Khóa luận: Phát hiện ETEC, DAEC, EAEC của E.coli tại nhà nuôi yến bằng Multiplex PCR

Khóa luận: Xác định subtypes ETEC, DAEC, EAEC của E. coli trong môi trường nuôi chim yến bằng Multiplex PCR. Nghiên cứu công nghệ sinh học.

• Tác giả: Trần Ngọc Thảo Nguyên
• Người hướng dẫn: TS. Đinh Xuân Phát
• Trường học: Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Xác Định Sự Hiện Diện Các Subtypes ETEC, DAEC Và EAEC Của Escherichia Coli Trong Môi Trường Nhà Nuôi Chim Yến Bằng Kỹ Thuật Multiplex PCR
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2018-2022
• Địa điểm: Thành phố Thủ Đức

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN
• TÓM TẮT
• ABSTRACT
• MỤC LỤC
• DANH SÁCH CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT
• DANH SÁCH CÁC BẢNG
• DANH SÁCH CÁC HÌNH
• 1. CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1.1. Mục tiêu của đề tài
• 1.2. Nội dung thực hiện
• 2. CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Sơ lược về kỹ thuật PCR (Polymearase Chain Reaction)
• 2.2. Nguyên tắc thực hiện phản ứng PCR
• 2.3. Kỹ thuật điện di
• 2.4. Sơ lược về kỹ thuật mPCR (Multiplex Polymerase Chain Reaction)
• 2.5. Nguyên tắc thực hiện phản ứng mPCR
• 2.6. Sơ lược về ngành nuôi chim yến và các vấn đề liên quan
• 2.7. Sơ lược về vi khuẩn E. coli và phân loại các subtypes gây bệnh
• 2.8. Phân loại các subtypes E. coli mang gen độc lực gây bệnh
• 2.8.1. Enterotoxigenic E. coli (ETEC)
• 2.8.2. Diffusely adherent E. coli (DAEC)
• 2.8.3. Enteroaggregative E. coli (EAEC)
• 2.9. Cơ chế gây bệnh
• 2.10. Thành tựu nghiên cứu trong nước
• 2.11. Thành tựu nghiên cứu nước ngoài
• 3. CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 3.2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
• 3.3. Các đối chứng và mẫu thực địa
• 3.4. Các hóa chất và dụng cụ thí nghiệm
• 3.5. Ly trích DNA của các mẫu đối chứng
• 3.6. Tối ưu nhiệt độ bắt cặp của các phản ứng sPCR
• 3.7. Tối ưu nhiệt độ bắt cặp của phản ứng mPCR
• 3.8. Tối ưu nồng độ các cặp mồi trong phản ứng mPCR
• 3.9. Kiểm tra độ đặc hiệu các cặp mồi trong phản ứng mPCR
• 3.10. Xác định giới hạn phát hiện của phản ứng mPCR
• 3.11. Ứng dụng mPCR để khảo sát các tác nhân trên nền mẫu thực địa
• 3.12. Xử lý số liệu
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Kết quả nghiên cứu
• 4.2. Tối ưu nhiệt độ bắt cặp của các phản ứng sPCR
• 4.3. Tối ưu nhiệt độ bắt cặp của phản ứng mPCR
• 4.4. Tối ưu nồng độ các cặp mồi trong phản ứng mPCR
• 4.5. Kiểm tra độ đặc hiệu của các cặp mồi dùng trong phản ứng mPCR
• 4.6. Xác định giới hạn phát hiện của phản ứng mPCR
• 4.7. Khảo sát trên các mẫu thực địa
• 4.8. Thảo luận
• KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Vì sao phải phát hiện E

Ngành công nghiệp yến sào Việt Nam đang phát triển mạnh mẽ. Tuy nhiên, chim yến là loài hoang dã, có nguy cơ mang theo các mầm bệnh nguy hiểm. Một trong những rủi ro lớn nhất là sự hiện diện của vi khuẩn Escherichia coli (E. coli), đặc biệt là các chủng mang gen độc lực. Sự ô nhiễm vi sinh tổ yến bởi E. coli không chỉ đe dọa sức khỏe người tiêu dùng mà còn ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng yến sào và uy tín của thương hiệu trên thị trường quốc tế. Các sản phẩm yến sào bị nhiễm khuẩn có thể gây ra các bệnh về đường tiêu hóa, ngộ độc thực phẩm, làm giảm giá trị kinh tế và tạo ra rào cản khi xuất khẩu. Việc đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm yến sào là yếu tố sống còn. Do đó, việc áp dụng các phương pháp hiện đại để sàng lọc, phát hiện và kiểm soát E. coli ngay từ môi trường nhà yến là một yêu cầu cấp thiết. Một quy trình kiểm nghiệm vi sinh vật trong nhà yến hiệu quả giúp các nhà sản xuất chủ động trong việc phòng ngừa, xử lý sự cố, và cam kết chất lượng sản phẩm cuối cùng. Các tiêu chuẩn vi sinh cho yến sào ngày càng khắt khe, đòi hỏi một phương pháp phát hiện nhanh, chính xác và đáng tin cậy. Việc phát hiện sớm vi khuẩn E.coli trong tổ yến giúp ngăn chặn nguy cơ nhiễm khuẩn chéo trong nhà yến và toàn bộ chuỗi sản xuất, bảo vệ sức khỏe cộng đồng và củng cố vị thế của ngành yến Việt Nam.

