) và các chế độ khuấy, sục khí trong nuôi cấy chìm nấm lớn (Kim et al., 2002; Lin & Sung, 2006; Porras-Arboleda et al., 2009; Elisashvili, 2012). Dẫn chứng các hệ thống Bioreactor quy mô từ 3 lít đến 500 lít đã được ứng dụng trên các loài nấm dược liệu như Agaricus brasiliensis (Zou, 2006), Antrodia camphorata (Shu & Lung, 2004; Yen, 2002), Cordyceps militaris (Mao & Zhong, 2004), Grifola frondosa (Lee et al., 2004; Cui et al., 2006), Inonotus obliquus (Kim et al., 2005), Phellinus gilvus (Hwang et al., 2003).

Vị trí của luận án được xác định là công trình kế thừa các cơ sở lý thuyết về sinh học nấm mối và kỹ thuật nuôi cấy chìm, giải quyết bài toán tối ưu hóa công nghệ nhân giống dịch thể hai cấp và vận hành hệ thống bồn lên men sinh học Bioreactor 60 lít đối với chủng Termitomyces clypeatus phân lập tại miền Nam Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án kết hợp các nguyên lý của công nghệ sinh học vi sinh, sinh học phân tử, kỹ thuật lên men sinh học và độc chất học thực nghiệm:

  • Khung lý thuyết và công cụ phân tử: Nhận diện và định danh nấm ăn/nấm dược liệu dựa trên đặc điểm hình thái kết hợp phân tích trình tự DNA vùng Internal Transcribed Spacer (ITS1, 5S/5.8S, ITS2) trên hệ gen ribosome (rDNA). Xây dựng cây phát sinh loài (phylogenetic tree) bằng phương pháp Maximum Likelihood sử dụng phần mềm MEGA X và đối chiếu dữ liệu với ngân hàng gen NCBI.
  • Phương pháp tối ưu hóa thực nghiệm: Sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng (Response Surface Methodology - RSM), phân tích phương sai (ANOVA) và hồi quy đa biến để đánh giá tương tác giữa các yếu tố thành phần môi trường (nồng độ glucose, pepton, KH2PO4) và các yếu tố vật lý (nhiệt độ, pH ban đầu, tốc độ lắc/khuấy, chế độ sục khí).
  • Quy trình công nghệ nuôi cấy dịch thể:
    • Nhân giống cấp 1: Bình tam giác nuôi lắc.
    • Nhân giống cấp 2: Thiết bị nhân giống trung gian có kiểm soát thông khí.
    • Nuôi cấy Bioreactor 60 lít: Hệ thống bồn nuôi có cánh khuấy cơ học, hệ thống cấp khí vô trùng, kiểm soát pH, bổ sung chất chống tạo bọt (AF), điều khiển nhiệt độ.
  • Phương pháp phân tích hóa sinh và hoạt tính sinh học:
    • Định lượng protein, carbohydrate tổng, ẩm độ và thành phần acid amin bằng phương pháp tiêu chuẩn.
    • Hoạt tính chống oxy hóa in vitro: Đánh giá khả năng trung hòa gốc tự do 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), xác định giá trị IC50.
    • Hoạt tính kháng khuẩn: Phương pháp đục lỗ thạch và xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) trên các chủng vi khuẩn kiểm nghiệm (Bacillus cereus ATCC 11778, Candida albicans ATCC 10231, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Staphylococcus aureus ATCC 6538).
  • Phương pháp đánh giá an toàn sinh học và độc tính:
    • Độc tính tế bào (Cytotoxicity): Phương pháp MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide) trên dòng tế bào gan người bình thường LO-2.
    • Độc tính cấp (Acute toxicity): Thử nghiệm trên chuột theo dõi tỷ lệ sống, biến đổi thể trọng và các chỉ số huyết học sau khi cho uống liều cao.
    • Độc tính bán trường diễn (Subchronic toxicity): Thử nghiệm trên chuột theo dõi dài ngày các chỉ số sinh lý máu (RBC, WBC, HGB, HCT, PLT, MCV, MCH, MCHC, RDW, MPV, PCT, PDW, P-LCR, LYM, MID), chỉ số sinh hóa máu (BUN, Creatinine, AST, ALT, phosphatase kiềm) và giải phẫu vi thể tiêu bản mô học gan, thận.
Nhóm phương pháp Đối tượng / Chỉ tiêu phân tích Kỹ thuật / Công cụ thực hiện
Định danh sinh học 07 chủng nấm mối phân lập Giải trình tự ITS1-5S-ITS2, phần mềm MEGA X (Maximum Likelihood), BLAST NCBI
Tối ưu hóa nuôi cấy Sinh khối khô (g/L) hệ sợi nấm Phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM), phân tích ANOVA, hồi quy đa biến
Lên men quy mô lớn Sinh khối hệ sợi T. clypeatus Hệ thống Bioreactor 60L (kiểm soát pH, DO, nhiệt độ, khuấy, sục khí)
Hoạt tính sinh học Chống oxy hóa, kháng khuẩn Bắt gốc tự do DPPH (IC50), đục lỗ thạch, nồng độ MIC
An toàn sinh học Độc tính tế bào, độc tính cấp và bán trường diễn Khử màu MTT trên tế bào LO-2; thử nghiệm in vivo trên chuột, sinh hóa/huyết học máu

