Luận án tiến sĩ tumor antigen development for dendritic cell based cancer immunotherapy against multiple myeloma

Luận án tiến sĩ về phát triển kháng nguyên khối u cho liệu pháp miễn dịch ung thư dựa trên tế bào đuôi gai chống lại đa u tủy. Nghiên cứu chuyên sâu về y học.

• Tác giả: Hoang My Dung
• Người hướng dẫn: Professor Lee Je-Jung
• Trường học: Chonnam National University
• Chuyên ngành: Molecular Medicine
• Đề tài: Tumor antigen development for dendritic cell-based cancer immunotherapy against multiple myeloma
• Loại tài liệu: Doctoral Dissertation
• Năm xuất bản: 2015

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Liệu Pháp Miễn Dịch Ung Thư Cơ sở tiềm năng

Liệu pháp miễn dịch ung thư đã và đang cách mạng hóa phương pháp điều trị ung thư, đặc biệt là trong trường hợp đa u tủy (Multiple Myeloma). Phương pháp này khai thác sức mạnh của hệ thống miễn dịch để nhận diện và tiêu diệt các tế bào ung thư. Thay vì tấn công trực tiếp tế bào ung thư bằng hóa chất hay xạ trị, liệu pháp miễn dịch 'huấn luyện' hệ miễn dịch để tự làm điều đó. Trong số các liệu pháp miễn dịch, liệu pháp sử dụng tế bào đuôi gai (DC) nổi lên như một hướng đi đầy hứa hẹn. Tế bào đuôi gai đóng vai trò như những người trình diện kháng nguyên chuyên nghiệp, kích hoạt các tế bào miễn dịch khác, như tế bào T và tế bào NK, để tấn công khối u. Nghiên cứu về phát triển kháng nguyên khối u đặc hiệu cho đa u tủy là then chốt để nâng cao hiệu quả của liệu pháp này. Theo nghiên cứu, việc phát triển kháng nguyên là mục tiêu quan trọng để tạo ra vaccine DC hiệu quả chống lại đa u tủy.

1.1. Vai trò then chốt của tế bào đuôi gai trong liệu pháp miễn dịch

Tế bào đuôi gai là những tế bào trình diện kháng nguyên (APC) mạnh mẽ, đóng vai trò trung tâm trong việc kích hoạt hệ thống miễn dịch. Chúng bắt giữ các kháng nguyên khối u, xử lý và trình diện chúng cho tế bào T, khởi động đáp ứng miễn dịch đặc hiệu chống lại ung thư. Trong liệu pháp miễn dịch tế bào đuôi gai, các tế bào DC được thu thập từ bệnh nhân, 'tải' với kháng nguyên khối u đã được xác định, sau đó được đưa trở lại cơ thể bệnh nhân để kích hoạt hệ thống miễn dịch. Việc tối ưu hóa quá trình 'tải' kháng nguyên và kích hoạt tế bào DC là yếu tố then chốt để nâng cao hiệu quả điều trị. Nghiên cứu tập trung vào các phương pháp cải thiện khả năng trình diện kháng nguyên và tăng cường khả năng kích thích tế bào T của tế bào DC.

1.2. Mục tiêu phát triển kháng nguyên khối u cho đa u tủy

Kháng nguyên khối u là các phân tử đặc hiệu có mặt trên bề mặt tế bào ung thư, giúp hệ thống miễn dịch phân biệt tế bào ung thư với tế bào khỏe mạnh. Việc xác định và phát triển kháng nguyên khối u đặc hiệu cho đa u tủy là một thách thức lớn. Các nghiên cứu tập trung vào việc tìm kiếm các kháng nguyên biểu hiện cao trên tế bào đa u tủy nhưng lại ít hoặc không có trên các tế bào bình thường. Một số kháng nguyên tiềm năng bao gồm BCMA và hTERT, đã được xác định trong các nghiên cứu trên bệnh nhân đa u tủy Hàn Quốc. Việc sử dụng các kháng nguyên này trong vaccine tế bào đuôi gai có thể giúp tăng cường đáp ứng miễn dịch đặc hiệu và tiêu diệt tế bào đa u tủy hiệu quả hơn.