1.1. Hiểu đúng về vi khuẩn E.coli và các chủng gây bệnh

Escherichia coli là một loại vi khuẩn gram âm, thường tồn tại trong đường ruột của người và động vật. Hầu hết các chủng E. coli là vô hại, thậm chí còn có lợi. Tuy nhiên, một số chủng đặc biệt mang gen độc lực có thể gây ra các bệnh nghiêm trọng. Nghiên cứu của Trần Ngọc Thảo Nguyên (2023) tập trung vào ba subtypes chính: Enterotoxigenic E. coli (ETEC), Enteroaggregative E. coli (EAEC), và Diffusely adherent E. coli (DAEC). ETEC là nguyên nhân phổ biến gây tiêu chảy du lịch và tiêu chảy ở trẻ em tại các nước đang phát triển. EAEC gây tiêu chảy kéo dài bằng cách hình thành một lớp màng sinh học bám dính vào ruột. DAEC gây bệnh bằng cách bám dính lan tỏa trên bề mặt tế bào ruột. Việc định danh vi khuẩn E.coli và phân biệt các chủng này là rất quan trọng vì cơ chế gây bệnh và mức độ nguy hiểm của chúng khác nhau, đòi hỏi các biện pháp can thiệp phù hợp.

1.2. Mối đe dọa từ ô nhiễm vi sinh đến chất lượng yến sào

Tổ yến là sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao nhưng cũng là môi trường lý tưởng cho vi sinh vật phát triển nếu không được kiểm soát chặt chẽ. Sự hiện diện của E. coli, đặc biệt là các chủng gây bệnh, là một chỉ thị rõ ràng về tình trạng vệ sinh kém và ô nhiễm phân. Vi khuẩn này có thể lây nhiễm vào tổ yến thông qua phân chim, nguồn nước không đảm bảo, hoặc do nhiễm khuẩn chéo trong nhà yến từ các dụng cụ và bề mặt. Khi người tiêu dùng sử dụng sản phẩm bị nhiễm khuẩn, họ có nguy cơ đối mặt với các vấn đề sức khỏe. Hơn nữa, các tiêu chuẩn vi sinh cho yến sào của các thị trường nhập khẩu như Châu Âu, Mỹ, Trung Quốc rất nghiêm ngặt. Việc phát hiện dư lượng vi sinh vật vượt ngưỡng cho phép có thể khiến toàn bộ lô hàng bị từ chối, gây thiệt hại kinh tế nặng nề cho doanh nghiệp.

II. Phương pháp Multiplex PCR Giải pháp tối ưu phát hiện E

Kỹ thuật Multiplex PCR (mPCR) là một cải tiến vượt trội từ phương pháp PCR truyền thống. Thay vì chỉ phát hiện một mục tiêu duy nhất trong mỗi phản ứng, mPCR cho phép khuếch đại và xác định đồng thời nhiều đoạn gen khác nhau trong cùng một ống nghiệm. Điều này có ý nghĩa cực kỳ quan trọng trong việc xét nghiệm E.coli trong yến sào. Nó không chỉ giúp xác định sự hiện diện của E. coli mà còn có thể phân biệt các chủng gây bệnh khác nhau (như ETEC, DAEC, EAEC) dựa trên các gen độc lực đặc trưng của chúng. Ưu điểm chính của phương pháp này là tiết kiệm thời gian, chi phí và hóa chất so với việc thực hiện nhiều phản ứng PCR đơn lẻ (sPCR). Hơn nữa, độ nhạy và độ đặc hiệu của mPCR rất cao, cho phép phát hiện mầm bệnh ngay cả khi chúng tồn tại ở nồng độ thấp. So với các phương pháp nuôi cấy truyền thống vốn mất vài ngày để cho kết quả, mPCR rút ngắn thời gian phân tích xuống chỉ còn vài giờ. Điều này giúp các cơ sở nuôi yến và nhà sản xuất nhanh chóng đưa ra quyết định, đảm bảo quy trình kiểm soát chất lượng diễn ra liên tục và hiệu quả, đáp ứng các yêu cầu khắt khe về an toàn vệ sinh thực phẩm yến sào.

