Nghiên cứu điều kiện và môi trường nuôi cấy nhân giống sâm Ngọc Linh in vitro

Luận văn tốt nghiệp kỹ thuật nghiên cứu tốt nghiệp công nghệ sinh học investigation of some cultural conditions and media on the growth of, điều tra thực trạng, phân tích số liệu,

• Tác giả: Nguyễn Thị Trúc My
• Người hướng dẫn: ThS. Phạm Văn Hiếu
• Trường học: Nông Lâm University-Ho Chi Minh City
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Investigation Of Some Cultural Conditions And Media On The Growth Of In-Vitro Propagation Of Ngoc Linh Ginseng (Panax Vietnamensis Ha Et Grushv.)
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2018-2022
• Địa điểm: Thủ Đức City

Mục lục chi tiết

• ACKNOWLEDGEMENT
• AFFIRMATION AND COMMITMENT
• ABSTRACT
• LIST OF ABBREVIATIONS
• LIST OF TABLES
• LIST OF FIGURES
• 1. CHAPTER 1: INTRODUCTION
• 1.1. Research objectives
• 1.2. Research contents
• 2. Origin and distribution
• 3. Morphological characteristics
• 4. Ecological characteristics
• 5. The value of Panax vietnamensis
• 5.1. The medicinal value
• 5.2. The economic values
• 6. Factors affecting the growth of Ngoc Linh ginseng
• 6.1. The light
• 6.2. Temperature
• 6.3. Humidity
• 6.4. Plant Growth Regulator
• 7. Studies of Viet Nam ginseng in domestic and the world
• 7.1. Domestic studies
• 8. Introduction to plant tissue culture
• 8.1. Totipotency of plant cells
• 8.2. Differentiation and dedifferentiation of plant cells
• 8.3. Methods of plant tissue culture
• 3. CHAPTER 3. MATERIALS AND METHODS
• 3.1. Time and location
• 3.2. Material and Design
• 3.3. Medium and chemicals used
• 3.4. Experimental Design
• 3.4.1. Investigation of the effect of light intensity on the growth of in-vitro Ngoc Linh ginseng cultured in MS and SH media
• 3.4.1.1. Cultured in MS medium
• 3.4.1.2. Cultured in SH medium
• 3.4.2. Investigation of the effect of day and night temperature on the growth of in-vitro Ngoc Linh ginseng cultured in MS and SH media
• 3.4.2.1. Cultured in MS medium
• 3.4.2.2. Cultured in SH medium
• 3.4.3. Investigation of the culture medium affecting the growth of in-vitro Ngoc Linh ginseng
• 3.5. Statistical Analysis
• 4. RESULTS AND DISCUSSION
• 4.1. Effect of light intensity on the growth of in-vitro Ngoc Linh ginseng cultured in MS and SH media
• 4.1.1. Cultured in MS medium
• 4.1.2. Cultured in SH medium
• 4.2. Effect of MS and SH on the growth of in-vitro Ngoc Linh ginseng
• CONCLUSION AND SUGGESTIONS
• REFERENCES

Tóm tắt

I. Bí quyết nhân giống sâm Ngọc Linh Vai trò môi trường nuôi cấy

Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) là một dược liệu đặc hữu quý hiếm của Việt Nam, được mệnh danh là “Quốc bảo” với nhiều công dụng y học vượt trội. Tuy nhiên, việc khai thác quá mức đã đẩy loài sâm này đến nguy cơ tuyệt chủng, đặt ra yêu cầu cấp thiết về việc bảo tồn nguồn gen sâm. Nhân giống sâm Ngọc Linh bằng phương pháp truyền thống gặp nhiều khó khăn do tỷ lệ nảy mầm của hạt thấp và thời gian sinh trưởng kéo dài. Để giải quyết vấn đề này, phương pháp nhân giống sâm Ngọc Linh bằng kỹ thuật in vitro hay nuôi cấy mô sâm Ngọc Linh đã được áp dụng như một giải pháp đột phá. Kỹ thuật này không chỉ giúp tạo ra số lượng lớn cây giống sâm Ngọc Linh đồng đều về mặt di truyền trong thời gian ngắn mà còn giúp bảo tồn nguồn gen quý. Tuy nhiên, thành công của phương pháp này phụ thuộc rất lớn vào việc thiết lập một môi trường nuôi cấy tối ưu. Các yếu tố như thành phần dinh dưỡng của môi trường, chất điều hòa sinh trưởng, cường độ ánh sáng, và nhiệt độ đều ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và phát triển của cây. Việc nghiên cứu và xác định các điều kiện nuôi cấy lý tưởng là chìa khóa để nâng cao hiệu suất nhân giống, đảm bảo cây con có tỷ lệ sống cao và chất lượng tốt nhất khi đưa ra trồng ngoài tự nhiên. Nội dung bài viết này sẽ đi sâu vào phân tích các nghiên cứu về môi trường nuôi cấy, từ đó đưa ra những kết luận khoa học và ứng dụng thực tiễn.