II. Thách Thức Của Phát Triển Kháng Nguyên Khối U Vượt qua rào cản

Mặc dù đầy hứa hẹn, việc phát triển kháng nguyên khối u cho liệu pháp miễn dịch tế bào đuôi gai đối mặt với nhiều thách thức. Sự đa dạng di truyền của tế bào ung thư, hiện tượng thoát khỏi hệ miễn dịch và microenvironment khối u ức chế miễn dịch là những rào cản lớn. Các tế bào ung thư có thể thay đổi kháng nguyên của chúng theo thời gian, khiến hệ thống miễn dịch khó nhận diện và tiêu diệt. Microenvironment khối u có thể chứa các tế bào ức chế miễn dịch, như tế bào MDSC và tế bào Tregs, ngăn chặn đáp ứng miễn dịch chống ung thư. Do đó, cần có các phương pháp tiếp cận đa chiều để vượt qua những thách thức này, bao gồm việc phát triển kháng nguyên nhắm mục tiêu nhiều epitop khác nhau, điều chỉnh microenvironment khối u và tăng cường khả năng kích hoạt hệ thống miễn dịch.

2.1. Sự đa dạng kháng nguyên và hiện tượng thoát khỏi miễn dịch

Sự không đồng nhất về di truyền của khối u dẫn đến sự đa dạng lớn về kháng nguyên. Các tế bào ung thư có thể liên tục thay đổi biểu hiện kháng nguyên, hoặc thậm chí mất đi một số kháng nguyên mục tiêu, một quá trình được gọi là 'thoát khỏi miễn dịch'. Điều này có thể làm giảm hiệu quả của liệu pháp miễn dịch nhắm vào một kháng nguyên duy nhất. Do đó, việc phát triển vaccine DC sử dụng nhiều kháng nguyên khác nhau, hoặc nhắm vào các kháng nguyên không dễ bị thay đổi, là một chiến lược quan trọng để vượt qua hiện tượng thoát khỏi miễn dịch. Việc phân tích tải lượng đột biến khối u (TMB) và xác định các neoantigen tiềm năng cũng có thể giúp phát triển vaccine cá nhân hóa hơn.

2.2. Tác động của Microenvironment khối u lên hiệu quả điều trị

Microenvironment khối u là môi trường xung quanh khối u, bao gồm các tế bào miễn dịch, mạch máu và các yếu tố hòa tan. Trong nhiều trường hợp, microenvironment khối u có tính chất ức chế miễn dịch, cản trở hoạt động của tế bào T và các tế bào miễn dịch khác. Các yếu tố như TGF-β, VEGF và các tế bào ức chế miễn dịch như MDSC và Tregs có thể tạo ra một môi trường ức chế, ngăn chặn đáp ứng miễn dịch chống ung thư. Do đó, việc điều chỉnh microenvironment khối u để tăng cường khả năng xâm nhập và hoạt động của tế bào T là một mục tiêu quan trọng trong liệu pháp miễn dịch.

III. Cách Tăng Cường Miễn Dịch Tế Bào Đuôi Gai Phương pháp đột phá

Để nâng cao hiệu quả của liệu pháp miễn dịch tế bào đuôi gai, các nhà nghiên cứu đã phát triển nhiều phương pháp khác nhau. Chúng bao gồm việc sử dụng các tá dược miễn dịch để tăng cường kích hoạt tế bào DC, điều chỉnh tế bào DC để tăng cường khả năng trình diện kháng nguyên, và kết hợp liệu pháp tế bào đuôi gai với các phương pháp điều trị khác, như hóa trị hoặc ức chế điểm kiểm soát miễn dịch. Nghiên cứu gần đây cho thấy, các nanoparticle như bPEI-SPIONs có thể tăng cường khả năng thực bào kháng nguyên của tế bào DC, từ đó cải thiện đáp ứng miễn dịch.