2.1. Nguyên lý và ưu điểm vượt trội của kỹ thuật Multiplex PCR

Nguyên lý của kỹ thuật Multiplex PCR dựa trên việc sử dụng đồng thời nhiều cặp mồi (primer) khác nhau trong một phản ứng. Mỗi cặp mồi được thiết kế đặc hiệu để bám vào và khuếch đại một gen mục tiêu riêng biệt. Trong nghiên cứu được đề cập, các gen mục tiêu là elt (đặc trưng cho ETEC), daaE (cho DAEC) và aatA (cho EAEC). Các sản phẩm PCR tạo ra từ mỗi cặp mồi sẽ có kích thước khác nhau, giúp phân biệt chúng dễ dàng bằng phương pháp điện di trên gel. Ưu điểm của mPCR bao gồm: (1) Hiệu quả cao: Phát hiện nhiều tác nhân cùng lúc. (2) Tiết kiệm: Giảm chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao và công sức. (3) Nhanh chóng: Cho kết quả trong vài giờ. (4) Kiểm soát nội tại: Có thể thêm một cặp mồi cho gen chứng nội để kiểm tra chất lượng mẫu và sự thành công của phản ứng, giảm thiểu kết quả âm tính giả.

2.2. So sánh Multiplex PCR với phương pháp kiểm nghiệm vi sinh khác

So với phương pháp nuôi cấy vi sinh truyền thống, mPCR có tốc độ vượt trội. Nuôi cấy đòi hỏi thời gian từ 24-72 giờ hoặc hơn để khuẩn lạc phát triển và thực hiện các thử nghiệm sinh hóa để định danh. Trong khi đó, toàn bộ quy trình xét nghiệm PCR chỉ mất khoảng 3-5 giờ. Về độ nhạy, mPCR có thể phát hiện lượng DNA rất nhỏ của vi khuẩn, kể cả vi khuẩn không có khả năng nuôi cấy hoặc đã chết. Về độ đặc hiệu, mPCR nhắm đến các trình tự gen độc lực đặc trưng, cho phép phân biệt chính xác các chủng gây bệnh, điều mà phương pháp nuôi cấy thông thường khó thực hiện. So với các phương pháp real-time PCR, mPCR truyền thống có chi phí đầu tư thiết bị ban đầu thấp hơn, mặc dù real-time PCR cho phép định lượng và không cần bước điện di sau phản ứng.

III. Hướng dẫn quy trình phát hiện E

Việc xây dựng một quy trình xét nghiệm PCR chuẩn hóa là yếu tố quyết định sự thành công và độ tin cậy của kết quả. Dựa trên nghiên cứu của Trần Ngọc Thảo Nguyên (2023), quy trình phát hiện đồng thời ba subtypes ETEC, DAEC và EAEC trong nhà yến được thực hiện qua nhiều bước nghiêm ngặt. Quá trình này bắt đầu từ việc thu thập mẫu một cách chính xác tại hiện trường, bao gồm mẫu phân và mẫu phết bề mặt tổ yến, để đảm bảo tính đại diện. Tiếp theo là giai đoạn quan trọng nhất: ly trích DNA tổng số từ mẫu. Một quy trình ly trích hiệu quả sẽ thu được DNA tinh sạch, không chứa các chất ức chế phản ứng PCR. Bước tiếp theo là tối ưu hóa các điều kiện phản ứng mPCR. Đây là giai đoạn phức tạp, đòi hỏi phải thử nghiệm và điều chỉnh nhiều thông số như nhiệt độ bắt cặp, nồng độ của từng cặp mồi, để đảm bảo cả ba gen mục tiêu đều được khuếch đại hiệu quả và không tạo ra sản phẩm phụ. Cuối cùng, sản phẩm PCR được phân tích bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose để xác nhận sự hiện diện và kích thước của các đoạn DNA mong muốn, từ đó đưa ra kết luận về sự tồn tại của các subtypes vi khuẩn E.coli trong tổ yến.

