Phát hiện Atypical EPEC trong Môi Trường Nhà Yến Bằng Multiplex-PCR

Khóa luận: Xác định EPEC không điển hình trong nhà yến bằng Multiplex PCR phát hiện gene eae và escV. Nghiên cứu công nghệ sinh học.

• Tác giả: Trần Thị Thanh Trang
• Người hướng dẫn: Dr. Đinh Xuân Phát
• Trường học: Nông Lâm University - Ho Chi Minh City
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Identification Of Atypical Epec In Swiftlet Houses Environment By Multiplex-PCR Detecting Eae And Escv Genes
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2018 - 2022
• Địa điểm: Thủ Đức City

Mục lục chi tiết

• ACKNOWLEDGEMENTS
• WARRANTY CONFIRMATION
• ABSTRACT
• TÓM TẮT
• TABLE OF CONTENT
• LIST OF ABBREVIATIONS
• LIST OF TABLES
• LIST OF FIGURES
• 1. CHAPTER 1: Introduction
• 2. CHAPTER 2: LITERATURE REVIEW
• 2.1. GENERAL INTRODUCTION
• 2.2. EPEC
• 2.3. Clinical aspects of EPEC infection in children
• 2.4. EPEC MIỄN DỊCH HỌC
• 2.5. Identification method for Enteropathogenic
• 2.5.1. Principles of PCR
• 2.6. Role OF PCR
• 2.7. Application of PCR technique
• 3. CHAPTER 3: MATERIALS AND METHOD
• 3.1. Time and: location of the study
• 3.2. Materials and: chemicals
• 3.3. Isolation of Escherichia coli from swiftlet house environment samples
• 3.4. Optimization of annealing temperature for single PCR
• 3.5. Optimization of the annealing temperature for the multiplex-PCR
• 3.6. Optimization of the primer CONCETTATTION
• 3.7. Optimization of the primer specificity
• 3.8. Determination of the limit of deteCfIOT
• 3.9. Application of the optimal multiplex-PCR procedure for field samples
• 4. CHAPTER 4: RESULTS AND DISCUSSION
• 4.1. Optimization of the annealing tenperafUTG
• 4.2. Optimization of the annealing temperature for single PCR
• 4.3. Optimization of the annealing temperature for the multiplex — PCR
• 4.4. Optimization of the primer cOnC€TIfTAtIOII
• 4.5. Examination of primer specificity
• 4.6. Determination of the limit of det€CfIOTI
• 4.7. Apply the optimal procedure to detect the presence of EPEC in 90 field samples
• 4.8. DISCUSSION
• 5. CHAPTER 5: CONCLUSION AND RECOMMENDATION
• 5.1. CONCLUSION
• 5.2. RECOMMENDATION
• REFERENCES

Tóm tắt

I. EPEC trong nhà yến Hiểu đúng mối nguy và tầm quan trọng

Ngành nuôi chim yến tại Việt Nam đang phát triển mạnh mẽ, mang lại giá trị kinh tế cao. Tuy nhiên, đi kèm với sự phát triển là những thách thức về an toàn sinh học. Một trong những mối đe dọa thầm lặng nhưng nguy hiểm là sự hiện diện của vi khuẩn Enteropathogenic Escherichia coli, hay còn gọi là EPEC. Đây là một loại vi khuẩn Gram âm có khả năng gây tiêu chảy cấp ở người, đặc biệt nguy hiểm cho trẻ em. Môi trường nhà yến, với độ ẩm cao và sự tích tụ của phân chim, là điều kiện lý tưởng cho các mầm bệnh E. coli trong chăn nuôi phát triển. Việc ô nhiễm vi khuẩn trong tổ yến không chỉ ảnh hưởng đến sức khỏe đàn yến mà còn trực tiếp đe dọa sức khỏe người tiêu dùng, làm giảm chất lượng tổ yến thô và uy tín của thương hiệu. Do đó, việc chủ động giám sát và phát hiện sớm EPEC là yếu tố then chốt để đảm bảo an toàn sinh học nhà yến và sự phát triển bền vững của ngành. Việc áp dụng các phương pháp chẩn đoán hiện đại như Multiplex PCR để phát hiện EPEC trong nhà yến không còn là lựa chọn mà đã trở thành yêu cầu cấp thiết, giúp các chủ nhà yến kiểm soát rủi ro và bảo vệ tài sản của mình.