3.1. Tối ưu hóa quá trình nạp kháng nguyên cho tế bào đuôi gai

Việc lựa chọn phương pháp nạp kháng nguyên cho tế bào đuôi gai đóng vai trò quan trọng trong việc quyết định loại đáp ứng miễn dịch được kích hoạt. Các phương pháp khác nhau, như sử dụng peptide tổng hợp, protein tái tổ hợp, tế bào ung thư chết hoặc RNA, có thể tạo ra các đáp ứng tế bào T khác nhau. Việc sử dụng tế bào ung thư chết (ví dụ, thông qua chiếu xạ UVB) có thể cung cấp một loạt các kháng nguyên khác nhau, giúp tăng cường đáp ứng miễn dịch chống lại nhiều mục tiêu. Thêm vào đó, việc sử dụng các tá dược miễn dịch, như bPEI-SPIONs, có thể giúp tăng cường khả năng thực bào kháng nguyên của tế bào DC và kích hoạt các con đường tín hiệu nội bào, dẫn đến sự trưởng thành và kích hoạt tế bào DC hiệu quả hơn. Theo nghiên cứu, bPEI-SPIONs làm cho tế bào U266 nhạy cảm hơn với UVB, thúc đẩy quá trình chết tế bào và giải phóng các protein có tính miễn dịch.

3.2. Kết hợp liệu pháp tế bào đuôi gai với ức chế điểm kiểm soát

Điểm kiểm soát miễn dịch là các phân tử ức chế có mặt trên tế bào T, giúp ngăn chặn các đáp ứng miễn dịch quá mức. Tuy nhiên, trong ung thư, các tế bào ung thư có thể khai thác các điểm kiểm soát miễn dịch này để trốn tránh sự tấn công của hệ miễn dịch. Các thuốc ức chế điểm kiểm soát miễn dịch, như anti-PD-1 và anti-CTLA-4, có thể giúp giải phóng tế bào T và tăng cường khả năng tiêu diệt tế bào ung thư. Kết hợp liệu pháp tế bào đuôi gai với ức chế điểm kiểm soát miễn dịch có thể tạo ra một hiệu ứng hiệp đồng, tăng cường đáp ứng miễn dịch chống ung thư. Vaccine DC cung cấp kháng nguyên đặc hiệu, trong khi ức chế điểm kiểm soát giúp loại bỏ các rào cản đối với hoạt động của tế bào T.

IV. Nghiên Cứu Phát Triển Kháng Nguyên BCMA và hTERT đầy hứa hẹn

Nghiên cứu về phát triển kháng nguyên đã xác định một số kháng nguyên tiềm năng cho liệu pháp miễn dịch nhắm vào đa u tủy, trong đó BCMA (B-Cell Maturation Antigen) và hTERT (human Telomerase Reverse Transcriptase) là hai ứng cử viên sáng giá. BCMA là một protein bề mặt tế bào biểu hiện chủ yếu trên tế bào B ác tính, làm cho nó trở thành một mục tiêu lý tưởng. hTERT là một enzyme telomerase biểu hiện cao trong nhiều loại tế bào ung thư, bao gồm cả tế bào đa u tủy. Các nghiên cứu đã chứng minh rằng tế bào DC được nạp với BCMA hoặc hTERT có thể kích hoạt đáp ứng tế bào T đặc hiệu, tiêu diệt tế bào đa u tủy một cách hiệu quả. Các nghiên cứu tiền lâm sàng và lâm sàng đang được tiến hành để đánh giá tính an toàn và hiệu quả của vaccine DC nhắm vào BCMA và hTERT trong điều trị đa u tủy.

4.1. BCMA Mục tiêu lý tưởng cho liệu pháp miễn dịch đa u tủy

BCMA là một thành viên của họ thụ thể yếu tố hoại tử khối u (TNFR), đóng vai trò quan trọng trong sự sống còn và tăng sinh của tế bào B ác tính. BCMA biểu hiện cao trên bề mặt tế bào đa u tủy, nhưng lại ít hoặc không có trên các tế bào bình thường khác, làm cho nó trở thành một mục tiêu lý tưởng cho liệu pháp miễn dịch. Các phương pháp điều trị nhắm vào BCMA, bao gồm vaccine DC, kháng thể đơn dòng và liệu pháp tế bào CAR-T, đã cho thấy những kết quả đầy hứa hẹn trong điều trị đa u tủy. Tuy nhiên, một số tế bào đa u tủy có thể trở nên kháng lại các phương pháp điều trị nhắm vào BCMA, do đó cần có các chiến lược để vượt qua tình trạng kháng thuốc này.