3.1. Quy trình thu thập và ly trích DNA từ mẫu nhà yến

Mẫu thực địa được thu thập từ 30 nhà yến tại Đồng Nai, Bình Dương và TP. Hồ Chí Minh, bao gồm 67 mẫu phân và 23 mẫu phết bề mặt tổ yến. Quá trình phân tích DNA vi khuẩn bắt đầu bằng việc ly trích DNA tổng số từ các mẫu này. Nghiên cứu đã sử dụng bộ kit TopPURE® Tissue Viral Extraction, một phương pháp dựa trên cột silica cho hiệu quả thu hồi DNA cao. Quy trình bao gồm các bước: phá vỡ tế bào bằng buffer và enzyme proteinase K, gắn DNA lên màng silica, rửa sạch tạp chất bằng các dung dịch đệm, và cuối cùng thu hồi DNA tinh sạch bằng buffer elution. Chất lượng và nồng độ DNA sau ly trích được kiểm tra bằng máy đo quang phổ để đảm bảo đủ tiêu chuẩn cho các phản ứng PCR tiếp theo.

3.2. Tối ưu hóa các điều kiện phản ứng mPCR quan trọng

Để đảm bảo cả ba cặp mồi hoạt động hiệu quả trong cùng một phản ứng, việc tối ưu hóa là bắt buộc. Nghiên cứu đã tiến hành tối ưu nhiệt độ bắt cặp, và kết quả cho thấy nhiệt độ 56°C là tối ưu nhất, cho phép cả ba cặp mồi khuếch đại sản phẩm rõ nét. Bên cạnh đó, nồng độ của các cặp mồi cũng được tinh chỉnh để tránh sự cạnh tranh hoặc ức chế lẫn nhau. Tỷ lệ nồng độ tối ưu được xác định là elt:daaE:aatA = 2:2,5:2 (tương ứng 0,4 µM: 0,5 µM: 0,4 µM). Quy trình tối ưu này đảm bảo các vạch sản phẩm trên gel điện di có độ sáng tương đồng, dễ dàng phân tích và kết luận. Đây là bước then chốt để xây dựng thành công một quy trình xét nghiệm PCR đáng tin cậy.

3.3. Phân tích và đọc kết quả trên gel điện di agarose

Sau khi phản ứng mPCR kết thúc, sản phẩm được chạy điện di trên gel agarose 1.5%. Các phân tử DNA mang điện tích âm sẽ di chuyển về cực dương, và được phân tách dựa trên kích thước. Các đoạn DNA nhỏ hơn sẽ di chuyển nhanh hơn và xa hơn. Một thang chuẩn DNA (DNA ladder) với các đoạn có kích thước đã biết được chạy song song để so sánh. Dưới ánh sáng UV, các vạch DNA phát sáng (nhờ thuốc nhuộm) sẽ hiện rõ. Dựa trên vị trí của các vạch so với thang chuẩn, có thể xác định sự hiện diện của các gen mục tiêu: elt (629 bp), daaE (480 bp) và aatA (340 bp). Nếu một vạch sáng xuất hiện đúng ở kích thước 629 bp, mẫu đó được kết luận là dương tính với ETEC.

IV. Bằng chứng thực tiễn Phát hiện E

Việc áp dụng quy trình mPCR đã được tối ưu hóa vào khảo sát thực tế trên 90 mẫu thu thập từ các nhà yến đã cung cấp những dữ liệu quan trọng. Kết quả không chỉ xác nhận hiệu quả của phương pháp mà còn vẽ nên một bức tranh thực tế về tình hình ô nhiễm vi sinh tổ yến tại các khu vực khảo sát. Dữ liệu cho thấy sự hiện diện đáng kể của vi khuẩn E.coli trong tổ yến, đặc biệt là subtype ETEC, một tác nhân gây bệnh tiêu chảy phổ biến. Điều này gióng lên hồi chuông cảnh báo về các rủi ro tiềm ẩn trong môi trường nuôi yến và sự cần thiết phải có các biện pháp kiểm soát vệ sinh nghiêm ngặt. Việc xét nghiệm E.coli trong yến sào không còn là một lựa chọn mà đã trở thành một yêu cầu bắt buộc để đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm yến sào. Các kết quả từ nghiên cứu này là cơ sở khoa học vững chắc để các nhà quản lý, chủ nhà yến và doanh nghiệp chế biến đưa ra các chiến lược phù hợp nhằm nâng cao chất lượng yến sào và bảo vệ người tiêu dùng. Đây là minh chứng rõ ràng cho thấy ứng dụng công nghệ sinh học phân tử có thể tạo ra tác động tích cực và trực tiếp đến ngành nông nghiệp công nghệ cao.