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Giới thiệu

Chương 1 thiết lập cơ sở khoa học và tính cấp thiết của đề tài. Tác giả chỉ rõ giá trị đặc biệt của nấm mối về mặt thực phẩm và dược tính, đồng thời nhấn mạnh rào cản sinh học khi chưa thể nhân tạo hóa quá trình tạo quả thể do mối quan hệ cộng sinh phức tạp với loài mối. Việc suy giảm nguồn nấm mối tự nhiên đặt ra yêu cầu phải nghiên cứu quy trình sản xuất sinh khối hệ sợi bằng công nghệ nuôi cấy dịch thể nhằm tạo nguồn nguyên liệu có chất lượng đồng nhất. Chương này công bố mục tiêu tổng quát, 5 nội dung nghiên cứu cụ thể, phạm vi nghiên cứu tại khu vực phía Nam trên hệ thống Bioreactor 60L, cùng ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án.

Chương 2: Tổng quan tài liệu

Chương 2 cung cấp hệ thống lý luận toàn diện gồm 6 phân mục chính:

  • Khái quát về vị trí phân loại của giới Nấm và chi Termitomyces (họ Lyophyllaceae), chu trình sống của nấm đảm, đặc điểm biến dưỡng dị dưỡng và các điều kiện sinh thái cần thiết (nguồn carbon, nitơ, phospho, kali, vitamin, nhiệt độ, độ ẩm, độ thông khí, pH).
  • Phân tích chi tiết đặc điểm hình thái quả thể của các loài nấm mối (T. clypeatus, T. eurrhizus, T. heimii, T. magoyensis, T. microcarpus, T. robustus, T. umkowaan); tổng hợp bảng phân loại 25 loài nấm mối dựa theo công bố của Tibuhwa et al. (2010).
  • Khảo cứu mối quan hệ cộng sinh bắt buộc giữa nấm mối và mối thuộc phân họ Macrotermitinae; phân tích các giả thuyết về vai trò phân giải lignin, cellulose và xylanase trong tổ mối.
  • Tổng hợp giá trị dinh dưỡng (protein, carbohydrate, khoáng chất Ca, Mg, K, Na, P, Fe, Cu, Zn) và dược tính (kháng khuẩn, chống oxy hóa, chống viêm, làm lành vết loét dạ dày, ức chế tế bào ung thư thông qua enzyme AkP và polysaccharide).
  • Tổng quan về kỹ thuật nuôi cấy chìm (submerged culture) và thiết bị Bioreactor; tổng hợp các nghiên cứu nuôi cấy chìm nấm mối và các loại nấm dược liệu khác (Agaricus, Antrodia, Cordyceps, Grifola, Phellinus).
  • Tình hình nghiên cứu nấm mối trên thế giới và tại Việt Nam; nguyên lý định danh nấm bằng kỹ thuật sinh học phân tử dựa trên vùng gen ITS.