1.1. Sâm Ngọc Linh Panax vietnamensis Báu vật của y học Việt Nam

Sâm Ngọc Linh, còn được biết đến với tên khoa học là Panax vietnamensis, là một loài thực vật thân thảo thuộc họ Araliaceae. Loài sâm này được phát hiện vào năm 1973 tại vùng núi Ngọc Linh thuộc hai tỉnh Kon Tum và Quảng Nam. Điểm đặc biệt của Sâm Ngọc Linh là thành phần hóa học độc đáo, chứa đến 52 hợp chất saponin khác nhau. Trong đó, có nhiều saponin quý hiếm không tìm thấy ở các loại sâm khác trên thế giới, đặc biệt là Majonoside-R2 (M-R2) chiếm tỷ lệ cao. Các hợp chất này mang lại nhiều tác dụng dược lý như chống stress, tăng cường hệ miễn dịch, bảo vệ gan và phòng chống ung thư. Do giá trị kinh tế và y học cao, sâm Ngọc Linh tự nhiên đã bị khai thác cạn kiệt, được ghi nhận trong Sách Đỏ Việt Nam là loài cần được bảo vệ khẩn cấp. Do đó, việc nghiên cứu Panax vietnamensis propagation (nhân giống Panax vietnamensis) là một nhiệm vụ chiến lược.

1.2. Kỹ thuật vi nhân giống Giải pháp bảo tồn và phát triển bền vững

Trước những thách thức của phương pháp nhân giống bằng hạt, kỹ thuật in vitro (hay vi nhân giống) đã mở ra một hướng đi mới. Đây là quy trình nhân giống cây trồng trong môi trường nhân tạo vô trùng, từ một bộ phận nhỏ của cây mẹ như lá, thân, hoặc rễ. Kỹ thuật này cho phép sản xuất hàng loạt cây con mang đặc tính di truyền giống hệt cây mẹ. Đối với sâm Ngọc Linh, nuôi cấy mô sâm Ngọc Linh giúp khắc phục các nhược điểm như thời gian nảy mầm dài, tỷ lệ sống thấp và sự tấn công của côn trùng. Hơn nữa, phương pháp này cho phép các nhà khoa học chủ động kiểm soát môi trường sống, từ đó tối ưu hóa sự phát triển của cây và thậm chí là tăng cường hàm lượng saponin. Đây được xem là công cụ hiệu quả nhất để vừa đáp ứng nhu cầu thị trường về cây giống, vừa góp phần quan trọng vào công tác bảo tồn nguồn gen sâm.

II. Thách thức khi nhân giống sâm Ngọc Linh Tìm môi trường tối ưu

Mặc dù kỹ thuật in vitro mang lại nhiều ưu điểm, quá trình nhân giống sâm Ngọc Linh trong phòng thí nghiệm không hề đơn giản. Đây là một loài cây nhạy cảm và đòi hỏi các điều kiện sinh thái rất khắt khe, tương tự như môi trường tự nhiên trên đỉnh Ngọc Linh. Thách thức lớn nhất là việc xác định chính xác công thức môi trường nuôi cấy phù hợp. Mỗi yếu tố, từ nồng độ muối khoáng, vitamin, đường, đến loại và tỷ lệ các chất điều hòa sinh trưởng (auxin, cytokinin) đều có thể tác động đến sự hình thành chồi, rễ, hoặc thậm chí là gây chết mẫu cấy. Ngoài ra, các yếu tố vật lý như điều kiện khí hậu trong phòng nuôi cấy, bao gồm cường độ ánh sáng, nhiệt độ ngày đêm, và độ ẩm, cũng đóng vai trò quyết định. Một sai lệch nhỏ trong các yếu tố này có thể dẫn đến hiện tượng cây phát triển còi cọc, lá úa vàng, hoặc hình thành callus không mong muốn thay vì tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Việc nghiên cứu một cách bài bản và khoa học để tìm ra tổ hợp điều kiện tối ưu là yêu cầu bắt buộc, nhằm xây dựng một quy trình vi nhân giống ổn định, hiệu quả và có khả năng nhân rộng trên quy mô công nghiệp, từ đó tạo ra những cây giống sâm Ngọc Linh khỏe mạnh.