4.1. Kết quả khảo sát Tỷ lệ nhiễm subtype ETEC chiếm ưu thế

Kết quả khảo sát trên 90 mẫu cho thấy có 32 mẫu dương tính với gen elt, tương ứng với subtype ETEC, chiếm tỷ lệ 35,56%. Đáng chú ý, tất cả các mẫu dương tính này đều thuộc nhóm mẫu phân (32/67 mẫu phân). Điều này cho thấy ETEC tồn tại và lưu hành phổ biến trong quần thể chim yến tại các khu vực khảo sát. Tỷ lệ nhiễm cao này nhấn mạnh nguy cơ phân chim là nguồn lây nhiễm chính, có thể gây ô nhiễm vi sinh tổ yến và môi trường xung quanh. Kết quả này tương đồng với các nghiên cứu trước đây chỉ ra rằng ETEC là subtype phổ biến trên động vật.

4.2. Ghi nhận sự vắng mặt của subtype DAEC và EAEC

Một phát hiện quan trọng khác của nghiên cứu là không có mẫu nào trong số 90 mẫu khảo sát cho kết quả dương tính với hai subtypes DAEC (gen daaE) và EAEC (gen aatA). Sự vắng mặt này có thể được giải thích do DAEC vốn ít phổ biến trong tự nhiên và các nghiên cứu về chúng còn hạn chế. Trong khi đó, EAEC được ghi nhận là tồn tại chủ yếu trên người và là con đường lây nhiễm thứ cấp. Do đó, việc không phát hiện chúng trên các mẫu từ môi trường nhà yến là điều có thể dự đoán. Tuy nhiên, điều này không loại trừ hoàn toàn sự tồn tại của chúng và cần có những khảo sát sâu rộng hơn.

4.3. Xác định giới hạn phát hiện LOD của quy trình mPCR

Độ nhạy của một phương pháp xét nghiệm được thể hiện qua giới hạn phát hiện (LOD - Limit of Detection), tức là nồng độ DNA thấp nhất mà phương pháp có thể phát hiện được. Nghiên cứu đã xác định LOD của quy trình mPCR đã tối ưu là 10⁻⁵ ng/µL (tương đương 10 pg/µL). Đây là một mức độ nhạy rất cao, cho thấy quy trình có khả năng phát hiện được tác nhân gây bệnh ngay cả khi chúng chỉ hiện diện với số lượng rất nhỏ trong mẫu. Điều này đảm bảo độ tin cậy của kết quả, giúp sàng lọc hiệu quả và giảm thiểu nguy cơ bỏ sót các mẫu dương tính có nồng độ vi khuẩn thấp.

V. Ý nghĩa và định hướng tương lai cho ngành yến sào Việt

Nghiên cứu xây dựng thành công quy trình phát hiện E.coli trong nhà yến bằng Multiplex PCR có ý nghĩa khoa học và thực tiễn to lớn. Về mặt khoa học, nó cung cấp một công cụ chẩn đoán mạnh mẽ, đặc hiệu và nhanh chóng. Về mặt thực tiễn, quy trình này có thể được ứng dụng rộng rãi trong các hệ thống quản lý chất lượng, từ khâu giám sát môi trường nhà yến đến kiểm tra thành phẩm trước khi đưa ra thị trường. Việc áp dụng phương pháp này sẽ giúp ngành yến sào Việt Nam chủ động kiểm soát rủi ro, đáp ứng các tiêu chuẩn vi sinh cho yến sào ngày càng khắt khe của thế giới. Điều này không chỉ giúp nâng cao chất lượng yến sào mà còn xây dựng lòng tin với người tiêu dùng và các đối tác quốc tế. Trong tương lai, cần mở rộng các nghiên cứu khảo sát trên quy mô lớn hơn, ở nhiều vùng địa lý khác nhau để có cái nhìn toàn diện về sự lưu hành của các chủng E. coli. Đồng thời, cần nghiên cứu phát triển các bộ kit Multiplex PCR E.coli thương mại hóa, tiện lợi và dễ sử dụng để phương pháp này có thể được tiếp cận rộng rãi hơn, góp phần vào sự phát triển bền vững của ngành yến.

5.1. Nâng cao an toàn vệ sinh thực phẩm cho yến sào xuất khẩu

Thị trường xuất khẩu là mục tiêu chiến lược của ngành yến Việt Nam. Để chinh phục các thị trường khó tính, việc tuân thủ các quy định về an toàn vệ sinh thực phẩm yến sào là điều kiện tiên quyết. Việc áp dụng quy trình mPCR để sàng lọc E. coli và các vi sinh vật gây bệnh khác là một bằng chứng mạnh mẽ về cam kết chất lượng. Doanh nghiệp có thể sử dụng kết quả xét nghiệm âm tính như một chứng nhận chất lượng, tăng lợi thế cạnh tranh và dễ dàng vượt qua các rào cản kỹ thuật khi xuất khẩu. Đây là bước đi cần thiết để xây dựng thương hiệu yến sào Việt Nam uy tín và bền vững trên trường quốc tế.