1.1. Enteropathogenic E. coli EPEC là gì

EPEC, viết tắt của Enteropathogenic Escherichia coli, là một nhóm vi khuẩn E. coli có khả năng gây bệnh đường ruột, chủ yếu là tiêu chảy. Khác với các chủng E. coli thông thường, EPEC sở hữu các yếu tố độc lực đặc biệt, cho phép chúng bám dính chặt vào tế bào niêm mạc ruột non và phá hủy cấu trúc vi nhung mao. Quá trình này được gọi là tổn thương "gắn và xóa" (attaching and effacing - A/E), là đặc điểm nhận dạng chính của EPEC. Sự phá hủy này làm rối loạn khả năng hấp thu nước và chất dinh dưỡng của ruột, dẫn đến tiêu chảy kéo dài. Dựa trên sự hiện diện của plasmid yếu tố bám dính (EAF plasmid), EPEC được chia thành hai loại: điển hình (tEPEC) và không điển hình (aEPEC). Trong đó, aEPEC đang ngày càng được ghi nhận là tác nhân gây bệnh phổ biến ở cả người và động vật, bao gồm cả chim yến. Sự tồn tại của EPEC trong môi trường nhà yến là một chỉ dấu cảnh báo về nguy cơ ô nhiễm vi khuẩn trong tổ yến ở mức độ cao.

1.2. Tầm quan trọng của việc kiểm soát dịch bệnh chim yến

Việc kiểm soát dịch bệnh chim yến không chỉ đơn thuần là bảo vệ sức khỏe đàn yến. Nó còn là nền tảng để đảm bảo chất lượng tổ yến thô và an toàn cho người sử dụng cuối cùng. Một môi trường nhà yến không đảm bảo an toàn sinh học sẽ là nơi trú ngụ của nhiều tác nhân gây bệnh, trong đó có EPEC. Phân chim yến được xác định là nguồn chứa chính của các mầm bệnh này. Nếu không được kiểm soát, vi khuẩn có thể lây lan từ phân sang tổ yến, nguồn nước và không khí, tạo thành một chu trình ô nhiễm khép kín. Việc thực hiện các xét nghiệm vi sinh vật trong nhà yến một cách định kỳ, đặc biệt là xét nghiệm EPEC trong tổ yến, giúp chủ đầu tư nắm bắt được tình hình sức khỏe của môi trường nuôi. Từ đó, các biện pháp can thiệp kịp thời như vệ sinh, khử trùng sẽ được áp dụng, giúp cắt đứt chuỗi lây nhiễm, bảo vệ đàn yến khỏi nguy cơ bùng phát dịch bệnh và đảm bảo sản phẩm đầu ra đạt tiêu chuẩn an toàn vệ sinh thực phẩm.

II. Thách thức kiểm soát mầm bệnh EPEC trong vận hành nhà yến

Việc kiểm soát và phát hiện EPEC trong nhà yến đối mặt với nhiều thách thức đáng kể. Môi trường đặc thù của nhà yến với độ ẩm cao, nhiệt độ ổn định và ít ánh sáng mặt trời là điều kiện lý tưởng cho vi khuẩn phát triển. Phân chim yến tích tụ liên tục, trở thành nguồn lây nhiễm chính. Các phương pháp chẩn đoán truyền thống như nuôi cấy vi sinh vật thường tốn nhiều thời gian (vài ngày đến một tuần) và có thể cho kết quả không chính xác do sự hiện diện của các vi khuẩn khác. Hơn nữa, không phải tất cả các chủng E. coli đều gây bệnh, việc phân biệt EPEC với các chủng vô hại bằng phương pháp nuôi cấy là rất phức tạp. Điều này dẫn đến sự chậm trễ trong việc đưa ra các biện pháp xử lý, làm tăng nguy cơ lây lan mầm bệnh. Thêm vào đó, việc thiếu một quy trình chuẩn hóa trong việc lấy mẫu và xét nghiệm vi sinh vật trong nhà yến cũng là một rào cản lớn. Những thách thức này đòi hỏi một giải pháp chẩn đoán phân tử tiên tiến, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, giúp xác định chính xác sự hiện diện của gen độc lực của EPEC, từ đó đưa ra cảnh báo sớm và hiệu quả.

2.1. Hạn chế của các phương pháp xét nghiệm truyền thống

Phương pháp nuôi cấy trên đĩa thạch là kỹ thuật kinh điển để xác định vi khuẩn. Tuy nhiên, nó có nhiều nhược điểm khi áp dụng để giám sát mầm bệnh E. coli trong chăn nuôi. Thứ nhất, thời gian chờ kết quả kéo dài, làm lỡ "thời điểm vàng" để can thiệp. Thứ hai, độ đặc hiệu không cao. Nhiều vi khuẩn khác có thể phát triển trên môi trường nuôi cấy và có hình thái khuẩn lạc tương tự E. coli, gây nhầm lẫn. Để xác định chính xác chủng EPEC, cần thực hiện thêm nhiều thử nghiệm sinh hóa phức tạp, tốn kém và đòi hỏi kỹ thuật viên có chuyên môn cao. Thứ ba, phương pháp này không thể phát hiện các vi khuẩn ở trạng thái không thể nuôi cấy (viable but non-culturable - VBNC), một trạng thái mà vi khuẩn vẫn có khả năng gây bệnh. Những hạn chế này làm cho việc giám sát an toàn sinh học nhà yến trở nên bị động và kém hiệu quả, thúc đẩy nhu cầu tìm kiếm các kỹ thuật PCR định danh vi khuẩn hiện đại hơn.