2.1. Hạn chế của phương pháp nhân giống truyền thống bằng hạt

Nhân giống sâm Ngọc Linh bằng hạt đối mặt với nhiều rào cản. Thứ nhất, hạt sâm có thời gian ngủ nghỉ kéo dài, cần đến vài tháng để nảy mầm, làm tăng nguy cơ bị côn trùng và động vật phá hoại. Tỷ lệ nảy mầm tự nhiên rất thấp. Thứ hai, cây con phát triển chậm, cần 5-8 năm mới có thể thu hoạch để đảm bảo đủ hàm lượng saponin. Quá trình chăm sóc dài ngày này đòi hỏi điều kiện nghiêm ngặt về độ pH đất, độ ẩm và ánh sáng tán xạ dưới tán rừng, rất khó để kiểm soát và dễ bị ảnh hưởng bởi sâu bệnh. Những hạn chế này khiến việc sản xuất cây giống quy mô lớn bằng hạt không thể đáp ứng nhu cầu thị trường và công tác bảo tồn.

2.2. Sự phức tạp trong việc thiết lập môi trường nuôi cấy in vitro

Việc chuyển từ môi trường tự nhiên sang môi trường nhân tạo đòi hỏi sự mô phỏng chính xác các điều kiện sống lý tưởng của sâm Ngọc Linh. Sự tương tác giữa các thành phần dinh dưỡng trong giá thể trồng sâm nhân tạo rất phức tạp. Ví dụ, tỷ lệ giữa amoni và nitrat có thể làm thay đổi độ pH của môi trường, ảnh hưởng đến khả năng hấp thụ dinh dưỡng của cây. Theo nghiên cứu của Dương Tấn Nhựt và cộng sự (2011), sự khác biệt về nồng độ nitơ giữa môi trường MS và môi trường SH là một trong những nguyên nhân chính dẫn đến hiệu quả sinh trưởng khác nhau. Việc tìm ra công thức môi trường hoàn hảo, cân bằng giữa các yếu tố đa lượng, vi lượng và hormone sinh trưởng, là một bài toán khoa học đầy thách thức.

III. Cách tối ưu ánh sáng và nhiệt độ cho cây giống sâm Ngọc Linh

Ánh sáng và nhiệt độ là hai yếu tố vật lý quan trọng, tác động trực tiếp đến quá trình quang hợp và các hoạt động trao đổi chất, quyết định sự sinh trưởng và phát triển của cây giống sâm Ngọc Linh in vitro. Sâm Ngọc Linh vốn là loài cây ưa bóng, sinh trưởng dưới tán rừng rậm với độ che phủ trên 80%. Do đó, trong môi trường nuôi cấy, việc cung cấp ánh sáng tán xạ với cường độ phù hợp là cực kỳ cần thiết. Ánh sáng quá mạnh có thể gây ức chế quang hợp, cháy lá, trong khi ánh sáng quá yếu sẽ khiến cây quang hợp kém, thân yếu và lá xanh nhạt. Tương tự, nhiệt độ cũng cần được kiểm soát chặt chẽ. Sâm Ngọc Linh phát triển tốt trong điều kiện khí hậu mát mẻ, với nhiệt độ ban ngày và ban đêm có sự chênh lệch rõ rệt. Sự chênh lệch này mô phỏng điều kiện khí hậu tự nhiên tại vùng núi cao, giúp kích thích quá trình tạo rễ và tích lũy các hợp chất thứ cấp, bao gồm cả hàm lượng saponin. Việc tìm ra ngưỡng ánh sáng và nhiệt độ tối ưu thông qua thực nghiệm là bước đi nền tảng để xây dựng một quy trình nhân giống sâm Ngọc Linh hiệu quả.

3.1. Xác định cường độ ánh sáng tối ưu cho sự phát triển của chồi

Nghiên cứu của Nguyễn Thị Trúc My (2023) đã tiến hành khảo sát ảnh hưởng của các cường độ ánh sáng khác nhau (5, 10, 15, 20 µmol.s⁻¹) lên cây sâm Ngọc Linh in vitro. Kết quả sau 12 tuần cho thấy, cường độ ánh sáng 20 µmol.s⁻¹ là điều kiện lý tưởng nhất. Ở mức này, các chỉ số về số lá, số rễ, chiều cao chồi và hàm lượng diệp lục đều đạt giá trị cao nhất. Cây có lá màu xanh đậm, phát triển đồng đều và khỏe mạnh. Ngược lại, ở các cường độ ánh sáng thấp hơn, cây có xu hướng phát triển kém, lá nhạt màu và đặc biệt là xuất hiện nhiều callus (mô sẹo), một hiện tượng không mong muốn trong quá trình vi nhân giống.

