Đặt vấn đề Lovastatin là một loại thuốc thuộc nhóm statin, có tác dụng làm giảm lượng cholesterol trong máu (Alberts, 1988), được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ phê duyệt lần đầu tiên vào năm 1987 (Radha và Lakshmanan, 2013). Bên cạnh ứng dụng trong sản xuất thuốc điều trị chứng thừa cholesterol, lovastatin còn có tiềm năng ứng dụng trong điều trị Alzheimer, loãng xương và có khả năng ngăn ngừa ung thư (Wang và ctv, 2019). Lovastatin là một hợp chất thứ cấp được sinh ra bởi nhiều loài nấm khác nhau như là Penicillium, Monascus (Endo và ctv, 1976), Hypomyces hay Trichoderma. Khả năng sản xuất lovastatin của các ching nam khác nhau đã được báo cáo trong nhiều nghiên cứu, trong đó Aspergillus terreus được xem là chủng nấm có khả năng sinh tổng hợp lovastatin tốt nhất (Javel và ctv, 2010).
Trên thé giới đã có nhiều nghiên cứu tìm hiểu về kha năng sinh lovastatin của các chủng A. ferreus, tuy nhiên vẫn còn khá ít nghiên cứu trong lĩnh vực này được thực hiện ở Việt Nam. Cacbon và nito được cho là những chất dinh dưỡng quan trọng nhất đối với sự phát triển của nấm men và sản xuất các chất chuyên hóa của chúng. Nguồn cabon thường liên quan đến sản xuất các hợp chất thứ cấp, trong khi nitơ chủ yếu tác động lên sự phát triển của nắm.
Môi trường bình thường thường bao gồm nguồn carbon, nguồn nitơ, nước, muối và vi chất dinh dưỡng. Trong quá trình lên men công nghiệp, việc sử dụng các nguồn nitơ hữu cơ còn nhiều hạn chế do chi phí cao. Tuy nhiên, một số lượng nghiên cứu cho rằng các nguồn nitơ hữu cơ hiệu quả trong việc hỗ trợ sự phát triển của A. Vì vậy, đề tài này hướng tới mục tiêu khảo sát ảnh hưởng của một số nguồn cơ chat trong môi trường nuôi cấy đến quá trình sinh tổng hợp lovastatin của chủng nam A.
Từ đó, góp phan tạo nền tảng cho các nghiên cứu thực hiện ở quy mô pilot. Mục tiêu đề tài Khảo sát ảnh hưởng của một số nguồn cacbon và nguồn nitơ trong môi trường nuôi cây đến khả năng sinh tổng hop lovastatin của chủng nam A. Nội dung thực hiện Nội dung 1: Đánh giá đặc điểm hình thái đại thé và vi thé của chủng A. Nội dung 2: Định lượng lovastatin trong san phẩm nuôi cấy chủng nam A.
Khảo sát nhiệt độ nuôi cấy chủng nấm _ A. ferreus sinh tổng hợp lovastatin. Nội dung 4: Khao sát anh hưởng của các nguồn cacbon khác nhau đến kha năng sinh tong hop lovastatin của A. Nội dung 5: Khao sát ảnh hưởng của các nguồn nito khác nhau đến khả năng sinh tong hop lovastatin của A.
TONG QUAN TÀI LIEU 2. Giới thiệu về nam A. Phân loại Giới: Fungi Ngành: Ascomycota Lớp: Eurotiomycetes Bộ: Eurotiales Họ: Trichocomaceae Chi: Aspergillus Loài: Aspergillus terreus 2. Đặc điểm của A.
terreus Về cau tao, theo mô tả của Gunde-Cimerman va ctv vào năm 1993, A. ferreus là nam sợi, sợi nam có dang hình ống phân nhánh bên trong chứa chat nguyên sinh có thé lưu động. Chúng có sự sinh trưởng vô hạn về chiều dài, nhưng đường kính sợi chỉ khoảng 1-30 um. Phần đầu của sợi nắm được gọi là vùng kéo dai (extension zone), có hình viên trụ.
Trong giai đoạn sinh trưởng mạnh mẽ của nắm, vùng kéo đài là vùng mà thành tế bao phát triển nhanh chóng, có thé đạt chiều dài đến 30 um. Trong các tế bào thường có 1-2 nhân, phần ngọn của sợi nắm thường tập trung nhiều nhân hơn. Về hình thái vi thể, nắm A. ferreus được mô tả như sau: có hệ sợi phân nhánh, có vách ngăn, không màu, màu nhạt hoặc trong sam mau; Giá bào tử trần không có nhánh, không có hoặc ít có vách ngăn ngang, có phần đỉnh to ra thành bọng hình trùy, hình elip hoặc hình nửa cầu; Khối bào tử trần đính bọng có thể có dạng hình cột hoặc hình tia tỏa tròn.