2.2. Nguồn lây nhiễm và nguy cơ từ phân chim yến

Phân chim yến là nguồn lây nhiễm chính của EPEC và nhiều mầm bệnh khác trong nhà yến. Theo nghiên cứu của Leong et al., phân chim chứa một hệ vi sinh vật đa dạng, bao gồm cả các tác nhân gây bệnh. Do tập tính di cư và sinh sống thành bầy đàn lớn, chim yến có thể dễ dàng phát tán mầm bệnh trong môi trường. Vi khuẩn EPEC từ phân có thể phát tán qua nhiều con đường: tiếp xúc trực tiếp, qua không khí (dưới dạng bụi), hoặc nhiễm vào nguồn nước sử dụng trong nhà yến. Khi tổ yến bị nhiễm bẩn, vi khuẩn có thể tồn tại và phát triển, làm giảm chất lượng tổ yến thô và gây nguy hiểm cho người sơ chế và người tiêu dùng. Việc quản lý và xử lý phân yến đúng cách, kết hợp với việc xét nghiệm EPEC trong tổ yến định kỳ, là biện pháp cốt lõi để giảm thiểu nguy cơ ô nhiễm vi khuẩn và bảo vệ toàn diện cho hệ sinh thái nhà yến.

III. Giải pháp Multiplex PCR Phát hiện EPEC nhanh và chính xác

Để khắc phục những hạn chế của phương pháp truyền thống, kỹ thuật Multiplex PCR nổi lên như một giải pháp vượt trội để phát hiện EPEC trong nhà yến. Đây là một kỹ thuật chẩn đoán phân tử cho phép khuếch đại và phát hiện đồng thời nhiều đoạn DNA mục tiêu trong cùng một phản ứng. Thay vì tìm kiếm sự hiện diện của cả con vi khuẩn, Multiplex PCR tập trung vào việc xác định các gen độc lực của EPEC, cụ thể là các gen như eae và escV. Gen eae mã hóa protein intimin, giúp vi khuẩn bám dính vào tế bào ruột, trong khi gen escV là một phần của hệ thống bài tiết type III (T3SS), bộ máy giúp vi khuẩn "bơm" các yếu tố độc lực vào tế bào chủ. Việc phát hiện sự có mặt của các gen này là bằng chứng xác thực về sự tồn tại của EPEC có khả năng gây bệnh. Ưu điểm lớn nhất của quy trình Multiplex PCR là tốc độ, độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Kết quả có thể có trong vòng vài giờ, giúp đưa ra quyết định can thiệp nhanh chóng, là công cụ đắc lực cho việc kiểm soát dịch bệnh chim yến.

3.1. Nguyên lý kỹ thuật PCR định danh vi khuẩn đa mồi

Kỹ thuật PCR định danh vi khuẩn đa mồi, hay Multiplex PCR, hoạt động dựa trên nguyên tắc của phản ứng chuỗi polymerase (PCR). Quá trình này mô phỏng sự nhân đôi DNA tự nhiên trong một ống nghiệm. Một phản ứng Multiplex PCR bao gồm nhiều cặp mồi (primer) khác nhau, mỗi cặp được thiết kế đặc hiệu để nhận diện và bám vào một gen mục tiêu duy nhất (ví dụ: một cặp cho gen eae, một cặp cho gen escV). Khi có mặt DNA của vi khuẩn EPEC trong mẫu, các cặp mồi tương ứng sẽ bám vào gen mục tiêu. Dưới tác động của enzyme Taq polymerase và các chu kỳ nhiệt, các đoạn gen này sẽ được nhân lên hàng triệu lần. Sản phẩm sau khuếch đại được phân tích bằng phương pháp điện di trên gel agarose. Sự xuất hiện của các vạch DNA có kích thước mong đợi xác nhận sự hiện diện của các gen độc lực, qua đó khẳng định mẫu dương tính với EPEC. Kỹ thuật này cho phép phân tích DNA vi khuẩn một cách nhanh chóng và chính xác.