4.2. hTERT Ứng cử viên tiềm năng cho vaccine tế bào đuôi gai

hTERT là một thành phần xúc tác của enzyme telomerase, chịu trách nhiệm duy trì chiều dài telomere. Telomere ngắn lại theo thời gian trong quá trình phân chia tế bào, và khi telomere đạt đến một độ dài tới hạn, tế bào sẽ ngừng phân chia hoặc chết. Tuy nhiên, trong tế bào ung thư, hTERT được kích hoạt lại, cho phép tế bào ung thư phân chia vô hạn. hTERT biểu hiện cao trong nhiều loại tế bào ung thư, bao gồm cả tế bào đa u tủy, làm cho nó trở thành một mục tiêu hấp dẫn cho liệu pháp miễn dịch. Vaccine DC nhắm vào hTERT đã cho thấy khả năng kích hoạt đáp ứng tế bào T đặc hiệu, tiêu diệt tế bào ung thư. Tuy nhiên, cần có thêm các nghiên cứu để đánh giá tính an toàn và hiệu quả của vaccine DC nhắm vào hTERT trong điều trị đa u tủy.

V. bPEI SPIONs Tăng Cường Miễn Dịch Hướng đi đầy triển vọng

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng các nanoparticle như bPEI-SPIONs (branched polyethylenimine-superparamagnetic iron oxide nanoparticles) có thể cải thiện hiệu quả của liệu pháp miễn dịch tế bào đuôi gai. bPEI-SPIONs giúp tăng cường khả năng thực bào kháng nguyên của tế bào DC, kích hoạt các con đường tín hiệu nội bào và thúc đẩy sự trưởng thành của tế bào DC. Hơn nữa, bPEI-SPIONs có thể làm tăng độ nhạy cảm của tế bào ung thư với các tác nhân gây chết tế bào, như chiếu xạ UVB, dẫn đến việc giải phóng nhiều kháng nguyên hơn và kích hoạt đáp ứng miễn dịch mạnh mẽ hơn. Tuy nhiên, cần có thêm các nghiên cứu để đánh giá tính an toàn và hiệu quả của bPEI-SPIONs trong liệu pháp miễn dịch.

5.1. Cơ chế tác động của bPEI SPIONs lên tế bào đuôi gai

bPEI-SPIONs có thể tương tác với tế bào DC thông qua nhiều cơ chế khác nhau. Chúng có thể được thực bào bởi tế bào DC, dẫn đến việc kích hoạt các con đường tín hiệu nội bào, như con đường NF-κB và MAPK. Sự kích hoạt của các con đường này dẫn đến việc tăng cường biểu hiện các phân tử đồng kích thích (như CD80 và CD86) và các cytokine (như IL-12), thúc đẩy sự trưởng thành và kích hoạt tế bào DC. Hơn nữa, bPEI-SPIONs có thể tăng cường khả năng trình diện kháng nguyên của tế bào DC, giúp kích hoạt tế bào T hiệu quả hơn.

5.2. bPEI SPIONs và quá trình chết tế bào gây miễn dịch ICD

bPEI-SPIONs có thể làm tăng độ nhạy cảm của tế bào ung thư với các tác nhân gây chết tế bào, như chiếu xạ UVB hoặc hóa trị. Khi tế bào ung thư chết theo cách có tính miễn dịch (ICD), chúng giải phóng các tín hiệu nguy hiểm, như ATP, HMGB1 và Hsp70, kích hoạt hệ thống miễn dịch. bPEI-SPIONs có thể tăng cường quá trình ICD, dẫn đến việc giải phóng nhiều kháng nguyên hơn và kích hoạt đáp ứng miễn dịch mạnh mẽ hơn. Điều này có thể làm tăng hiệu quả của liệu pháp miễn dịch tế bào đuôi gai.

VI. Tương Lai Của Liệu Pháp Miễn Dịch Cá nhân hóa kết hợp điều trị

Tương lai của liệu pháp miễn dịch ung thư nằm ở việc cá nhân hóa điều trị và kết hợp liệu pháp tế bào đuôi gai với các phương pháp điều trị khác. Việc phân tích đặc điểm di truyền của khối u và hệ thống miễn dịch của bệnh nhân có thể giúp xác định các kháng nguyên và phương pháp điều trị phù hợp nhất. Kết hợp liệu pháp tế bào đuôi gai với ức chế điểm kiểm soát miễn dịch, hóa trị hoặc các liệu pháp nhắm mục tiêu có thể tạo ra một hiệu ứng hiệp đồng, tăng cường đáp ứng miễn dịch và cải thiện kết quả điều trị cho bệnh nhân đa u tủy.