Bảo tử có dạng hình cầu, đường kính từ 2-3 um (Gautam va ctv, 2012). Về hình thái dai thể, khuẩn lạc nam A. ferreus có màu vàng nhạt đến nâu quế, có núm (umbonate) lồi lên ở giữa. Rìa khuẩn lạc trơn.
Tốc độ phát triển tương đối nhanh (Gautam và ctv, 2012). Một số hợp chất được phân lập từ A. terreus là chủng nam được sử dụng phô biến trong công nghiệp sản xuất acid hữu cơ, vi dụ như acid itaconic và acid cis-aconitic. Day là những vật liệu chịu nhiệt (refractory), ứng dụng trong sản xuất polymer.
Ngoài ra, người ta còn tách chiết được nhiều hợp chất khác có hoạt tính sinh học như terreulactones A, territrem A. terreus cũng sinh ra các sinh ra một sô độc tô nâm moc như citreovividin, terreusinone (Steinmetz và ctv, 1996). OH H N ` \ Yon Oo Citreovividin Terreusinone Hình 2.1 Một số hợp chất được sinh tổng hop boi chủng nam Aspergillus terreus. Đặc biệt, chủng nam nay là chủng nam đầu tiên và đóng vai trò rất quan trọng trong công nghiệp sản xuất lovastatin, một loại thuốc làm giảm cholesterol trong máu (Demain, 1989).
Phương pháp lên men chìm và lên men bán rắn thường được ứng dụng trong nuôi cấy A. terreus sinh tổng hợp lovastatin ở quy mô công nghiệp. ferreus cũng gây ra nhiễm trùng cơ hội ở những người có hệ thống miễn dịch bị suy giảm. Giới thiệu về lovastatin 2.
Cau tạo và tính chất hóa học Công thức phân tử: C24H36Os. Khối lượng phân tử: 404,5 g/mol. Lovastatin có cấu trúc tinh thé, màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 174,5°C, nhiệt độ sôi 559,198°C tại 760 mmHg, khối lượng riêng: 1,122 g/cm3, nhiệt hóa hơi (1H=96,691 kJ/mol), LD50 trên chuột >1000 mg/kg. Lovastatin tan tốt trong các dung môi it phân cực như chloroform, kém tan trong nước.
HO PR i COOH ` OH J a b Hình 2.2 Cấu trúc hóa hoc của Lovastatin. Lovastatin tồn tai ở 2 dang là dạng axit va dang lactone, khi phân tích trên hệ thống Sắc ký lỏng hiệu năng cao thì thời gian lưu của lovastatin dang acid thấp hơn so với thời gian lưu của lovastatin dang lactone (Friedrich va ctv, 1995). Lovastatin trong diéu tri cholesterol mau cao Lovastatin là một polyketide từ nắm được sử dụng làm thuốc hạ cholesterol, hoạt động nhờ cơ chế ức chế (3S)-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A (HMG-CoA) reductase (Money, 2016). Ngăn cản quá trình chuyển HMG-CoA thành mevalonate, tiền chất của cholesterol, từ đó làm giảm lượng cholesterol trong tế bảo gan.
Lovastatin được kê đơn dưới tên Mevacor và được dùng bằng đường uống. Liều lovastatin được sử dụng dé điều trị tăng cholesterol máu là 10, 20 và 40 mg, với liều tối đa là 80 mg/ngày (Valentovic, 2007). Theo nghiên cứu của Hoeg và Brewer (1978), Lovastatin có thé làm giảm 33% cholesterol toàn phan. Tình hình sản xuất lovastatin trong và ngoài nước Trên thế giới, ngành công nghiệp sản xuất thuốc điều trị chứng thừa cholesterol có giá trị kinh tế rất lớn.
Theo Valentovic (2007), những loại thuốc như lovastatin, simvastatin va lipitor đã tạo ra doanh thu hang tỷ đô la cho Pfizer, AstraZeneca, Merck và Novartis. Tại Việt Nam, các loại thuốc thuộc nhóm statin trong đó có lovastatin đã được sử dụng rộng rãi trong các phác đồ điều trị cholesterol máu cao hay các bệnh về tim mạch. Tuy nhiên, các loại thuốc này đều phải nhập khẩu từ nước ngoài hoặc được bào chế và đóng gói từ nguồn statin ngoại nhập. Chưa có đơn vị trong nước nào tham gia sản xuất lovastatin, mặc dù công nghệ sản xuất lovastatin đã đăng ký tại Bắc Mỹ và Châu Âu từ năm 1979 và đã hết hạn bảo hộ độc quyền từ năm 2009 (Nguyễn Văn Bích, 2013).