3.2. So sánh Multiplex PCR và phương pháp Real time PCR

Cả Multiplex PCR và phương pháp Real-time PCR đều là những công cụ chẩn đoán phân tử mạnh mẽ. Multiplex PCR thường cho kết quả định tính (có hoặc không có mầm bệnh) bằng cách phân tích sản phẩm cuối cùng qua điện di. Ưu điểm của nó là khả năng phát hiện nhiều mục tiêu cùng lúc với chi phí thiết bị ban đầu thấp hơn. Ngược lại, Real-time PCR (hay qPCR) cung cấp kết quả định lượng, cho biết số lượng bản sao DNA mục tiêu có trong mẫu ban đầu. Nó theo dõi sự khuếch đại DNA trong thời gian thực thông qua tín hiệu huỳnh quang, không cần bước điện di sau phản ứng, do đó giảm nguy cơ ngoại nhiễm và nhanh hơn. Tuy nhiên, chi phí cho thiết bị và hóa chất của Real-time PCR cao hơn. Trong bối cảnh sàng lọc và phát hiện EPEC trong nhà yến, Multiplex PCR là một lựa chọn hiệu quả về chi phí để xác định sự hiện diện của mầm bệnh. Khi cần đánh giá mức độ ô nhiễm, Real-time PCR sẽ là công cụ bổ sung hữu ích.

IV. Hướng dẫn quy trình phát hiện EPEC bằng Multiplex PCR tối ưu

Việc xây dựng một quy trình Multiplex PCR chuẩn hóa là điều kiện tiên quyết để đảm bảo kết quả xét nghiệm chính xác và đáng tin cậy. Dựa trên nghiên cứu "Nhận biết sự hiện diện của atypical EPEC trong môi trường nhà yến bằng kỹ thuật multiplex-PCR" của tác giả Trần Thị Thanh Trang (Đại học Nông Lâm TP.HCM), một quy trình tối ưu đã được thiết lập. Quy trình này bao gồm các bước chính: thu thập và xử lý mẫu, tách chiết DNA, thực hiện phản ứng Multiplex PCR với các điều kiện tối ưu, và cuối cùng là điện di phân tích kết quả. Sự thành công của quy trình phụ thuộc rất nhiều vào việc tối ưu hóa các thông số quan trọng như nhiệt độ bắt cặp của mồi, nồng độ mồi, và giới hạn phát hiện của phản ứng. Việc tuân thủ nghiêm ngặt quy trình này sẽ giúp các phòng thí nghiệm và đơn vị chăn nuôi có được một công cụ mạnh mẽ để giám sát an toàn sinh học nhà yến, từ đó bảo vệ sức khỏe đàn yến và nâng cao chất lượng sản phẩm.

4.1. Bước 1 Thu thập và tách chiết DNA vi khuẩn từ mẫu

Chất lượng của kết quả phân tích DNA vi khuẩn phụ thuộc lớn vào khâu lấy mẫu và tách chiết ban đầu. Mẫu xét nghiệm có thể là mẫu phân chim yến hoặc mẫu phết bề mặt tổ yến, sàn nhà, tường. Mẫu cần được thu thập bằng dụng cụ vô trùng và bảo quản lạnh để tránh sự phát triển của vi khuẩn tạp nhiễm. Tại phòng thí nghiệm, DNA tổng số sẽ được tách chiết từ mẫu bằng các bộ kit thương mại chuyên dụng. Nguyên tắc chung của quá trình này là phá vỡ tế bào vi khuẩn để giải phóng vật chất di truyền, sau đó loại bỏ các thành phần không mong muốn như protein, lipid và các mảnh vụn tế bào. DNA tinh sạch thu được sẽ là khuôn cho phản ứng PCR. Một quy trình tách chiết hiệu quả sẽ đảm bảo thu được lượng DNA đủ và sạch, không chứa các chất ức chế phản ứng PCR, là tiền đề cho một xét nghiệm thành công.

4.2. Bước 2 Tối ưu hóa điều kiện phản ứng Multiplex PCR

Đây là bước quan trọng nhất trong việc xây dựng quy trình. Nghiên cứu của Trần Thị Thanh Trang đã chỉ ra các thông số tối ưu để phát hiện EPEC trong nhà yến một cách hiệu quả. Nhiệt độ bắt cặp (annealing temperature) tối ưu được xác định là 60°C. Đây là nhiệt độ mà các mồi đặc hiệu cho gen eae và escV có thể bám vào DNA khuôn một cách chính xác nhất, tránh việc bám nhầm gây ra sản phẩm không mong muốn. Tỷ lệ nồng độ tối ưu giữa hai cặp mồi cho gen escV và eae được xác định là 1:2. Việc tối ưu nồng độ mồi giúp đảm bảo các gen mục tiêu được khuếch đại một cách cân bằng. Giới hạn phát hiện (Limit of Detection - LoD) của quy trình được xác định ở mức 10⁻⁵ ng/µL, cho thấy phản ứng có độ nhạy rất cao, có thể phát hiện được lượng DNA vi khuẩn rất nhỏ trong mẫu. Những thông số này là kim chỉ nam để thực hiện phản ứng một cách chuẩn xác.

