Phát hiện Atypical EPEC trong Môi Trường Nhà Yến Bằng Multiplex-PCR

Khóa luận: Xác định EPEC không điển hình trong nhà yến bằng Multiplex PCR phát hiện gene eae và escV. Nghiên cứu công nghệ sinh học.

• Tác giả: Trần Thị Thanh Trang
• Người hướng dẫn: Dr. Đinh Xuân Phát
• Trường học: Nông Lâm University - Ho Chi Minh City
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Identification Of Atypical Epec In Swiftlet Houses Environment By Multiplex-PCR Detecting Eae And Escv Genes
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2018 - 2022
• Địa điểm: Thủ Đức City

Mục lục chi tiết

• ACKNOWLEDGEMENTS
• WARRANTY CONFIRMATION
• ABSTRACT
• TÓM TẮT
• TABLE OF CONTENT
• LIST OF ABBREVIATIONS
• LIST OF TABLES
• LIST OF FIGURES
• 1. CHAPTER 1: Introduction
• 2. CHAPTER 2: LITERATURE REVIEW
• 2.1. GENERAL INTRODUCTION
• 2.2. EPEC
• 2.3. Clinical aspects of EPEC infection in children
• 2.4. EPEC MIỄN DỊCH HỌC
• 2.5. Identification method for Enteropathogenic
• 2.5.1. Principles of PCR
• 2.6. Role OF PCR
• 2.7. Application of PCR technique
• 3. CHAPTER 3: MATERIALS AND METHOD
• 3.1. Time and: location of the study
• 3.2. Materials and: chemicals
• 3.3. Isolation of Escherichia coli from swiftlet house environment samples
• 3.4. Optimization of annealing temperature for single PCR
• 3.5. Optimization of the annealing temperature for the multiplex-PCR
• 3.6. Optimization of the primer CONCETTATTION
• 3.7. Optimization of the primer specificity
• 3.8. Determination of the limit of deteCfIOT
• 3.9. Application of the optimal multiplex-PCR procedure for field samples
• 4. CHAPTER 4: RESULTS AND DISCUSSION
• 4.1. Optimization of the annealing tenperafUTG
• 4.2. Optimization of the annealing temperature for single PCR
• 4.3. Optimization of the annealing temperature for the multiplex — PCR
• 4.4. Optimization of the primer cOnC€TIfTAtIOII
• 4.5. Examination of primer specificity
• 4.6. Determination of the limit of det€CfIOTI
• 4.7. Apply the optimal procedure to detect the presence of EPEC in 90 field samples
• 4.8. DISCUSSION
• 5. CHAPTER 5: CONCLUSION AND RECOMMENDATION
• 5.1. CONCLUSION
• 5.2. RECOMMENDATION
• REFERENCES

Tóm tắt

I. EPEC trong nhà yến Hiểu đúng mối nguy và tầm quan trọng

Ngành nuôi chim yến tại Việt Nam đang phát triển mạnh mẽ, mang lại giá trị kinh tế cao. Tuy nhiên, đi kèm với sự phát triển là những thách thức về an toàn sinh học. Một trong những mối đe dọa thầm lặng nhưng nguy hiểm là sự hiện diện của vi khuẩn Enteropathogenic Escherichia coli, hay còn gọi là EPEC. Đây là một loại vi khuẩn Gram âm có khả năng gây tiêu chảy cấp ở người, đặc biệt nguy hiểm cho trẻ em. Môi trường nhà yến, với độ ẩm cao và sự tích tụ của phân chim, là điều kiện lý tưởng cho các mầm bệnh E. coli trong chăn nuôi phát triển. Việc ô nhiễm vi khuẩn trong tổ yến không chỉ ảnh hưởng đến sức khỏe đàn yến mà còn trực tiếp đe dọa sức khỏe người tiêu dùng, làm giảm chất lượng tổ yến thô và uy tín của thương hiệu. Do đó, việc chủ động giám sát và phát hiện sớm EPEC là yếu tố then chốt để đảm bảo an toàn sinh học nhà yến và sự phát triển bền vững của ngành. Việc áp dụng các phương pháp chẩn đoán hiện đại như Multiplex PCR để phát hiện EPEC trong nhà yến không còn là lựa chọn mà đã trở thành yêu cầu cấp thiết, giúp các chủ nhà yến kiểm soát rủi ro và bảo vệ tài sản của mình.

