Đặt vấn đề Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), sự phát triển khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn là một trong các mối quan tâm cấp thiết nhất đối với sức khoẻ và WHO đã khang định sự phát triển của tình trạng kháng kháng sinh là một trong các mối de doa toàn cầu chính của xã hội loài người. Đặc biệt có vấn đề là mầm bệnh mang tên ESKAPE, với sáu chữ cái ESKAPE đại diện cho các loại vi khuẩn sau: Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa va Enterobacter spp. Việc lựa chọn thay thé thuốc kháng sinh, đặc biệt là với các phương thức hoạt động mới, là vô cùng cần thiết. Việc nghiên cứu va phát triển những hợp chat kháng khuẩn mới là vô cùng quan trọng.
Peptide kháng khuẩn được cho là có kha năng diệt vi khuẩn đa kháng thuốc và hiện dang được nghiên cứu nhằm phát triển thành thuốc kháng vi trùng. Cyclotides là những peptide vòng giàu disulfide, cho đến nay được tìm thấy trong các họ thực vật như Rubiaceae, Violaceae, Fabaceae, Solanaceae và Cucurbitaceae. Cy- clotides rất đa dang về hoạt tính sinh học như kháng khuẩn, khang nắm, kháng ung thư. tùy vào thành phần các amino acid trong chuỗi của cyclotides.
Cấu trúc của cyclotides bao gồm một cấu trúc vòng với khoảng 30 axit amin, sáu gốc cysteine tạo thành ba cầu nôi S-S, tạo thành cấu trúc CCK (cyclic cysteine knot). Với cau trac CCK nay, cyclotide duoc chimg minh bên với nhiệt độ, ánh sang, môi trường hóa chất va enzyme. Các nhóm các nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu các cyclotides thực vật này vì tiềm năng lớn của chúng trong ứng dụng phát triển các sản phẩm phục vụ cho lĩnh vực nông nghiệp và dược học. Mục tiêu của đề tài Mục tiêu chính của đề tài là chiết tách các bộ phân thân, rễ, va lá của Viola sp.
bằng dung môi acetonitrile và nước. Các cao chiết trên được bán tinh sạch bằng phương pháp RP-HPLC. Sau đó, khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và hoạt tinh kháng nam của các cao chiết và các phân đoạn RP-HPLC trên 4 loại vi khuẩn Staphylococcus aureus, Esch- erichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa và trên nam Fusarium sp. Các phân tử giống cyclotides từ cao chiết thân và rễ được xác định bằng phương pháp LC- MS.
Nội dung thực hiện Nội dung 1: Khảo sát hoạt tinh kháng khuẩn của cao chiết và các phân đoạn RP- HPLC có trong Viola sp. trên 4 chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa. Nội dung 2: Khao sát hoạt tính kháng nắm của cao chiết và các phân đoạn RP- HPLC có trong Viola sp. trên nam Fusarium sp.
Khao sát sự hiện diện của cyclotides trong phan rễ và thân của Vi- ola sp. TONG QUAN TÀI LIEU 2. Giới thiệu về Viola sp. Giới thiệu về chỉ Viola và phân loại 2.
Giới thiệu về chỉ Viola Viola là một chi thực vật có hoa trong họ Violaceae. Đây là chi lớn nhất trong họ, chứa từ 525 đến 600 loài. Hầu hết các loài được tìm thấy ở Bắc bán cầu ôn đới, tuy nhiên, một số cũng được tìm thấy ở các khu vực khác nhau rộng rãi như Hawaii, Aus- tralasia và Andes. Hầu hết các loài Viola là cây lâu năm nhỏ, một số là cây hàng năm hay là cây bụi nhỏ.
Một số loài được trồng dé làm hoa cảnh ở biên giới, vườn đá (Prosper Montagne va ctv, 2001). Phan loai Viola sp. được tim thay tai vườn quốc gia Bidoup — Núi Ba. Bộ: Malpighiales Ho: Violaceae Chi: Viola Loài: Viola sp.
Đặc điểm thực vật của Viola sp. thường mọc ở vùng có độ cao khá lớn (thường ở độ cao 1000 m trở lên, mọc cụm tập trung ở gốc, có lá kèm. Hoa đơn độc, có cọng dài, lưỡng tính. Lá đài xếp lợp, trường tồn, cánh hoa xếp lợp.