4.3. Bước 3 Phân tích kết quả qua điện di trên gel agarose

Sau khi phản ứng PCR kết thúc, sản phẩm khuếch đại sẽ được phân tích bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose. Mẫu PCR được nạp vào các giếng trên bản gel và một dòng điện được chạy qua. Do DNA mang điện tích âm, chúng sẽ di chuyển về phía cực dương. Các đoạn DNA có kích thước nhỏ hơn sẽ di chuyển nhanh hơn và xa hơn các đoạn lớn. Một thang chuẩn DNA (DNA ladder) với các đoạn có kích thước đã biết được chạy song song để so sánh. Sau khi điện di, bản gel được nhuộm bằng chất phát quang dưới ánh sáng UV. Nếu mẫu dương tính với EPEC, các vạch sáng tương ứng với kích thước của gen eae (881 bp) và/hoặc gen escV (266 bp) sẽ xuất hiện. Sự hiện diện của vạch escV xác nhận sự tồn tại của EPEC không điển hình (aEPEC), cung cấp một kết quả rõ ràng và đáng tin cậy.

V. Kết quả thực tiễn Phát hiện EPEC tại nhà yến miền Nam

Việc áp dụng quy trình Multiplex PCR tối ưu vào thực tế đã mang lại những kết quả quan trọng, cung cấp một cái nhìn tổng quan về tình hình nhiễm EPEC trong các nhà yến tại khu vực miền Nam Việt Nam. Nghiên cứu của Trần Thị Thanh Trang đã tiến hành khảo sát trên 90 mẫu thực địa, bao gồm mẫu phân và mẫu phết bề mặt, thu thập từ các nhà yến tại Đồng Nai, Bình Dương và TP. Hồ Chí Minh. Kết quả là một minh chứng rõ ràng cho hiệu quả của phương pháp chẩn đoán phân tử. Việc phát hiện được sự hiện diện của gen độc lực của EPEC cho thấy nguy cơ ô nhiễm vi khuẩn trong tổ yến là có thật và cần được quan tâm đúng mức. Những dữ liệu này không chỉ có giá trị khoa học mà còn là cơ sở để các cơ quan quản lý và chủ nhà yến xây dựng các chiến lược kiểm soát dịch bệnh chim yến hiệu quả hơn, góp phần nâng cao chất lượng tổ yến thô và bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

5.1. Tỷ lệ nhiễm EPEC qua xét nghiệm 90 mẫu thực địa

Kết quả phân tích 90 mẫu cho thấy một tỷ lệ nhiễm đáng chú ý. Cụ thể, có 19 trên 90 mẫu (chiếm 21,11%) cho kết quả dương tính với gen escV. Trong số đó, có 13 mẫu là mẫu phân và 6 mẫu là mẫu phết bề mặt tổ yến. Đáng chú ý, không có mẫu nào được ghi nhận dương tính với gen eae. Sự hiện diện của gen escV mà không có gen eae là đặc điểm của chủng EPEC không điển hình (aEPEC). Gen escV là một thành phần cốt lõi của hệ thống bài tiết type III, cần thiết cho khả năng gây bệnh của EPEC. Kết quả này khẳng định sự lưu hành của aEPEC trong môi trường nhà yến tại khu vực khảo sát. Tỷ lệ 21,11% là một con số cảnh báo, cho thấy việc xét nghiệm EPEC trong tổ yến và môi trường xung quanh cần được thực hiện thường xuyên để giám sát và phòng ngừa.