6.1. Cá nhân hóa liệu pháp miễn dịch dựa trên đặc điểm khối u

Mỗi khối u là duy nhất, với các đặc điểm di truyền và miễn dịch khác nhau. Việc phân tích tải lượng đột biến khối u (TMB), biểu hiện gen và sự xâm nhập của tế bào T có thể giúp xác định các kháng nguyên và phương pháp điều trị phù hợp nhất cho từng bệnh nhân. Vaccine DC cá nhân hóa, được thiết kế dựa trên các kháng nguyên đặc hiệu của khối u của bệnh nhân, có thể kích hoạt đáp ứng miễn dịch mạnh mẽ hơn và tiêu diệt tế bào ung thư hiệu quả hơn.

6.2. Các chiến lược kết hợp để tối ưu hóa hiệu quả điều trị

Kết hợp liệu pháp tế bào đuôi gai với các phương pháp điều trị khác, như ức chế điểm kiểm soát miễn dịch, hóa trị hoặc các liệu pháp nhắm mục tiêu, có thể tạo ra một hiệu ứng hiệp đồng, tăng cường đáp ứng miễn dịch và cải thiện kết quả điều trị cho bệnh nhân đa u tủy. Ví dụ, hóa trị có thể giúp giảm khối lượng khối u, tạo điều kiện cho tế bào T xâm nhập và tiêu diệt tế bào ung thư. Ức chế điểm kiểm soát miễn dịch có thể giúp giải phóng tế bào T và tăng cường khả năng tiêu diệt tế bào ung thư. Kết hợp các phương pháp điều trị này với liệu pháp tế bào đuôi gai có thể tạo ra một chiến lược điều trị toàn diện, nhắm mục tiêu vào ung thư từ nhiều góc độ khác nhau.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Doctoral Dissertation Tumor antigen development for dendritic cell-based cancer immunotherapy against multiple myeloma Department of Molecular Medicine Graduate School, Chonnam National University HOANG My Dung August 2015 Tumor antigen development for dendritic cell-based cancer immunotherapy against multiple myeloma Department of Molecular Medicine Graduate School, Chonnam National University HOANG My Dung Supervised by Professor LEE Je-Jung A dissertation submitted in partial fulfillment of the requirements for the Doctor of Philosophy in Science, has been deemed acceptable by the individuals below. Committee in Charge : RHEE Joon Haeng NAM Jong-Hee CHUNG Ik-Joo PARK In-Kyu LEE Je-Jung August 2015 CONTENTS LIST OF FIGURES.1 PART I: Branched polyethylenimine-superparamagnetic iron oxide nanoparticles (bPEI-SPIONs) improve the immunogenicity of tumor antigens and enhance Th1 polarization of dendritic cells ································· 3 I. Materials and Methods ······················································································ 5 I.1) Synthesis and characterization of bPEI-SPION ······························ 5 I.2) Intracellular ferric iron measurement ················································ 5 I.4) Assays of ROS generation ····································································· 6 I.5) Generation of monocyte-derived DCs ··············································· 6 I.6) Tumor antigen preparation ····································································· 7 I.7) Surface heat shock protein (Hsp) expression on tumor antigens ······················································································································ 7 I.9) Antigen uptake assay ··············································································· 8 I.10)Phenotypic analysis of DCs ··································································· 8 I.12)Human IL-12p70 and IL-10 production ··········································· 9 I.13)Allogeneic naïve CD4+ T cell polarization assay ························· 9 I.14)Intracellular staining for cytokine expression ································ 9 I.1) Optimal bPEI-SPION concentration for uptake by U266 cells.2) bPEI-SPION pretreatment accelerates apoptotic cell death after UVB irradiation with induction of ROS production ······················ 11 I.3) Eating-me signal surface Hsp70 and Hsp90 expression and danger signal release were observed in 2-h post-irradiated and bPEI-SPION 2-h post-irradiated cells ························································ 13 I.4) bPEI-SPION 2-h post-irradiated cells enhance Th1 polarization without altering DC surface marker expression and DC migration ················································································································· 15 I. Discussion ············································································································ 17 PART II: Evaluation of tumor antigen expression in Korean multiple myeloma patients and development of recombinant protein for dendritic cell-based vaccine against multiple myeloma.