Những hoa không đều có 1 cánh dưới kéo dài thành cua, bao phan dựng đứng và ít nhiều chum lại thành 1 vòng quanh bau. Bộ nhụy thường gồm 3 lá noãn hợp bên thành bầu thượng, giá noãn bên. Quả nang khi khô tách thành 3 phan, đàn hồi. Hat có lá mam khá dày dé nuôi dưỡng phôi và quả phát triển xung quanh thường có ba thùy.
Rễ có nhiều chồi hút và phát triển như thân rễ. Chúng sinh trưởng bằng thân hoặc rễ, nơi chúng sống tạo thành lớp phủ trên mặt đất (Marcussen và ctv, 2022). Giới thiệu về cyclotides 2. Định nghĩa cyclotides Cyclotides là các peptide mạch vòng có nguồn gốc thực vật có cau trúc Cyclic Cystine Knot (CCK), do có 6 sốc cysteine bị oxy hóa tạo thành 3 liên kết S-S, còn được gọi là cầu nối disulfide thông qua cấu trúc liên kết nút cysteine (Campbell, 2019).
Qua những nghiên cứu từ trước cho đến nay cho thấy cyclotides tồn tại ở một vài loài thực vật, tuy nhiên đa số các nghiên cứu cho thấy rằng cyclotides tồn tại điển hình trong các bộ phận: hoa, lá, thân và rễ của các loài thực vật hạt kin, 5 họ tiêu biểu là: Violaceae, Rubiaceae, Cucurbitaceae, Fabaceae va Solanaceae, trong số đó lên đến 82% các cyclotides đã được công bố có nguồn sốc từ thực vật thuộc họ Violaceae, còn 18% thuộc 4 họ còn lại (Weidmann va Craik, 2016). Lịch sử phát hiện Lịch sử của cyclotides bắt nguồn từ các nghiên cứu về một loại thuốc bản địa ở châu Phi, theo đó, một bác sĩ người Na Uy, Lorents Gran, chú ý rằng phụ nữ châu Phi đã sử dụng một loại trà làm từ cây Oldenlandia affinis (họ Rubiaceae) dé day nhanh qua trình sinh nở (Gran, 1970). Thành phần có hoạt tính co hồi tử cung được tìm thấy là một peptide gọi là kalata B1, được báo cáo là chứa ~ 30 axit amin, nhưng trình tự, cau trúc hoặc bản chất chu kỳ của nó không thể được xác định bằng cách sử dụng các kỹ thuật hóa học protein có sẵn vào đầu những năm 1970 (Sletten và ctv, 1973). Mãi đến năm 1995, ban chất mạch vòng và thắt nút của kalata B1 mới được xác định (Saether và ctv, 1995) như được trình bay trong Hình 2.
Möbius (kalata B1) ET---CVGGT-CNTPG- - WPV-CTRNGLPV bracelet (cycloviolacin O2) ES-- IP-CISSAIG' SKV-CYRNGIP trypsin inhibitor (MCoTI-II) KILKKCRRDSDCPGA- - - GNGYCGSGSDGGV Hình 2. Các cyclotide đại điện từ các phân họ. Qua những nỗ lực nghiên cứu, đến năm 1999 với sự phát triển của khoa học và kỹ thuật, đặc biệt là kỹ thuật phố cộng hưởng từ (NMR) đã xác định được cấu trúc 3D và trình tự cụ thể. Từ đó tên “cyclotides” được dùng để mô tả một đạng peptide vòng với trình tự gồm 28-37 amino acid trong đó có 6 cysteine tạo nên 3 liên kết disulfide.
Cyclotide được chia ra thành ba phân họ Mobius, bracelet, trypsin inhibitor (Hình 2. Hiện nay, nhiều nghiên cứu cho thay cyclotides có các hoạt tinh sinh học nổi bat như: kháng côn trùng, kháng ốc bưu vàng, kháng khuẩn, độc tính lên các tế bào ung thư, kháng HIV. Phân bố Cyclotides trong thực vật thường được tìm thấy ở các loài thực vật hạt kín, cụ thể là được tìm thấy trong năm họ chính của thực vật hat kín, đó là ho Rubiaceae, họ Vio- laceae, họ Bau bí, họ Solanaceae và họ Fabaceae (Weidmann va Craik, 2016). Cyclo- tides có mat khap noi trong ho Violaceae, cho dén nay da duoc tim thay trong s6 trén 35 loài trong ho Violaceae đã được sàng lọc.