Chương 3: Phương pháp nghiên cứu

Chương 3 trình bày chi tiết địa điểm, thời gian, thiết bị, vật liệu và quy trình triển khai 5 nội dung nghiên cứu:

  • Thu thập mẫu nấm mối tự nhiên, phân lập bào tử và mô nấm thuần khiết trên môi trường thạch; quy trình tách chiết DNA bằng phương pháp CTAB, khuếch đại đoạn gen ITS bằng phản ứng PCR, điện di, giải trình tự và phân tích di truyền.
  • Bố trí các thí nghiệm đơn yếu tố và đa yếu tố (RSM) nhằm xác định môi trường dinh dưỡng (môi trường YESS, PDB bổ sung muối khoáng, nồng độ glucose, pepton, KH2PO4) và điều kiện vật lý (nhiệt độ, pH ban đầu, tốc độ lắc) cho nhân giống cấp 1 và cấp 2.
  • Thiết kế và thông số vận hành bồn nuôi cấy Bioreactor 60 lít; khảo sát ảnh hưởng của nồng độ môi trường dịch thể, tốc độ khuấy, tỷ lệ cấp giống và chế độ sục khí.
  • Phương pháp phân tích thành phần dinh dưỡng của sinh khối thu nhận; phương pháp chiết cao bằng dung môi methanol/ethanol và quy trình thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa (DPPH), hoạt tính kháng khuẩn (MIC).
  • Bố trí thí nghiệm thử nghiệm độc tính tế bào MTT trên tế bào gan người LO-2; bố trí thí nghiệm độc tính cấp và bán trường diễn trên chuột (theo dõi chỉ số sinh lý máu, sinh hóa máu và tiêu bản mô học gan, thận); phương pháp xử lý số liệu bằng phần mềm thống kê chuyên dụng.

Chương 4: Kết quả và thảo luận

Chương 4 công bố toàn bộ dữ liệu thực nghiệm đạt được:

  • Phân lập và định danh: Đã phân lập được 07 chủng nấm mối ký hiệu khác nhau từ tự nhiên. Dựa trên hình thái quả thể, hình thái khuẩn lạc và phân tích trình tự DNA các đoạn ITS1, 5S, ITS2, đã xác định tất cả 07 chủng đều thuộc chi Termitomyces; trong đó có 02 chủng được định danh chính xác đến loài là Termitomyces clypeatus và Termitomyces microcarpus. Cây phát sinh loài xây dựng bằng phương pháp Maximum Likelihood phân nhóm rõ ràng quan hệ di truyền giữa các chủng.
  • Tối ưu hóa môi trường nhân giống cấp 1 và cấp 2:
    • Môi trường nhân giống cấp 1 thích hợp nhất cho sự tích lũy sinh khối T. clypeatus gồm: KH2PO4 (0,1%), pepton (0,2%), glucose (4%), yeast extract (0,1%), MgSO4 (0,015%), thời gian nuôi cấy tối ưu là 20 ngày.
    • Các điều kiện vật lý tối ưu cho nhân giống cấp 1: pH ban đầu 5,0 - 5,5, nhiệt độ 28°C, tốc độ lắc 140 - 150 vòng/phút.
    • Môi trường nhân giống cấp 2: Xác định tỷ lệ cấp giống thích hợp là 10% (v/v) với chế độ sục khí 0,4 v/v/m.
  • Sản xuất sinh khối trong hệ thống Bioreactor 60 lít:
    • Xác định các thông số vận hành tối ưu: Tỷ lệ tiếp giống 5% (v/v), pH môi trường 5,0, chế độ sục khí 0,4 v/v/m, tốc độ khuấy 180 vòng/phút, nhiệt độ 28°C.
    • Sản lượng sinh khối khô thu nhận đạt 6,633 ± 0,041 g/L; thiết lập hoàn chỉnh đường cong sinh trưởng của nấm mối T. clypeatus trong bồn 60L.
  • Thành phần dinh dưỡng của sinh khối hệ sợi: Sinh khối tươi thu nhận có độ ẩm 93,9%; chứa protein (3,75%), carbohydrate (1,76%), acid amin tổng (2,16%) bao gồm đầy đủ các acid amin thiết yếu: valine, leucine, isoleucine, threonine, phenylalanine, lysine, arginine, histidine.
  • Hoạt tính sinh học in vitro:
    • Hoạt tính chống oxy hóa: Cao chiết methanol từ sinh khối khô T. clypeatus trung hòa gốc tự do DPPH với giá trị IC50 trung bình đạt 2,26 mg/mL; ở nồng độ 5 mg/mL, khả năng ức chế đạt từ 71,65% đến 83,52%.
    • Hoạt tính kháng khuẩn: Cao chiết thể hiện khả năng ức chế đối với 4 chủng vi sinh vật kiểm nghiệm (Bacillus cereus ATCC 11778, Candida albicans ATCC 10231, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Staphylococcus aureus ATCC 6538) với giá trị MIC đạt 10,98 mg/mL.
  • Đánh giá an toàn và độc tính:
    • Độc tính tế bào: Thử nghiệm trên dòng tế bào gan người LO-2 ghi nhận tỷ lệ tế bào sống sót đạt 90% ở nồng độ cao chiết lên tới 2500 µg/mL.
    • Độc tính cấp in vivo: Cho chuột uống cao chiết ở liều tối đa 10.000 mg/kg thể trọng, kết quả ghi nhận 0% tỷ lệ tử vong, chuột phát triển bình thường.
    • Độc tính bán trường diễn in vivo: Thử nghiệm ở liều 1.000 mg/kg thể trọng liên tục trên chuột, không ghi nhận trường hợp tử vong; các chỉ số huyết học (RBC, WBC, PLT, HGB...) và sinh hóa máu (BUN, AST, ALT...) nằm trong giới hạn sinh lý bình thường; tiêu bản mô học gan và thận không phát hiện tổn thương bệnh lý.
Thông số / Chỉ tiêu thực nghiệm Điều kiện / Kết quả tối ưu đạt được
Thành phần môi trường nhân giống cấp 1 Glucose 4%, Pepton 0,2%, Yeast extract 0,1%, KH2PO4 0,1%, MgSO4 0,015%
Thời gian nuôi nhân giống cấp 1 20 ngày
Điều kiện nhân giống cấp 2 Tỷ lệ giống 10% (v/v), sục khí 0,4 v/v/m
Thông số vận hành Bioreactor 60L Tỷ lệ giống 5% (v/v), pH 5,0, sục khí 0,4 v/v/m, khuấy 180 rpm, nhiệt độ 28°C
Năng suất sinh khối Bioreactor 60L 6,633 ± 0,041 g/L
Dinh dưỡng sinh khối tươi (ẩm độ 93,9%) Protein: 3,75%; Carbohydrate: 1,76%; Acid amin tổng: 2,16%
Hoạt tính chống oxy hóa (DPPH) IC50 = 2,26 mg/mL (ức chế 71,65 - 83,52% tại 5 mg/mL)
Hoạt tính kháng khuẩn (MIC) 10,98 mg/mL (B. cereus, C. albicans, P. aeruginosa, S. aureus)
Độc tính tế bào (LO-2) Tỷ lệ sống sót đạt 90% ở nồng độ 2500 µg/mL
Thử nghiệm độc tính cấp trên chuột Không có chuột chết ở liều 10.000 mg/kg thể trọng
Thử nghiệm độc tính bán trường diễn Không có chuột chết ở liều 1.000 mg/kg thể trọng; chỉ số huyết học/sinh hóa bình thường

Chương 5: Kết luận và đề xuất

Chương 5 tóm tắt các kết quả đạt được về mặt công nghệ và phân tích hóa sinh, khẳng định khả năng sản xuất sinh khối nấm mối Termitomyces clypeatus ở quy mô bồn nuôi cấy sinh học 60 lít với độ an toàn cao. Tác giả đưa ra các kiến nghị về việc hoàn thiện quy trình công nghệ ở quy mô lớn hơn và mở rộng nghiên cứu ứng dụng chế phẩm sinh khối trong sản xuất thực phẩm chức năng và dược phẩm.