3.2. Tầm quan trọng của nhiệt độ ngày đêm đối với sự tạo rễ

Nhiệt độ môi trường ảnh hưởng sâu sắc đến các phản ứng sinh hóa của cây. Thí nghiệm về nhiệt độ ngày-đêm đã được thực hiện ở các mức 23-13°C, 23-15°C và 23-18°C. Kết quả chỉ ra rằng, cặp nhiệt độ ngày-đêm 23-15°C là phù hợp nhất cho sự phát triển toàn diện của sâm Ngọc Linh. Đặc biệt, ở điều kiện này, số lượng rễ của cây đạt mức cao nhất. Rễ là bộ phận quan trọng, không chỉ giúp cây hấp thụ dinh dưỡng mà còn là nơi tích lũy saponin chính. Một hệ rễ khỏe mạnh là tiền đề để cây giống sâm Ngọc Linh có tỷ lệ sống cao sau khi chuyển ra vườn ươm. Nhiệt độ đêm quá thấp (13°C) hoặc không đủ chênh lệch (18°C) đều cho kết quả kém hơn.

IV. Lựa chọn môi trường nuôi cấy sâm Ngọc Linh So sánh MS và SH

Thành phần dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy là yếu tố cốt lõi, cung cấp các nguyên tố đa lượng, vi lượng, vitamin và nguồn năng lượng cho cây phát triển. Trong nuôi cấy mô sâm Ngọc Linh, hai loại môi trường nền được sử dụng phổ biến nhất là môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962) và môi trường SH (Schenk & Hildebrandt, 1972). Môi trường MS là loại môi trường phổ thông, có nồng độ muối khoáng cao, phù hợp với nhiều loại cây thân thảo. Trong khi đó, môi trường SH được điều chỉnh với nồng độ ion amoni và nitrat thấp hơn, được cho là phù hợp hơn với các loài cây nhạy cảm hoặc khó tính. Việc lựa chọn giữa MS và SH không chỉ ảnh hưởng đến tỷ lệ tái sinh và tốc độ sinh trưởng và phát triển của cây mà còn tác động đến hình thái của cây con. Bên cạnh đó, việc bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng như Kinetin và các chất phụ gia hữu cơ như nước dừa cũng đóng vai trò quan trọng trong việc kích thích sự phân chia tế bào và biệt hóa cơ quan. Nghiên cứu so sánh trực tiếp hiệu quả của hai loại môi trường này là cần thiết để tìm ra công thức giá thể trồng sâm tối ưu.

4.1. Môi trường MS Ưu điểm và hạn chế khi nuôi cấy sâm

Môi trường MS là một công thức kinh điển trong nuôi cấy mô thực vật. Nó cung cấp đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của tế bào. Tuy nhiên, đối với sâm Ngọc Linh, nồng độ ion cao trong môi trường MS có thể gây ra hiện tượng “ngộ độc muối”, làm thay đổi độ pH đất (môi trường) và cản trở sự hấp thu dinh dưỡng. Trong nghiên cứu của Nguyễn Thị Trúc My (2023), cây sâm nuôi cấy trên môi trường MS cho kết quả sinh trưởng tốt nhưng vẫn kém hơn so với môi trường SH. Một nhược điểm đáng chú ý là cây trên môi trường MS có xu hướng hình thành nhiều callus hơn, đặc biệt trong điều kiện ánh sáng yếu.

4.2. Môi trường SH Giải pháp tối ưu cho cây sâm Ngọc Linh nhạy cảm

Môi trường SH được chứng minh là lựa chọn vượt trội hơn cho việc nhân giống sâm Ngọc Linh. Theo kết quả nghiên cứu, tất cả các chỉ số sinh trưởng của cây trên môi trường SH (số lá, số rễ, chiều cao chồi, hàm lượng diệp lục) đều cao hơn so với môi trường MS. Đặc biệt, cây phát triển trên môi trường SH có bộ rễ khỏe hơn và hình thái đẹp hơn, lá xanh mướt, cho thấy khả năng quang hợp và hấp thụ dinh dưỡng tốt. Nồng độ muối khoáng cân bằng hơn trong môi trường SH giúp tạo ra điều kiện thuận lợi, giảm stress cho loài cây vốn nhạy cảm như sâm Ngọc Linh, từ đó thúc đẩy sự sinh trưởng và phát triển một cách toàn diện.