5.2. Đề nghị các giải pháp kiểm soát nhiễm khuẩn chéo hiệu quả

Dựa trên kết quả nghiên cứu cho thấy phân chim là nguồn lây nhiễm chính, các giải pháp cần tập trung vào việc quản lý vệ sinh trong nhà yến. Cần có quy trình vệ sinh, khử trùng định kỳ các bề mặt, dụng cụ thu hoạch. Việc kiểm soát độ ẩm và thông gió hợp lý cũng giúp hạn chế sự phát triển của vi sinh vật. Ngoài ra, cần đào tạo cho người lao động về các thực hành vệ sinh tốt (GHP) để ngăn ngừa nhiễm khuẩn chéo trong nhà yến từ người sang sản phẩm. Việc kết hợp giữa giám sát định kỳ bằng mPCR và các biện pháp phòng ngừa chủ động sẽ tạo ra một hệ thống kiểm soát an toàn vi sinh toàn diện và hiệu quả.

Trích đoạn nội dung tài liệu

mở đầu cho chuỗi phản ứng (Lodish và ctv, 2012). Giai đoạn bắt cặp: tiếp tục hạ nhiệt độ xuống khoảng 50 - 60 °C các liên kết hydro được tái cấu trúc, các cặp môi tương ứng (chiều 5’ - 3”) được gắn vào trình tự DNA mạch khuôn ở đầu 3’. Tuy thuộc vao nhiệt độ bắt cặp của các cặp mỗi mà thiết kế chu trình nhiệt cho phù dé khuếch đại được sản phẩm đặc hiệu và tránh các trường hợp bắt cặp chéo tạo sản phâm phụ (Lodish và ctv, 2012). Giai đoạn kéo đài: tiến hành gia nhiệt lên 72 °C, Taq polymerase liên kết với các DNA sợi đơn, các nucleotide tiến hành bat cặp với mạch khuôn theo nguyên tắc bé sung.

Quá trình được lặp đi lặp lại với chu trình nhiệt không đối thường là 20 - 35 chu kỳ tùy thuộc kích thước DNA mục tiêu với số bản sao tăng lên theo cấp số nhân sau mỗi chu kỳ (Lodish và ctv, 2012). Kỹ thuật điện di Sản phẩm được tạo thành là các đoạn gen chứa trình tự DNA mục tiêu ban đầu, được khuếch đại chính xác ở kích thước mong muốn. Việc phát hiện và phân tích các sản pham PCR được thực hiện nhanh chóng thông qua quá trình điện di các sản phẩm PCR va quan sát trên gel agarose (hoặc poly acrylamide) dưới tia cực tim (Kadri, 2020). Phương pháp phổ biến dé hiển thi band DNA đã phân tích bang điện di gel là u gel trong dung dịch chứa thuốc nhuộm ethidium bromide phát huỳnh quang.

Phân tử dạng phang này gắn với DNA bang cách cài vào giữa các cặp bazơ, làm tăng nồng độ ethidium bromide trong DNA cũng như tăng độ phát huỳnh quang nội tai của nó. Do vậy khi chiếu tia cực tím, các vùng gel chứa DNA sẽ phát huỳnh quang sáng hơn nhiều so với các vùng không chứa DNA (Lodish và ctv, 2012). Minus Solution Minus _ 1 => Apply voltage to the electrode Plus Plus Hình 2. Cơ chế phân tách các phân tử DNA theo kích thước trong điện di (Matsusada Precision: https://www.

Các phan tử DNA mang điện tích âm lớn nên chuyền động về cực dương khi tiến hành điện di gel, phần vật chất gel làm ngăn cản sự khuếch tán ngẫu nhiên nên những phân tử DNA có cùng chiều dài (kích thước) sẽ cùng đi chuyển, tạo thành một band với độ rộng của band bằng độ rộng của các giếng chứa hỗn hợp DNA và chất phát huỳnh quang khi tiến hành chạy điện di. Có nhiều phương pháp điện di gel được ứng dụng, tùy thuộc vào kích thước sản phẩm điện di mong muốn mà lựa chọn phương pháp phù hợp, các phân tử DNA nhỏ khoảng 10 đến 2000 nucleotide được điện di trên gel polyacrylamide, các phân tử DNA lớn hơn từ khoảng 200 nucleotide đến trên 20 kb được điện di trên gel agarose (Lodish và ctv, 2012). Các band của sản phẩm phân tách được quan sát dưới tia cực tím sử dụng chụp ảnh phóng xạ tự ghi (nếu các đoạn được đánh dấu phóng xạ) hoặc nhuộm bằng chất phát 5 huỳnh quang gan DNA (ví dụ là ethidium bromide). Về cơ chế thực hiện phản ứng, EtBr gắn với DNA bằng cách cài vào giữa các cặp bazơ làm tăng nồng độ ethidium trong DNA đồng thời lam tăng độ phát huỳnh quang nội tại của nó.