Materials and Methods ·················································································· 25 II.1) Patient samples ······················································································· 25 II.2) RNA isolation, cDNA synthesis and quantitative real-time PCR ··························································································································· 26 II.3) Expression data and statistic analysis ··········································· 26 II.1) Target gene expression pattern in MM patients of light chain type ··························································································································· 27 II.2) Target gene expression pattern in MM patient of IgG type 28 ii II.3) Target gene expression pattern in MM patientsof IgA type.4) BCMA and hTERT are candidates for MM vaccine development ··········································································································· 30 II. Discussion ·········································································································· 31 Part III: Dendritic cell-based cancer immunotherapy against multiple myeloma: from bench to clinic ·················································································· 38 III. Dendritic cell-based cancer immunotherapy ······································· 39 III. Multiple myeloma immunity ········································································ 41 III.

Dendritic cell-based immunotherapy against multiple myeloma ·· 41 III.1) Id-pulsed DCs ······················································································ 41 III.2) MM-associated antigen-loaded DCs ············································ 42 III.3) Whole tumor antigen-loaded DCs ················································ 43 III. Improvement of DC-based cancer immunotherapy ··························· 44 III.1) Type 1-polarized DCs ······································································ 44 III.2) Tumor antigens to load onto DCs ················································ 47 III.3) Regulation of tumor suppressive microenvironment ·············· 48 III. Future perspectives of DC-based cancer immunotherapy ············· 49 ABSTRACT (KOREAN).60 iii LIST OF FIGURES Figure I- 1: Uptake of branched polyethylenimine-superparamagnetic iron oxide nanoparticles (bPEI-SPION) by U266 cells ············································· 10 Figure I- 2: Characterization of U266 cells after UVB irradiation in the presence or absence of bPEI-SPIONs. ·································································· 12 Figure I- 3: Damage-associated molecular pattern (DAMP) production by dying tumor cells induced by apoptotic pathway ··············································· 14 Figure I- 4: Characterization of DCs loaded with U266 cells ····················· 16 Figure I- 5: T cell polarization of DCs.

······························································· 17 Figure II- 1: Target gene expression in MM patients of light chain type ······································································································································ 27 Figure II- 2: Target gene expression in lgG type MM patient ··················· 28 Figure II- 3: Target gene expression in IgA type MM patient. ·················· 29 Figure II- 4: Target gene expression analysis in total 9 MM patients. ··· 30 Figure III- 1: Critical points to improve cancer immunotherapy using dendritic cells in cancer patients ············································································· 40 iv ABBREVIATIONS BCMA B-Cell Maturation Antigen bPEI-SPION branch PolyEthylImine-SuperParamagnetic Iron Oxide Nanoparticles Cox-2 Cyclo-oxygenase-2 CTA Cancer Testis Antigen CTL Cytotoxic T Lymphocytes DC Dendritic Cell DCFH-DA 2',7'-Dichlorofluorescein-diacetate DEPDC1A Disheveled, EGL-10, Pleckstrin Domain Contained protein 1A DKK1 Dickkopf-1 DNA Deoxyribo Nucleic Acid ER Endoplasmic Reticulum FasL Fas ligand FBS Fetal Bovine Serum GM-CSF Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor HMGB1 High-Mobility Group Box 1 Hsp Heat shock protein hTERT human Telomerase Id Idiotype IFN Interferon IL Interleukin IMDM Iscove's Modified Dulbecco's Media IMiD Immunomodulatory Drug MACS Magnetic Activating Cell Sorting MDSC Myeloid Derived Suppressor Cells MFI Mean Fluorescence Intensity v MHC Major Histocompatibility Complex MM Mutiple Meloma MMP Matrix MetalloProteinases NAC N-acetyl cysteine NK Natural Killer qPCR Quantitative real-time Polymerase Chain Reaction RNA RiboNucleic Acid ROS Reactive Oxygen Species RPMI Roswell Park Memorial Institute PBMC Peripheral Blood Mononuclear Cells PBS Phosphate Buffered Saline pDC plasmacytoid Dendritic Cell PMA PhorbolMyristate Acetate P/S Penicillin/Streptomycin PTD Protein Transduction Domain URP Unfolded Protein Response UVB Ultraviolet B VEGF Vascular Endothelial Growth Factor SDS Sodium Dodecyl Sulfate siRNA small interference RiboNucleotide Acid STEAP1 Six Transmembrane Epithelial Antigen of Prostate 1 TAA Tumor Associated Antigens TEM Transmission Electron Microscopy TGF Transforming Growth Factor TNF Tumor Necrosis Factor Tregs regulatory T cells vi Tumor antigen development for dendritic cell-based cancer immunotherapy against multiple myeloma ABSTRACT: Although introduction of stem cell transplantation and novel agents has improved in survival, MM is still difficult to cure. Alternative approaches are clearly needed to prolong survival of patients with MM.