V. Hướng đi tương lai cho việc nhân giống sâm Ngọc Linh bền vững

Kết quả từ các nghiên cứu về môi trường nuôi cấy đã cung cấp những dữ liệu khoa học quý giá, làm cơ sở để hoàn thiện quy trình nhân giống sâm Ngọc Linh bằng kỹ thuật in vitro. Việc xác định được điều kiện tối ưu về ánh sáng (20 µmol.s⁻¹), nhiệt độ (23-15°C) và môi trường dinh dưỡng (môi trường SH) mở ra tiềm năng sản xuất cây giống sâm Ngọc Linh trên quy mô lớn. Ứng dụng các kết quả này vào thực tiễn sẽ giúp các trung tâm giống và doanh nghiệp tạo ra nguồn cây con chất lượng cao, đồng đều, sạch bệnh với chi phí hợp lý. Điều này không chỉ đáp ứng nhu cầu trồng trọt, phát triển kinh tế cho các địa phương có điều kiện tự nhiên phù hợp mà còn là một bước tiến quan trọng trong chiến lược bảo tồn nguồn gen sâm quốc gia. Tuy nhiên, đây mới chỉ là bước khởi đầu. Các nghiên cứu trong tương lai cần tiếp tục tối ưu hóa quy trình, đặc biệt là giai đoạn huấn luyện cây con sau khi ra khỏi môi trường in vitro để nâng cao tỷ lệ sống và thích nghi. Đồng thời, cần nghiên cứu sâu hơn về ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến hàm lượng saponin để tối đa hóa giá trị dược liệu của cây trồng.

5.1. Ứng dụng kết quả vào sản xuất cây giống sâm quy mô lớn

Từ các thông số kỹ thuật đã được xác định, một quy trình chuẩn về vi nhân giống sâm Ngọc Linh có thể được xây dựng và chuyển giao. Các phòng nuôi cấy mô có thể thiết lập hệ thống buồng nuôi với các điều kiện ánh sáng, nhiệt độ được kiểm soát tự động. Việc sử dụng môi trường SH làm nền sẽ giúp nâng cao hiệu suất và chất lượng cây giống. Quy trình này cho phép sản xuất hàng chục nghìn cây giống mỗi năm từ một vài cây mẹ ban đầu, giải quyết triệt để bài toán về nguồn giống, góp phần đưa sâm Ngọc Linh trở thành cây trồng chủ lực, phát triển kinh tế vùng cao.

5.2. Nghiên cứu sâu hơn về phòng trừ sâu bệnh và hàm lượng hoạt chất

Hướng nghiên cứu tiếp theo nên tập trung vào giai đoạn vườn ươm, sau khi cây ra khỏi chai mô. Cần nghiên cứu các loại giá thể trồng sâm phù hợp và các biện pháp phòng trừ sâu bệnh sinh học để giảm thiểu tỷ lệ hao hụt. Bên cạnh đó, việc phân tích, so sánh hàm lượng saponin giữa cây nuôi cấy mô và cây mọc tự nhiên là rất cần thiết. Các nghiên cứu có thể khảo sát việc bổ sung các chất kích kháng hoặc thay đổi điều kiện nuôi cấy để kích thích cây tạo ra nhiều hoạt chất quý, nâng cao giá trị thương phẩm của sản phẩm cuối cùng, hướng tới sự phát triển bền vững cho ngành sâm Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY-HO CHI MINH CITY FACULTY OF BIOLOGICAL SCIENCES INVESTIGATION OF SOME CULTURAL CONDITIONS AND MEDIA ON THE GROWTH OF IN-VITRO PROPAGATION OF NGOC LINH GINSENG (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) Major : BIOTECHNOLOGY Student : NGUYEN THI TRUC MY Student ID : 18126228 Academic year : 2018-2022 Thu Duc City, 08/2023 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY-HO CHI MINH CITY FACULTY OF BIOLOGICAL SCIENCES UNDERGRADUATE THESIS INVESTIGATION OF SOME CULTURAL CONDITIONS AND MEDIA ON THE GROWTH OF IN-VITRO PROPAGATION OF NGOC LINH GINSENG (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) Advisor Student MSc. Pham Van Hieu Nguyen Thi Truc My Thu Duc City, 08/2023 ACKNOWLEDGEMENT First, I would like to express my deep gratitude to the Biotechnology Center of Ho Chi Minh City for providing all budget, machinery, equipment, and chemicals for the experiment thesis. I would like to express my gratitude to MSc. Pham Van Hieu, who dedicatedly guided me with a lot of knowledge, corrections, and I also would like to thank Dr.