Tuy nhiên, chúng tổn tai rat thưa thớt trong các họ khác, chỉ xuất hiện dưới 5% số loài được khảo sát từ họ Rubiaceae (Kehbach và ctv, 2013). Alismate Momordica cochinchinensis Hình 2. Sự phan bố của cyclotides trong thực vật. Các hoạt tính sinh học của cyclotides Ngoài chức năng tự nhiên của cyclotides là chất bảo vệ thực vật.
Cyclotides cũng thể hiện các đặc tinh sinh học bao gồm các hoạt động kháng khuẩn, kháng nam, ức chế HIV và khối u (Oguis và ctv, 2015). Các nghiên cứu về tính kháng khuẩn và kháng nắm của cyclotide Các cyclotides phân họ Mobius thể hiện các mảng ky nước và ưa nước trên các vùng khác nhau trên bề mặt của chúng, phan nào giống với đặc tinh lưỡng tính của các peptide kháng khuẩn cổ điển. Ví dụ, cyclotide Kalata B1 đã được chứng minh là có hoạt tính kháng khuân chống lại vi khuẩn Gram âm và Gram dương. Hoạt tính kháng khuẩn tương tự đã được quan sát thấy với cyclotide được phân lập từ Hedyota biflora (họ Rupiaceae) và C.
Cyclotide kháng khuẩn hoạt động mạnh nhất được thử nghiệm cho đến nay dường như là cyclovilacin O2 cyclotide. Nó đã được chứng minh là có hoạt tính kháng khuẩn chống lại Staphylococcus aureus trong mô hình lây nhiễm ở chuột. Tuy nhiên, khi thử nghiệm trong ống nghiệm, hoạt tính kháng khuẩn của cyclotide dường như chỉ xảy ra trong các điêu kiện phi sinh lý liên quan đền việc sử dụng các chất đệm có cường độ ion thấp, hạn chế rất nhiều tiềm năng phát triển liệu pháp kháng khuẩn (Stromstedt và ctv, 2017). Các nghiên cứu về khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và kháng nắm trên thế giới: Vào năm 2010, Robert Burman và các cộng sự đã nghiên cứu về Cyclotide cy- cloviolacin O2 từ Viola odorata có hoạt tính diệt khuẩn mạnh đối với vi khuẩn Gram âm và cho ra nhận định trong số năm peptide được kiểm tra (cyO2, kalata B1, kalata B2, vaby A và vaby D), cyO2có hoạt tính mạnh nhất, kalata B2 có một số hoạt động chống lại S.
aureus, và vaby A và D ở nồng độ 30-50 uM đã ức chế sự phát triển của E. Đến năm 2016, Mahboobeh Zarrabi và cộng sự đã nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn của hàm lượng cyclotide được tinh chế một phan và chiết xuất thô từ Viola tri- color cho ra kết quả bằng việc sử dụng phương pháp RDA, vi khuẩn nhạy cảm nhất với peptide bán tinh khiết chiết xuất từ hoa của V. coli, với đường kính vùng ức chế là 13 mm. Các chiết xuất etanol thô và butanolic cũng cho thấy các hoạt động chống lại vi khuẩn gram âm E.
aeruginosa tốt hơn so với S. Giá trị MIC là 12,5 mg/ml thực sự đã được xác định đối với một số chủng vi khuan được xử lý bằng dầu thân rễ, trong khi sử dụng phương pháp khuếch tán đĩa, vùng ức chế tăng trưởng đã được phát hiện ở Pseudomonas aeruginosa va Staphylococcus aureus. Hicks và cộng sự đã cho ra công trình nghiên cứu về phân tích Cyclotide kháng khuẩn cho ra quả các peptide V. inconspicua thé hiện hoạt tính sinh học mạnh mẽ chống lại E.
coli ATCC 25922 va K. Hicks Và ctv, 2019). Cả 3 công trình nghiên cứu đều cho thấy cyclotide nói riêng và peptide nói chung trên các loài thuộc chi Viola đều cho hoạt tính kháng khuẩn khá tốt. Phương pháp tỉnh sạch cyclotides Tình sạch cyclotides là quá trình được thực hiện nhằm mục đích phân tách một hoặc nhiều cyclotides ra khỏi cao chiết ban đầu dé thu được cyclotides có độ tinh khiết cao hơn đề tiếp tục cho các bước nghiên cứu tiếp theo.