DC therapy is a very promising tool to improve MM treatment. Several approaches could be employed to generate effective DC vaccine. Among them, development of tumor antigen is an important goal. In part I, the thesis presents effect of bPEI-SPIONs on U266 tumor antigen preparation which was loaded onto DCs.

The tumor antigens were prepared as follows: 1) apoptotic U266 cells with UVB-irradiation followed by a 2-h incubation in the absence (2-h post-irradiated cells) or 2) presence of bPEI-SPIONs (bPEI-SPION 2-h post-irradiated cells) and 3) apoptotic U266 cells with UVB-irradiation followed by an overnight 16-h incubation (16-h post-irradiated cells). bPEI-SPIONs render U266 cells sensitive to UVB-irradiation through reactive oxygen species production to accelerate apoptotic death. The 2-h post-irradiated cells and bPEI-SPION 2-h post-irradiated cells released immunogenic proteins, including Hsp70, Hsp90, and HMGB1. The DCs loaded with bPEI-SPION 2-h post-irradiated cells showed the highest IL-12p70 production and Th1 polarization compared with other DCs.

These results suggest that bPEI-SPIONs are a promising method of enhancing the immunogenicity of tumor cells and promoting Th1 polarization of DCs loaded with these tumor cells. 1 In part II, certain tumor antigen, related to poor overall survival, expression was evaluated in Korean MM patients. Results showed that BCMA and hTERT are good candidates for tumor antigen development. These mentioned results promise effective DC vaccine generations against MM.

In part III, we described several approaches of DC-based vaccine development for application of this method to clinical setting in MM. PART I: Branched polyethylenimine-superparamagnetic iron oxide nanoparticles (bPEI-SPIONs) improve the immunogenicity of tumor antigens and enhance Th1 polarization of dendritic cells Abstract Nanoparticles in the field of DC research are emerging as a promising method of enhancing the efficacy of cancer immunotherapy. We investigated the effect of branched (bPEI-SPIONs) on tumor cells loaded onto DCs. The tumor antigens were prepared as follows: 1) apoptotic U266 cells with ultraviolet B (UVB)-irradiation followed by a 2-h incubation in the absence (2-h post-irradiated cells) or 2) presence of bPEI-SPIONs (bPEI-SPION 2-h post-irradiated cells) and 3) apoptotic U266 cells with UVB-irradiation followed by an overnight 16-h incubation (16-h post-irradiated cells).

bPEI-SPIONs render U266 cells sensitive to UVB-irradiation through ROS production to accelerate apoptotic death. The 2-h post-irradiated cells and bPEI-SPION 2-h post-irradiated cells released immunogenic proteins, including Hsp70, Hsp90, and HMGB1. The DCs loaded with bPEI-SPION 2-h post-irradiated cells showed the highest IL-12p70 production and Th1 polarization compared with other DCs. These results suggest that bPEI-SPIONs are a promising method of enhancing the immunogenicity of tumor cells and promoting Th1 polarization of DCs loaded with these tumor cells.