Nguyen Xuan Dung, who created favorable conditions for me during the process of making my thesis. I wish to thank the Board of Directors of Nong Lam University - Ho Chi Minh City, the administrators of the Faculty of Biological Sciences, and all the lecturers for providing me with the necessary resources to pursue my studies there. Thanks to the guidance and teaching of yours, I can apply it to solve problems related to the major during the thesis. Finally, I would like to the staff and friends in Department of Plant Biotechnology, who have supported and helped me throughout the learning and research process.

Sincere thanks to all! AFFIRMATION AND COMMITMENT My name is Nguyen Thi Truc My, Student ID: 18126228, Class: DH18SHC of Biotechnology major, Nong Lam University, Ho Chi Minh City. I declared that all results presented in this graduate thesis were conducted by myself. All the data and information are entirely accurate and honest. I fully accept responsibility for these commitments in front of the committee.

Thu Duc City, August., 2023 Student’s signature NGUYEN THI TRUC MY ll ABSTRACT This study was conducted to determine some growth conditions such as light intensity, day-night temperature and medium of culture that affect the growth and development of Ngoc Linh ginseng (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) by plant tissue culture method. To investigate the appropriate light mtensity for the growth of Ngoc Linh ginseng, the experiment was set with different light intensities (5-20 pmol.s"), the in-vitro plantlets were cultured in MS and SH medium supplemented with 0.2 mg/L kinetin and 13% coconut water. After finding out the appropriate light intensity, the study continuously conducted to investigate day-night temperatures by screening the day-night temperature (23-13/15/18 °C) under the existing light intensity from the previous experiment. /n-vitro plantlets were also cultured in the same media as above.

All were cultured at day and night humidity of 55 and 65%, respectively, 12 hours of lighting per day. After 12 weeks of culture, the results of the comparison of parameters such as number of leaves, number of roots, shoot height and chlorophyll content showed that conditions of light intensity at 20 umol.s!, temperature day and night at 23 and 15 °C, respectively, were suitable for the growth of Ngoc Linh ginseng. Besides, the parameters and morphological characteristics showed that ginseng in SH culture medium was more suitable growth than that in MS medium. Keywords: Panax vietnamensis, light intensities, day - night temperature, MS and SH medium.

il TABLE OF CONTENTS Page ACKNOW LEDGEMEN T svseserssovenunsesoesenceyszses ces senssesnne eresaenennereressansenouesnraernemanreeres i AFFIRMATION AND COMMITMENT .ecececeecceccec cee eeececeeeeeeeeeeeceseeeeeseeeeeeeeeeeens 1 ABS LRA GI ,=scyzszesss6sxzszgE3Ss6S08501Sg885538/85S3E00M0523508g39HS8 GGGSS9gH2g:Q05Bÿ3i2:3USfESB. 11 LIST OF ABBREVIATIONS án be ch ng ha ha 30331 36153 35 5uXAXGGS9ESEESSE8808801098430008E5 VI LIST OF TABLES cescissecasuerevertineeasere war trseemcenernviniecasereau seer cee Vill LIST 9)000I600. 1X CHAPTER 1: INLRODUCLTTON¿:::csciec2c6csc no 050881011408168118556GG811400450415399548L533 001803858188 1 1. 1 1:2, Eeseatchi Ob ]GEVGS sscseseeosesgebsetdieeLiEG050043813b82g3038.

Research contents An. 3 2a12,1; Onipinvand dis ribwti ON ocesnctmsnanussne reste eG iA 3 2056/52 OLAS SUIT CA OM zzsszrEusssstssiLstGssEi03000830125/08g:453Si3138.3: Motphooieal Character Stes scjeccwcnescuvenmusrrmewcummnce enn EES 5 2. 4 J Sul: LHe medi eiial Valls naosaessnseBsgonotisg3isitES07300G08159083100081436836835Đ103385586Đ580231a8830386u81 4 2. The economic values.