Vì vậy, các vùng gel có chứa DNA sẽ phát huỳnh quang sáng hơn (tùy thuộc lượng DNA có trong sản phẩm) so với các vùng gel không chứa DNA khi chúng ta chiếu tia cực tím (Lodish và ctv, 2012). Sơ lược về kỹ thuật mPCR (Multiplex Polymerase Chain Reaction) 2. Sơ lược về kỹ thuật mPCR Multiplex PCR, một kỹ thuật được xây dung, cải tiến dựa trên cơ chế của PCR nhằm giúp tiết kiệm được thời gian cũng như hóa chất phản ứng, tổng hợp đồng thời nhiều sản phẩm mục tiêu với các kích thước phân tách khác nhau từ các cặp mồi trong cùng một phản ứng PCR (Markoulatos và ctv, 2002; Nguyễn Thành Luân và ctv, 2019). Bên cạnh việc kiểm tra đồng thời nhiều yêu tố gây bệnh khác nhau, thì phản ứng mPCR có thê kiểm tra nhiều trình tự gen độc lực khác nhau cho cùng một yếu tố gây bệnh ở các chủng vi khuẩn phô biến như: E.

Các ứng dụng của kỹ thuật mPCR có thể ké đến như: phân tích đột biến và đa hình (mutation and polymorphism analysis), phân tích định lượng (quantitative analysis), và phát hiện RNA (RNA detection) (Elnifro và ctv, 2000). Nguyên tắc thực hiện phan ứng mPCR Tương tự như kỹ thuật PCR, ở giai đoạn biến tính DNA sợi đôi được gia nhiệt đến 95 °C và tiến hành tháo xoắn thành DNA mạch đơn. Ở giai đoạn bắt cặp, thay vì chỉ sử dụng một cặp môi thì ở phản ứng mPCR, có thể sử dụng đồng thời nhiều cặp môi tổng hợp cùng lúc các sản phâm PCR mục tiêu có kích thước khác nhau. Tuy nhiên, vì sử dụng đồng thời nhiều cặp môi khác nhau sẽ xảy ra các trường hợp các cặp mồi tự bắt với nhau, tao ra nhiều sản phẩm phụ do cặp môi khuếch đại không đặc hiệu hoặc khả năng bắt cặp chéo, kết thúc quá trình tổng hợp DNA mục tiêu quá sớm, các sản phẩm trong mPCR cho kích thước gần nhau khó quan sát, cặp mỗi này ức chế hoạt động của các cặp môi khác,.

việc kiểm tra các thông số và độ đặc hiệu của các cặp môi trong phản ứng mPCR là cần thiết dé giảm thiểu các trường hop nói trên. Sử dụng các cặp môi có nhiệt độ bắt cặp tương tự nhau, kiểm tra trên các phần mềm Blast của NCBI, Thermo Fisher Scientific (cac trinh ty môi tối có chiều dài từ 18 - 30 bp, %GC từ 35 - 60 %), sự hiện diện của trình tự môi đó không tương đồng trên các bộ gen của các mẫu vi khuẩn khác (Elnifro va ctv, 2000). Sản phẩm mPCR được tạo thành gồm nhiều sản phẩm khác nhau tương ứng với số lượng cặp môi được sử dụng và các đoạn gen đó được khuếch đại chính xác ở kích thước mong muốn. Cách quan sát kết quả tương tự như phản ứng PCR.

Sơ lược về ngành nuôi chim yến và các vấn đề liên quan Trong nhiều năm trở lại đây, ngành nuôi chim yến đã và đang trở thành ngành nghé được quan tâm đầu tư va dem lại lợi nhuận, giá trị kinh tế cao, nhiều nhà nuôi chim yến được xây dựng và đi vào hoạt động, tính đến tháng 12/2018 ghi nhận gần 9000 nhà nuôi chim yến trải dài ở ba miền Bắc, Trung, Nam. Việc phát triển ngành nuôi chim yến sẽ kéo theo những van đề liên quan như việc đảm bảo nguồn thức ăn, chi phí xây dựng và bảo trì nhà nuôi chim yến cũng như việc dam bao chất lượng tổ yến được cung cấp cho người tiêu dùng (Đỗ Văn Hoan, 2018; Nguyễn Lân Hùng Son, 2019). Theo như chúng ta đã biết, tô yến là loại thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao và tốt cho sức khỏe người sử dụng. Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng tô yến như nguồn thức ăn, môi trường làm tô, các bệnh thường gặp do tập tính sinh thái.