Introduction Lack of specific hallmark of cancer is reason for using of whole tumor cells (tumor apoptotic bodies, tumor cell lysates, or tumor cell-derived RNA), which represent full characteristics of tumor identity, as common source of tumor antigens in clinical trials of DC-based cancer [1, 2] vaccines. Among these antigen preparation procedures, UVB irradiation is a safe, inexpensive, and easy method of inducing a mixed population of viable, early apoptotic, and late apoptotic/necrotic cells with various proportions during tumor antigen preparation [3, 4]. However, the immunogenic properties of prepared tumor antigens depend on the cell death stage. Engulfment of the early apoptotic body leads to silent phagocytosis with anti-inflammatory activity, whereas phagocytes are activated when encountering late apoptotic/necrotic cells; as a result, the [5, 6] latter gives rise to an inflammatory response.

In our previous studies, apoptotic cells or dying tumor cells, used as a tumor antigen source, showed high anti-tumor induction efficacy of DCs to T cells [7, 8]. To develop novel techniques for tumor antigen preparation, we induced immunogenic cell death using JSI-124 combined with bortezomib in MM [4]. [9] Recently, SPIONs have been reported to enhance ROS production. Based on our previous studies on DCs, we suppose that SPIONs accelerate tumor cell death to an immunogenic induction stage; hence, the antigen can be more highly immunogenic than UVB-irradiated tumor antigens.

SPIONs are an interesting tool for cell labeling, cell therapy, and diagnostic imaging. However, uncoated SPIONs can cause toxicity to living cells, and coating materials have been developed to stabilize [10] aqueous SPION suspensions and reduce toxicity. bPEI-SPIONs, iron oxide nanoparticles coated with bPEI, are less toxic than SPIONs and [11] readily bind to the cell membrane to enhance their uptake. 4 Here, we investigated the immunogenicity of tumor antigen sources prepared from UVB-irradiated tumor cells in the presence of bPEI-SPIONs during T cell responses elicited by DCs loaded with these tumor antigens.

We showed that bPEI-SPIONs accelerated UVB-irradiated cell death to the late apoptotic/necrotic stage after 2-h incubation. Furthermore, prepared antigen with bPEI-SPIONs induced the highest production of IL-12p70 of DCs, and these DCs favored Th1 polarization during the T cell response. Materials and Method I.1) Synthesis and characterization of bPEI-SPION bPEI-SPION was synthesized by conjugation of low molecular weight bPEI (Mw 1,800 Da, Aldrich) onto thermally cross-linked SPION [12] (TCL-SPION) via amide linkage. The physic-chemical properties of bPEI-SPION were further characterized by using Zetasizer Nano Z (Malven Instruments, Malvern, UK), TEM (JEOL JEM-2000 FXII, Japan) and TGA analysis (Mettler-Toledo, SDT851, Columbus,USA) in order to confirm its successful synthesis.2) Intracellular ferric iron measurement bPEI-SPION uptake by the U266 MM cell line was evaluated using [13] 5 a quantitative spectrophotometric method.

Briefly, 5 × 10 U266 cells were put in contact with different amount of bPEI-SPIONs in shaking for 1-h at room temperature. Cells were collected and washed three times in 1×PBS (Sigma Aldrich, St.Louis, MO, USA). The pellet was resuspended in 30% HCl (Sigma–Aldrich) for 2-h at 60°C.08% potassic persulfate, 8% potassium thiocyanate, and 3.6% HCl (Sigma Aldrich) were added to form the iron-thiocyanate complex. The absorbance at 490 nm was measured using a microplate reader (TECAN Infinite M200 PRO, Tecan, Männedorf, Switzerland) after 10-min incubation.6H2O (SigmaAldrich) solution was treated in the same manner to create the standard curve.3) Confocal microscopy U266 cells were put in contact with bPEI-SPIONs conjugated with FNR-675 dye (BioActs, Namdong-gu, Incheon, Korea), which appears as a red color under confocal microscopy (Carl Zeiss, Jena, Germany).

Cells were fixed on a glass slide and the nuclei were stained with DAPI (Thermo Scientific Pierce, Rockford, USA), which appears as a blue color.4) Assays of ROS generation DCFH-DA (Sigma–Aldrich) and NAC (Sigma–Aldrich), which blocks ROS production, were used to determine intracellular ROS levels based on fluorescence measurements. Briefly, cells were incubated in warm RPMI-1640 medium (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) containing 10% FBS (PAA, Murarrie, Australia) and 1% P/S (Lonza, Walkersville, MD, USA) with 6 DCFH-DA at 37°C for 1h[14]. The probe was then removed and cells were used for preparation of several types of antigen.