Factors affecting the growth of Ngoc Linh gø1nseng. --- --- 5+ +-=<<c+<ceeces 6 QOLIG AL, WHMIS. T CM Pera wr e veocsewssrscsuswersenrsqeusssssnvessemneseeus nase me naneereneeemneneeeaversremeeenrens 6 °ˆ nh. Plant Growth Regul ator sesesssssscestsesocii 32x scÿE 2H Studies of Viet Nam ginseng in domestic and the world.-- -----5 5< 5552 8 2:12 121; DOMESC SE ves seecssessnsncpsveseneoveusawsees sseveusnauen weer nmausncarn apes seysemumaenomivenestuns 8 PAAN (co.

Introduction to plant tissue cultute'sccescsescnm ae EUS 11 DyDllan ALTE OI sen srs sarees ace eats eens eet eas sweeten seme eve see eeataNUan SL Ue Rea Tt emmaEERINR 11 22.2), S01EHfTHE ESbDIISHITETIE:zssssrtsuediidttistagbsiliotitls046:0RSL834046330390S00. The totipotency of plant ceÏ S. Differentiation and dedifferentiation of plant ceÌÌÏS. MEthOGS OF PIA HSSUS GUILUÍŠ cccrcensaseesnennemneyeenmaememeecenue esewmncueey semereweswerumneutees 12 CHAPTER 3.

MATERIALS AND METHODS. 2c ScS2x+sxsersrrsrrsrsee 13 Blea: DAHA BRN TCA Gi sec ances omen tn eters iea arcs eeion theta teal aaa 13 Be Dea IWUALGI Al S ccs srs caries ena steerage ns eet OA RR Rae Ra 13 VN uy on. Medium and chemicals used.- --- + 22222 32+ 22132322122 EEeErrkrrreeee 13 2:3) BIUIDINETIESsaTN/ GÌ Ì8:s<eecsceinesisEiLsvieSiiLSLi93816G008Ợ2-8080Bi-gig-0TEHEGDSEEOUE40E9/013:8G200000202G” 13 Dic, MISCO CS sngsainnossiieidt0A1150013850181G1S388BB1S. Investigation of the effect of light intensity on the growth of in-vitro Ngoc Linh ginseng cultured in MS and SH media.

Cultured in MS medium.- -- -- - - - 2 2 2E E E SE SE 8985522555555 1 1111 1E nn n2 111k xce 14 3. Cultured in SH medium.- -- -- -- - - 2 2 SE SE SE SE E81 1555555551111 111 1E SE 2255511 11x. Investigation of the effect of day and night temperature on the growth of in-vitro Ngoc Linh ginseng cultured in MS and SH medHa. Cultured in MS medIum.

Cultured in: SHmed itt wes cceceeeczerernmamrnn me kem 15 3. Investigation of the culture medium affecting the growth of in-vitro Ngoc Linh SUNS CNG eee. 15 SA'S tatistl Gal ANALYSIS: nunoonbhsGi nhưng GĩnGh2301304Đ185. RESULTS AND DISCUSSION.

Effect of light intensity on the growth of in-vitro Ngoc Linh ginseng cultured in INU (os Insc Riri et6) eee ee ee a ee a ee 16 4A], Cultured-in MS edit ecercocccenecererenonnyeruerarmiereueimnneterem anne: 16 4. Cultured in SH medium na.STTEIUH:zeszsossecsszrtsgobistiagogl90XSVESEE)HGGSEEBSEAXGG495ĐEI236/323858832288280 21 4. Effect of MS and SH on the growth of in-vitro Ngoc Linh ginseng. CONCLUSION AND SUGGFESTIONS.

csscnsvnesnassoosnnsnnvuhionsinisadvavinnntnenatontes saendnaaensdenieamanemnoenas daveasitadaniennstna 25 DD, SOO DSTO Sa ict 2 Se FR oe a Li a a EE ol aD a Fn 8 el he, ee vui 25 I;9085):65019 S117. 26 VI LIST OF ABBREVIATIONS MS: Murashige and Skoog (1962) SH: Schenk and Hildebrandt (1972) VG: Vietnamese ginseng P. vietnamensis: Panax vietnamensis OCT: Ocotillol PPT: Protopanaxatriol PPD: Protopanaxadiol M-R2: Majonoside-R2 V-R2: Vina-ginsenoside-R2 Kn: Kinetin Vil LIST OF TABLES Page Table 4. Effect of light intensities on growth of in-vitro VG in MS medium.

Effect of light intensities on growth of in-vitro VG in SH medium. Effect of day-night temperature on growth of in-vitro VG in MS medium Seager gig serene ss ce ae gee ee ca ca 20 Table 4. Effect of day-night temperature on growth of in-vitro VG in SH medium 2 eR Neg re eet ee greene ner oN 22 Table 4. Effect of MS & SH medium on growth of in-vitro P.