5.2. Diễn giải kết quả Sự hiện diện của aEPEC EPEC không điển hình

Việc tất cả các mẫu dương tính đều chỉ có gen escV cho thấy tác nhân lưu hành chủ yếu là aEPEC. EPEC không điển hình (atypical EPEC) đang ngày càng được công nhận là một tác nhân gây tiêu chảy quan trọng trên toàn cầu, đặc biệt ở các nước công nghiệp hóa. Mặc dù cơ chế gây bệnh của chúng vẫn đang được nghiên cứu, sự hiện diện của hệ thống bài tiết type III (được mã hóa bởi các gen trong đó có escV) là đủ để chúng gây ra các tổn thương đặc trưng trên tế bào ruột. Phát hiện này có ý nghĩa quan trọng đối với an toàn sinh học nhà yến. Nó cho thấy rằng ngay cả khi không phát hiện các chủng EPEC "kinh điển", nguy cơ từ các chủng không điển hình vẫn hiện hữu. Do đó, các quy trình Multiplex PCR cần bao gồm các gen chỉ thị cho cả hai nhóm EPEC để có một bức tranh toàn cảnh về các mầm bệnh E. coli trong chăn nuôi yến.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY - HO CHI MINH CITY FACULTY OF BIOLOGICAL SCIENCES IDENTIFICATION OF ATYPICAL EPEC IN SWIFTLET HOUSES ENVIRONMENT BY MULTIPLEX-PCR DETECTING eae AND escV GENES Major : BIOTECHNOLOGY Student : TRAN THI THANH TRANG Student code : 18126189 Academic year : 2018 - 2022 Thu Duc City, 08/2023 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY - HO CHI MINH CITY FACULTY OF BIOLOGICAL SCIENCES GRADUATION THESIS IDENTIFICATION OF ATYPICAL EPEC IN SWIFTLET HOUSES ENVIRONMENT BY MULTIPLEX-PCR DETECTING eae AND escV GENES Advisor Student Dr. DINH XUAN PHAT TRAN THI THANH TRANG Thu Duc City, 08/2023 ACKNOWLEDGEMENTS I would like to convey my heartfelt appreciation to the boards of Nong Lam University Ho Chi Minh City and the Faculty of Biological Sciences for creating the best conditions for me to complete this study. I am truly grateful to my thesis advisor, Dr. Dinh Xuan Phat, who patiently educated and helped me throughout the process.

It would have been difficult to complete the studies without the assistance of everyone who has stood by me during these trying times. And for that, I'd want to express my gratitudeto Ms. Nguyen Thi Mi Mi, Mr. Le Thanh Binh, Mr.

Hoang Gia Lam, Ms. Do Thi Trinh, Ms. Tran Ngoc Thao Nguyen, and other members of Gene Technology Laboratory BIO313. Last but not least, I want to thank my family for providing me with the strength to conquer the obstacles along the route.

You are the reason I have gotten this far, and I promise to work harder to succeed and make you proud. WARRANTY CONFIRMATION My name is Tran Thi Thanh Trang — 18126189, class DHI8SHD, Faculty of Biological Sciences, Nong Lam University. I committee the research performed by me. This study was a part of the research “Investigation of potentially pathogenic Escherichia coli, Salmonella and Clostridium perfringens based on virulence genes in the environment of swiftlet houses in Southern Vietnam”.

All the data and information in this research are totally honest and objective. I fully accept the responsibility for any falsity in the data utilized for this study. Ho Chi Minh City, August 2023 The committed writer l ABSTRACT Products derived from swiftlet are playing an important role in human health, but they also contain many disease risks. Swallow droppings contain many pathogens including E.

coli, especially atypical EPEC (aEPEC), a Gram-negative bactertum capable of causing acute diarrhea in humans. Therefore, detecting the presence of this bacterium is essential to assess the degree of pathogenicity. This research was performed to survey the presence of Enteropathogenic È. coli (EPEC) in swiftlet houses in three provinces of Southern Vietnam by using the multiplex - PCR technique.

To make the research objective apparent, the multiplex - PCR procedure was optimized with the following annealing temperature, primer concentration, the limit of detection, and primer specificity and application of established multiplex - PCR procedure to investigate the aEPEC presence in 90 samples. After optimizing, a total of 90 field samples including feces and swiftlet surface swabs were collected from swiftlet houses in Dong Nai, Binh Duong, and Ho Chi Minh City. The result was achieved as follows initial denaturation at 95°C for 7 mins, 35 cycles of amplification with the denaturation at 95°C for 30 seconds, the optimal annealing temperature for operating the multiplex - PCR was 60°C, then extension at 72°C for 45 seconds, and the final extension step 72°C for 7 mins. the optimal ratio of concentration between escV and eae gene was 1:2(0.

The limit of detection for multiplex - PCR was 10 ng/L. Applying the optimal procedure, 90 samples were obtained 19/90 positive with escV gene including 6 for swiftlet surface swabs and 13 for feces samples. No samples were positive with eae gene. The result has successfully detected atypical EPEC in the swiftlet house by the expression of the escV gene.