Kết quả và những đóng góp mới

Luận án đã nêu các đóng góp mới về mặt khoa học và thực tiễn như sau:

  • Về mặt khoa học:
    • Đã phân lập thuần khiết và xác định chi của 07 chủng nấm mối tự nhiên thu thập tại miền Nam Việt Nam thuộc chi Termitomyces, trong đó định danh chính xác đến mức độ loài cho 02 chủng là Termitomyces clypeatus và Termitomyces microcarpus dựa trên giải trình tự gen vùng ITS1-5S-ITS2.
    • Xác lập được các thông số sinh học và động thái sinh trưởng (đường cong sinh trưởng) của hệ sợi nấm mối Termitomyces clypeatus trong điều kiện nuôi cấy chìm dịch thể.
    • Cung cấp bộ dữ liệu định lượng về thành phần dinh dưỡng (protein, carbohydrate, 8 acid amin thiết yếu), hoạt tính chống oxy hóa trung hòa gốc tự do DPPH và hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết hệ sợi T. clypeatus.
  • Về mặt thực tiễn:
    • Xây dựng thành công quy trình công nghệ nhân giống dịch thể hai cấp và quy trình nuôi cấy sản xuất sinh khối hệ sợi nấm mối T. clypeatus trong hệ thống bồn nuôi cấy sinh học (Bioreactor) thể tích 60 lít, đạt sản lượng 6,633 ± 0,041 g/L.
    • Chứng minh tính an toàn sinh học của cao sinh khối nấm mối thông qua thử nghiệm độc tính tế bào gan người LO-2 (sống sót 90% ở nồng độ 2500 µg/mL), thử nghiệm độc tính cấp (an toàn ở liều 10.000 mg/kg) và độc tính bán trường diễn (an toàn ở liều 1.000 mg/kg) trên chuột thực nghiệm.
    • Mở ra giải pháp kỹ thuật nhân giống dịch thể cho các loại nấm ăn và nấm dược liệu nhằm tiết kiệm thời gian, nhân lực, cung cấp nguồn giống đồng nhất; đồng thời tạo tiền đề sản xuất sinh khối quy mô bán công nghiệp cho các loài nấm quý chưa thể nuôi trồng ra quả thể.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế của nghiên cứu:
    • Nguồn mẫu phân lập nấm mối tự nhiên mới chỉ tập trung tại khu vực phía Nam.
    • Trong số 07 chủng phân lập được, mới chỉ có 02 chủng được định danh chính xác đến loài (T. clypeatus và T. microcarpus), 05 chủng còn lại mới dừng ở mức xác định chi Termitomyces.
    • Quy trình công nghệ nuôi cấy sinh khối mới được thử nghiệm và dừng lại ở quy mô bồn Bioreactor thể tích 60 lít.
  • Hướng nghiên cứu tiếp theo được đề xuất:
    • Tiếp tục nghiên cứu mở rộng quy mô sản xuất sinh khối trên các hệ thống bồn lên men công nghiệp có thể tích lớn hơn.
    • Mở rộng khảo sát và ứng dụng phương pháp nuôi cấy chìm dịch thể đối với các loài nấm dược liệu quý hiếm khác chưa thể trồng tạo quả thể nhân tạo.
    • Thực hiện các nghiên cứu sâu hơn về tinh sạch từng nhóm hoạt chất sinh học đặc thù (như polysaccharide ngoại bào, enzyme serine protease AkP) và đánh giá các thử nghiệm tiền lâm sàng chuyên biệt nhằm phát triển sản phẩm thương mại.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu kỹ thuật và học thuật hữu ích cho:

  • Nghiên cứu sinh, học viên cao học và giảng viên: Chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Công nghệ Thực phẩm, Vi sinh vật học, Hóa sinh học tham khảo về kỹ thuật định danh nấm bằng chỉ thị phân tử ITS, phương pháp tối ưu hóa môi trường nuôi cấy bằng RSM và quy trình đánh giá độc tính sinh học in vitro / in vivo.
  • Kỹ sư công nghệ lên men và doanh nghiệp sản xuất nấm/dược liệu: Tham khảo chi tiết các thông số kỹ thuật vận hành bồn lên men sinh học Bioreactor 60 lít (tỷ lệ giống, tốc độ khuấy, lưu lượng sục khí, pH, nhiệt độ) để ứng dụng nhân giống dịch thể hoặc sản xuất sinh khối nấm dược liệu quy mô bán công nghiệp.