23 vill LIST OF FIGURES Page Figure 4. Growth of in-vitro VG under different light intensities after 12 weeks in MS Figure 4. Growth of in-vitro VG under various day-night temperature after 12 weeks I MS medium PA. Growth of in-vitro VG under various day-night temperature after 12 weeks I SH MOG UM wscrscssessesesowsersensenessoswexanssesurvenseamenersenneavensesussnennvesmrmterseereeysenerermeveneeess 22 Figure 4.

Growth of in-vitro P. vietnamensis in MS & SH medium after 12 weeks Sh ca oS aa NLA RT a Ceo AS a SnD ROR ma SNARE STARS 23 1x CHAPTER 1. Problem statement Panax vietnamensis (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) is an endemic species of ginseng in Viet Nam belonging to the family Araliaceae, has long been known and used as kinds of a rare and precious herb in traditional medicine with its therapeutic effects such as anti-stress, antioxidant, immune system booster, cancer prevention, liver protection, and so on. Through many previous studies, Ngoc Linh ginseng has many pharmaceutical compounds in which the saponin compounds are the most important, particularly, the dammarane saponin in Ngoc Linh ginseng has a high content, in addition, in the ocotillol saponin group, and there is the M-R2 fraction accounting for 50% of the total saponin content, the most comparison to the species of the genus Panax in the world (Hoang et al, 2012).

Based on the above characteristics, Viet Nam ginseng has become a precious medicinal species not only in Viet Nam but also around the world. However, Ngoc Linh ginseng today is over-exploited, with a high risk of extinction recorded in 250 species located in Vietnam's Red Data book that needs to be protected (Duong et al, 2013). The propagation of Ngoc Linh ginseng is still difficult because it only grows well on Ngoc Linh mountainous area and the harvest time is very long - from 5 to 8 years, because that the ginseng roots have enough active ingredients as desiring, sexual propagation conventional seeding methods will not give high results for many reasons such as seeds germinating for a long time, so they will be destroyed by many insects or animals, and the germination rate is low (Vu, 2018). In-vitro propagation with similar culture conditions to the natural conditions of Ngoc Linh mountainous (including soil, shade, climate, humidity, and so on) so that ginseng can grow well, especially roots in order to improve the ability to survive when grown in the wild is also a difficult issue to consider.

From the above practical issues, the study was carried out to determine some culture conditions and culture medium affecting the growth of Ngoc Linh ginseng with the aim of helping the plant adapt to natural conditions and has high vitality, contributing to the preservation of precious medicinal herbs for Viet Nam. Research objectives This study aimed to investigate some suitable culture conditions susch as light intensity, temperature, and medium on the growth of in-vitro Ngoc Linh ginseng. Research contents To achieve the mentioned objectives, this research includes two contents as follows: Content 1: Determining a light intensity that is proper for the growth of in-vitro Ngoc Linh ginseng in MS and SH medium. Content 2: Determining day-night temperature that is proper for the growth of in- vitro Ngoc Linh ginseng in MS and SH medium.

Origin and distribution Ngoc Linh ginseng (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) is one of 11 types of ginseng belonging to the Araliacease family, also known as Viet Nam ginseng, Khu Nam ginseng (K5), and Truc ginseng. This is a precious ginseng known for its 52 types of saponins and other compounds. It has long been used as a herb that contributes to the treatment of diseases including hepatitis, diabetes, and cancer (Nguyen and Phuong, 2019) in the top 5 best types of ginseng discovered in the world. Ngoc Linh ginseng 1s distributed in the central highlands of Viet Nam, they grow concentratedly on the Ngoc Linh mountainous area of Tu Mo Rong district, Kon Tum province, and Nam Tra My district, Quang Nam province at altitudes from 1.100 m below the forest canopy and cloud covered up to 80% or more, along moist streams on humus soil Ngoc Linh ginseng was firstly discovered in Viet Nam in 1973 by pharmacists Kim Long Dao, Chau Giang Nguyen, and Thi Le Nguyen.

In 1985, it was officially known and scientifically named Panax vietnamensis Ha et Grushv. Ha Thi Dung and Professor Grushvisy (Nguyen, 2015). Classification Scientific classification Kingdom : Plantae Order : Apiales Family : Araliaceae Genus : Panax Species : P. vietnamensis is a native plant, herbaceous, with an average height of 60 - 80 cm, and a stem diameter of 6 - 7 mm.