With a ratio of 19/90, EPEC is one of the most highly detected pathogens at swiftlet houses. However, it is necessary to have more different types of EPEC in the different locations and conditions for the result validation. Keywords: Swiftlet, Enteropathogenic FE. co/i (EPEC), multiplex PCR.

ill TÓM TẮT Nhận biết sự hiện diện của atypical Enteropathogenic E. coli (AEPEC) trong môi trường nhà nuôi chim yến bằng kỹ thuật multiplex-PCR thông qua sự phát hiện gen eae và escV. Sản phẩm có nguồn gốc từ chim Yến đang đóng vai trò quan trọng đối với sức khỏe con người, tuy nhiên nó cũng chứa nhiều rủi ro về dịch bệnh. Phân chim yến có chứa nhiều tác nhân gây bệnh trong đó có È.

coli đặc biệt là atypical EPEC (aEPEC), một loại vi khuẩn Gram âm có khả năng gây tiêu chảy cấp ở người. Do đó, việc phát hiện sự hiện diện của vi khuẩn này là điều cần thiết để đánh giác mức độ gây bệnh. Nghiên cứu này được thực hiện với mục đích cung cấp thông tin khảo sat về sự hiện diện của atypical Enteropathogenic E. coli trong môi trường nhà yến ở ba tỉnh miền Nam của Việt Nam bằng phương pháp multiplex - PCR.

Dé làm rõ mục tiêu của dé tai, quy trình kỹ thuật phương pháp PCR được tôi ưu hóa về nhiệt độ bắt cap, nồng độ đoạn môi, giới hạn phát hiện và độ đặc hiệu của đoạn mồi và áp dụng phátt hiện quy trình multiplex - PCR đã xây dựng dé phát hiện aEPEC trong 90 mẫu thực địa. Kết quả cho thấy, trong toàn bộ 90 mẫu thực địa bao gồm mẫu phân chim và mẫu phết bề mặt tổ yên được thu thập tại nhà yến ở các tỉnh thành như Dong Nai, Binh Duong va Thanh phố Hồ Chi Minh. Kết quả đạt được bao gồm, nhiệt độ bắt cặp là 60°C, tỉ lệ tối ưu cho nồng độ giữa 2 gene escV va eae là 1:2 (tương ứng với 0,2 uM: 0,4 nM), giới hạn phát hiện sự hiện diện EPEC ở nồng độ 10° ng/uL. Áp dụng quy trình tối ưu này 90 mẫu thực địa đã được khảo sát với kết qua cho ra 19/90 mẫu dương tính với gene escV bao gồm 6 mẫu phết bề mặt tô yến và 13 mẫu phân chim, không có trường hợp dương tính với gene eae.

Kết qua đã cho thay quy trình đã được áp dụng thành công dé phát hiện atypical EPEC trong môi trường nhà yến bằng sự biểu hiện của gene escV. Mặc dù vậy, để xác thực về kết quả và độ hiệu quả của quy trình trong nghiên cứu này cần đa dạng về chủng loại EPEC để cho ra một quy trình hoàn thiện nhằm áp dụng hiệu quả vào việc phát hiện EPEC ở cộng đồng. Từ khóa: Chim yến, Enteropathogenic E. coli (EPEC), multiplex PCR.

IV TABLE OF CONTENT Page ACKNOWLEDGEMENTS ben triinntiv0BEDG011380138465500380451381539540385849123913943100386100903838 i WARRANTY CONFTRMA TION.-- Ặ c2 HH H1 0 re ii ABS TRAG DT sasssssggn86900966580:8683655058430309031513384981483236)3E81E2. iv TABEBIOR CONTENT g›sssgs5146sg108:8601620gtugkt5XEqdlSASiduitbalftlpiSssiieguggduiltcatRoiasastsgbaussayŠ V LIST OF ABBREVIATIONS ssseseesevosscesrsvesesesvensverneennraw ener eremenaswenaw eevee: Vil I1)1ig 93000910 51055-70Ẹ77®e hố ốẽố ốc. Vill LIST OF BIGURES .:cssssasseasmsenucanmeaisameeenas seme nem 1X (957. | Lal Introduction passststbaisioniEE 0555 D8iNGISGNGĐSGGSGESS80380SGGQSISSRSSSSGSISSDERGS3vG635I.

OD] OCU 6 ererscrercer eeerarenreeer emt enter eee ES 1 Mh Bois NE OTA cst i tt a Sia i let Z GHAPTER. LITERATURE, REN IE W secssoasensesuneasunsesunavenasweunssarseunnaaanswansswnsdsvasnenetsonvens 3 2.GHSREGGI EEE ETE 3 2d EPEC GIIGEHTOG ĐT srececccesrse center ween eur ecw eee nee eer eee 4 2. Clinical aspects of EPEC infection in children. EPEC MIỆU |GHGE SOTO sccscscnsnrcnreroumenneness annesenneneunnscsoumaue ne meus ueerwemenmenensremacunenes 6 2.

Identification method for Enteropathogenic FE. Prineiplesiof PCR ácsssnnsetiseiatitnE1111403355018100515914385555G4GLESEGSS4E1448539385005384014000141308588 8 2 Dole QUYD G5: OL PC Riccacwaninnrsss ass Sarees eee 8 2. Application of PCR techn1que.- ---- -- + 323221 *32*+*E+EE+zEErEerrsrerrrrrrrrrrrrerree 9 CHAPTER, 3. MATERIALS AND METHOD sccsssssescassenernsseuamneacnesversanenneanssnenrersanees 10 Sul.