Vì vậy, việc phát hiện, phòng ngừa và điều trị là cần thiết (Hồ Thị Loan, 2018). Sơ lược về vi khuẩn E. coli và phân loại các subtypes gây bệnh 2. Sơ lược về vi khuẩn E.

coli Vi khuẩn là những vi sinh vậy nhỏ bé có kích thước hiển vi (1 - 3 uum), cầu tao bởi tế bao nhân sơ, là những vi sinh vật cổ xưa nhất xuất hiện khoảng 3,5 tỷ năm trước đây. Chúng sống ở khắp nơi trên Trái Đất như: đất, nước, không khí và cơ quan ruột ở động vật (như vi khuẩn E.), thực hiện hoạt động dinh dưỡng dưới nhiều hình thức như: hóa tự dưỡng, quang dưỡng, hóa dị dưỡng, quang dị dưỡng hoặc có thê sống trong mối quan hệ ký sinh với cơ thé vật chủ (Vũ Văn Vu, 2015). coli là vi khuẩn gram âm, hiếu khí hoặc ky khí, có dang hình que, phần lớn cau trúc có đuôi dé dé bám dính trên bề mặt vật chủ, thuộc chi Escherichia, thường duoc tìm thấy trong hệ cơ quan đường ruột ở người và động vật nói chung. coli sống ký sinh trong đường ruột ở người và các loài động vật khác, phần lớn không gây hại cho cơ thé vật chủ mà còn giúp tông hợp các chất như: glucose, lactose, chỉ số ít có mang các nhóm mang gen độc lực gây bệnh như ETEC, DAEC, EAEC, EPEC, EHEC,.

là nguyên 7 nhân gây bệnh tiêu chảy các cap ở người và các loài động vật nói chung (Campieri và ctv, 2001; Koochakzadeh va ctv, 2015). Flagellum — Nucleoid (DNA) Ribosomes Cytoplasm Plasma Membrane Capsule Fimbriae (a) Acc.V Spot TM Det WD Exp /————j 2um 30. Hình anh vi khuẩn Z. coli được quan sat.

(a) Cấu tric vi khuẩn E. coli (Dreamtimes: https://www.com); (5) Vi khuan E. coli duoc quan sat dưới độ phóng đại 10961X thuộc chung O157:H7 (Public Heath Image Library (PHIL): https://phil. coli con được xem như một vi sinh vật chi thi cho sự nhiễm phân ở các loài động vật, thông qua phân các nhóm subtypes mang gen độc lực gây bệnh được thải ra môi trường bên ngoài, tùy điều kiện mà chúng có thé tổn tại và phát triển nếu trong thời gian này, các cơ thê động vật khác tiêp xúc với phân có chứa các vi khuân đang phân chia thì nguy cơ cao sẽ lây lan vả hình thành bệnh trên cơ thể vật chủ mới (USGS science for a changing world: https://www.

Phan loại các subtypes E. coli mang gen độc lực gây bệnh Dựa vào kha năng xâm nhập và khả năng sản sinh độc tố mà E. coli được phân thành sáu subtypes: Enteropathogenic EF. co/i (EPEC), Shiga toxin - producing E.

coli (EIEC), Diffusely adherent Z. Bên cạnh đó, người ta da phát hiện thêm một loại E. co/i mới là Adherent invasive E. Typel pili, AIEC — Long polar fimbria ETEC CAECAM6 £7 Muc If# pic EIEC/ Shigella BO Actin Xe @ O lo) (5) © i 6 `.

Actin tail —— Lateral spread I ge © oS Trans- cytosis Granuloma OD Phagosome formation § Enterocyte J\ Goblet cell JN M cell J. ~~ *LEE-positive STEC ° ° ° ` Oo Invasion ° ° \ Macrophage Intraphagosome replication and survival Hinh 2. Co ché hoat động cua các subtypes của E. Co ché gây bệnh của các subtypes cua È.

coli gây bệnh nói chung và ba loại subtypes được dùng trong nghiên cứu này là ETEC, DAEC và EAEC được trình bày ở Hình 2. Về cơ bản, các subtypes này phải bám lên các tế bào ruột của cơ thể vật chủ thì mới có thé gây bệnh. ETEC hay còn gọi là E. coli sinh độc tố ruột sử dụng các yếu tổ xâm lan (CFs) nhằm gắn vào tế bào ruột của cơ thé vật chủ.

DAEC hay còn gọi là E.