Câu hỏi thường gặp

1. Các chủng nấm mối phân lập trong luận án được định danh bằng phương pháp nào và kết quả cụ thể ra sao?
Các chủng nấm mối được định danh dựa trên việc kết hợp khảo sát đặc điểm hình thái quả thể, hình thái khuẩn lạc và giải trình tự gen các đoạn ITS1, 5S và ITS2 đặc trưng của hệ gen ribosome. Kết quả cho thấy cả 07 chủng phân lập đều thuộc chi Termitomyces, trong đó có 02 chủng được xác định chính xác đến loài là Termitomyces clypeatus và Termitomyces microcarpus.

2. Thành phần môi trường và điều kiện tối ưu để nhân giống cấp 1 cho loài Termitomyces clypeatus là gì?
Môi trường nhân giống cấp 1 tối ưu bao gồm: KH2PO4 (0,1%), pepton (0,2%), glucose (4%), yeast extract (0,1%), MgSO4 (0,015%). Điều kiện nuôi cấy tối ưu là nhiệt độ 28°C, pH ban đầu 5,0 - 5,5, tốc độ lắc 140 - 150 vòng/phút và thời gian nuôi cấy tối ưu là 20 ngày.

3. Các thông số vận hành trên hệ thống Bioreactor 60 lít và sản lượng sinh khối thu nhận đạt bao nhiêu?
Các thông số vận hành tối ưu trên hệ thống Bioreactor 60 lít gồm: Tỷ lệ cấp giống 5% (v/v), pH môi trường 5,0, chế độ sục khí 0,4 v/v/m, tốc độ khuấy 180 vòng/phút, nhiệt độ 28°C. Lượng sinh khối hệ sợi khô thu nhận đạt 6,633 ± 0,041 g/L.

4. Sinh khối hệ sợi Termitomyces clypeatus có thành phần dinh dưỡng và hoạt tính sinh học như thế nào?
Sinh khối tươi (ẩm độ 93,9%) chứa 3,75% protein, 1,76% carbohydrate và 2,16% acid amin tổng số (gồm valine, leucine, isoleucine, threonine, phenylalanine, lysine, arginine, histidine). Cao chiết methanol từ sinh khối khô có khả năng trung hòa gốc tự do DPPH với IC50 trung bình 2,26 mg/mL (ức chế 71,65 - 83,52% ở nồng độ 5 mg/mL) và có hoạt tính kháng khuẩn đối với B. cereus, C. albicans, P. aeruginosa, S. aureus với giá trị MIC là 10,98 mg/mL.

5. Độc tính của cao chiết sinh khối nấm mối được đánh giá qua những thử nghiệm nào và kết quả ra sao?
Cao chiết được đánh giá qua 3 mức độ: Độc tính tế bào trên tế bào gan người LO-2 đạt tỷ lệ sống sót 90% ở nồng độ 2500 µg/mL; Độc tính cấp trên chuột không ghi nhận cá thể tử vong ở liều 10.000 mg/kg thể trọng; Độc tính bán trường diễn trên chuột ở liều 1.000 mg/kg thể trọng không gây tử vong, không làm biến đổi bất thường các chỉ số huyết học, sinh hóa máu và cấu trúc mô học gan, thận.

Kết luận

Luận án của nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Ngọc Nhi đã xây dựng thành công quy trình công nghệ nhân giống hai cấp và sản xuất sinh khối hệ sợi nấm mối Termitomyces clypeatus trong hệ thống nuôi cấy sinh học (Bioreactor) quy mô 60 lít. Sản phẩm sinh khối thu nhận đạt năng suất 6,633 ± 0,041 g/L, có giá trị dinh dưỡng cao với đầy đủ các acid amin thiết yếu cùng hoạt tính chống oxy hóa và kháng khuẩn rõ rệt. Các thử nghiệm độc tính tế bào và độc tính in vivo trên động vật đã chứng minh cao chiết sinh khối nấm mối an toàn, khẳng định tiềm năng ứng dụng của phương pháp nuôi cấy chìm trong việc chủ động cung cấp nguồn nguyên liệu sinh khối nấm mối phục vụ nghiên cứu và phát triển sản phẩm.