Time and: location of the study set S40 ES0S 090810E)92898B0853681604G. Materials and: chemicals ssssscsssssssssasss21556664660153533853553855548055511383585395038518335560434850836 10 2 el OS Esco 12) | eee ene ee eee ee 10 3. Isolation of Escherichia coli from swiftlet house environment samples. Optimization of annealing temperature for single PCR,.

Optimization of the annealing temperature for the multiplex-PCR. Optimization of the primer CORCeTTAfIOII. Optimization of the primer specificity. Determination of the limit of deteCfIOT.

Application of the optimal multiplex-PCR procedure for field samples. RESULTS AND DISCUSSION. Optimization of the annealing tenperafUTG. Optimization of the annealing temperature for single PCR.

Optimization of the annealing temperature for the multiplex — PCR. Optimization of the primer cOnC€TIfTAtIOII. Examination of primer specificity 111. Determination of the limit of det€CfIOTI.

Apply the optimal procedure to detect the presence of EPEC in 90 field samples 21 4.6; DISCUSS reece seeerrceeeruecnernee ee 80188 22 CHAPTER 5. CONCLUSION AND RECOMMENDATION.------ 25 IRE S00) 1c LTSLOTÌ eee ee ee eee ee eee 25 5. 26 VI OF ABBREVIATIONS AE Attaching and effecing aEPEC atypical Enteropathogenic Escherichia coli DAEC Diffusely adherent Escherichia coli DNA Deoxyribonucleic acid EAEC Enteroaggregative Escherichia coli EIEC Enteromvasive Escherichia coli EPEC Enterropathogenic Escherichia coli ETEC Enterotoxigenic F. coli LoD Limit of detection PCR Polymerase Chain Reaction pEAF EPEC adherence factor plasmid pEAF plasmid Escherichia coli adherence factor STEC Shiga toxin—producing Escherichia coli Annealing temperature typical Enteropathogenic Escherichia coli Melting temperature Vil LIST OF TABLES Table 4.

Replication of multiplex-PCR determining detection limit Table 4. The summation of atypical EPEC detection surveillance in samples. vill LIST OF FIGURES Figure 4. PCR products for optimizing annealing temperature for single PCR.

Electrophoresis results of mPCR of different annealing temperatures. Electrophoresis result of escV-eae primer concentration ratio valuation. Examination of primer specific by multiplex PCTR. Determination of the limit of the defecfIon.

Electrophoresis results of PCR products of field samples 1X CHAPTER 1. Introduction The Department of Livestock Production of Vietnam claims that Southeast Asia is the only region that can support the development of swiftlets. As a result, Vietnam is stressing its significance more and more. Swiftlet farming has grown to be a profitable industry in Vietnam since 2004.

Swiftlets have a very high monetary worth, ranging from 1500 to 2000 USD per kilogram. Companies mostly export swiftlet nest products, generating between 100 and 125 million USD annually. The swiftlet nest farming industry is constantly growing and improving because of the swiftlet nest's potential and features for business and production. 42 out of 63 provinces have only recently begun participating in Swift's nest farming (Hoan, 2018).

However, there are still several issues with the management of veterinary sanitary conditions and disease surveillance. Swiftlets are classified as wild birds that congregate in huge flocks and live at high altitudes, making it harder for them to maintain disease control than other types of animals. Swiftlet feces includes a variety of bacterin-containing EPEC (Leong ef a/. EPEC is the second most common cause of inpatient diarrhea after rotavirus (Pfeiffer et al.

Because of the species' behavior of immigration and emigration, swiftlet is easy to release pathogens (Jourdain ef al. Therefore, Rapid diagnosis of pathogenic È. coli strains is an increasingly important issue to address in public health (Botkin ef a/. Constructing the procedure to detect the presence of EPEC is necessary for the prevention of pathogen spread.

Objective Successfully constructed a procedure to detect atypical EPEC using multiplex - PCR technique via escV and eae genes. Application of the procedure to check the appearance of bacteria in field samples collected from swiftlet houses. Contents Content 1: Optimization of the multiplex PCR procedure for detection of aEPEC Optimization of the annealing temperature for the multiplex PCR Optimization of the primer concentration for the multiplex PCR Examination of primer specificity Determination of the limit of detection for the multiplex PCR Content 2: Utilization of the multiplex PCR to determine the presence of aEPEC for 90 field samples from swiftlet houses’ samples. Introduction Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) is a gram-negative bacterial pathogen that adheres to human intestinal epithelial cells, resulting in watery, persistent diarrhea (Goosney ef al.