Tiềm năng ứng dụng của lovastatin Bên cạnh khả năng làm giảm cholesterol trong mau, lovastatin cũng có tác dụng chống viêm, chống ung thư và bảo vệ thần kinh. Các nghiên cứu trên tế bào và động vật đã phát hiện ra rằng statin có tác dụng chống tăng sinh, chống xâm lấn và chống tạo mạch đáng ké (Mei và ctv, 2017; Farooqi, 2018). Ở một số nghiên cứu khác, người ta đã chỉ ra lovastatin có thể ức chế sự tăng sinh và thúc đây quá trình chết theo chương trình ở nhiều loại té bao ung thư khác nhau, chăng hạn như vú, ruột kết (Sassano và Platanias, 2008), gan (Vallianou và ctv, 2014) và cô tử cung (Ma và cộng sự, 2016). Ngoài ra, việc sử dụng kết hợp lovastatin và các loại thuốc hóa trị liệu khác có thé làm giảm khả năng kháng thuốc của tế bào ung thu, do đó cai thiện đáng kể hiệu quả điều trị của các loại thuốc này (Khandelwal Gilman và ctv, 2021).
Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về ứng dụng chủng A. terreus trong sản xuất lovastatin 2. Các nghiên cứu trong nước Tại Việt Nam, các nghiên cứu về ứng dụng chủng nam A. ferreus trong sản xuất lovastatin còn rất ít.
Năm 2011, Quyền Đình Thi và cộng sự đã nghiên cứu thăm dò khả năng tông hop lovastatin từ các chủng nấm A. ferreus và đã lựa chọn được chủng sinh tông hợp lovastatin cao bằng kỹ thuật đột biến. Kết quác cho thấy nhóm nghiên cứu đã tuyên chon được 22 dòng siêu sản xuất lovastatin trong tổng số 43 dòng đột biến của chủng A. terreus ATCC 20542 và A.
Gần đây, nhóm nghiên cứu của Nguyễn Phạm Tuấn và cộng sự (2021) đã thực hiện đánh giá ảnh hưởng của các yêu tố đến quá trình sản xuất lovastatin từ chủng nam Aspergillus terreus EV8 bằng phương pháp lên men bán rắn. Kết quả đã chi ra được cơ chất (gạo trang), nguồn cacbon (glucose 5 g/L), nguồn nitơ (pepton 5 g/L) và thời gian lên men (8 ngày) cho hàm lượng lovastatin cao nhất đạt 4,66 mg/g. Nhìn chung, các nghiên cứu đã thu được kết quả bước đầu và tạo tiền đề cho việc sản xuất lovastatin bằng chủng nam A. Song vẫn còn nhiều khía cạnh nghiên cứu vẫn chưa được khai thác.
Có thé nói, cơ sở dữ liệu về ứng dụng các chủng nam thuộc loài A. ferreus trong sản xuất lovastatin tại Việt Nam vẫn chưa được hoàn thiện. Các nghiên cứu trên thế giới Các nghiên cứu về quá trình sản xuất lovastatin của A. ferreus bắt đầu từ rất sớm.
Từ những năm 1980, các công trình nghiên cứu về cơ chế di truyền và hóa học quyết định sự hình thành của lovastatin đã được thực hiện (Albers-Schoenberg và ctv, 1981; Albert và ctv, 1980; Monaghan va ctv, 1980). Các nghiên cứu đa khía cạnh trong lĩnh vực này đã được thực ở nhiều trường đại học trên thế giới, trong đó có Đại học Almeria (Andalusia, Tây Ban Nha), Đại học Công nghệ Lodz (Ba Lan), Đại học Công nghệ Chaoyang (Đài Loan), Đại học Milan (Ý), Đại học Ky thuật Budapest (An D6),. Qua đó, các khía cạnh liên quan đến ảnh hưởng của các thành phan môi trường, nồng độ oxy hòa tan, hình thái viên nam (pellets). đối với sự hình thành lovastatin đã được xác định.
Nồng độ lovastatin thu được bằng phương pháp nuôi cấy chìm được ghi nhận là khoảng 10-1000 mg/l, tùy theo chủng nấm và điều kiện nuôi cấy.