1.1. Enteropathogenic E. coli EPEC là gì

EPEC, viết tắt của Enteropathogenic Escherichia coli, là một nhóm vi khuẩn E. coli có khả năng gây bệnh đường ruột, chủ yếu là tiêu chảy. Khác với các chủng E. coli thông thường, EPEC sở hữu các yếu tố độc lực đặc biệt, cho phép chúng bám dính chặt vào tế bào niêm mạc ruột non và phá hủy cấu trúc vi nhung mao. Quá trình này được gọi là tổn thương "gắn và xóa" (attaching and effacing - A/E), là đặc điểm nhận dạng chính của EPEC. Sự phá hủy này làm rối loạn khả năng hấp thu nước và chất dinh dưỡng của ruột, dẫn đến tiêu chảy kéo dài. Dựa trên sự hiện diện của plasmid yếu tố bám dính (EAF plasmid), EPEC được chia thành hai loại: điển hình (tEPEC) và không điển hình (aEPEC). Trong đó, aEPEC đang ngày càng được ghi nhận là tác nhân gây bệnh phổ biến ở cả người và động vật, bao gồm cả chim yến. Sự tồn tại của EPEC trong môi trường nhà yến là một chỉ dấu cảnh báo về nguy cơ ô nhiễm vi khuẩn trong tổ yến ở mức độ cao.

1.2. Tầm quan trọng của việc kiểm soát dịch bệnh chim yến

Việc kiểm soát dịch bệnh chim yến không chỉ đơn thuần là bảo vệ sức khỏe đàn yến. Nó còn là nền tảng để đảm bảo chất lượng tổ yến thô và an toàn cho người sử dụng cuối cùng. Một môi trường nhà yến không đảm bảo an toàn sinh học sẽ là nơi trú ngụ của nhiều tác nhân gây bệnh, trong đó có EPEC. Phân chim yến được xác định là nguồn chứa chính của các mầm bệnh này. Nếu không được kiểm soát, vi khuẩn có thể lây lan từ phân sang tổ yến, nguồn nước và không khí, tạo thành một chu trình ô nhiễm khép kín. Việc thực hiện các xét nghiệm vi sinh vật trong nhà yến một cách định kỳ, đặc biệt là xét nghiệm EPEC trong tổ yến, giúp chủ đầu tư nắm bắt được tình hình sức khỏe của môi trường nuôi. Từ đó, các biện pháp can thiệp kịp thời như vệ sinh, khử trùng sẽ được áp dụng, giúp cắt đứt chuỗi lây nhiễm, bảo vệ đàn yến khỏi nguy cơ bùng phát dịch bệnh và đảm bảo sản phẩm đầu ra đạt tiêu chuẩn an toàn vệ sinh thực phẩm.

II. Thách thức kiểm soát mầm bệnh EPEC trong vận hành nhà yến

Việc kiểm soát và phát hiện EPEC trong nhà yến đối mặt với nhiều thách thức đáng kể. Môi trường đặc thù của nhà yến với độ ẩm cao, nhiệt độ ổn định và ít ánh sáng mặt trời là điều kiện lý tưởng cho vi khuẩn phát triển. Phân chim yến tích tụ liên tục, trở thành nguồn lây nhiễm chính. Các phương pháp chẩn đoán truyền thống như nuôi cấy vi sinh vật thường tốn nhiều thời gian (vài ngày đến một tuần) và có thể cho kết quả không chính xác do sự hiện diện của các vi khuẩn khác. Hơn nữa, không phải tất cả các chủng E. coli đều gây bệnh, việc phân biệt EPEC với các chủng vô hại bằng phương pháp nuôi cấy là rất phức tạp. Điều này dẫn đến sự chậm trễ trong việc đưa ra các biện pháp xử lý, làm tăng nguy cơ lây lan mầm bệnh. Thêm vào đó, việc thiếu một quy trình chuẩn hóa trong việc lấy mẫu và xét nghiệm vi sinh vật trong nhà yến cũng là một rào cản lớn. Những thách thức này đòi hỏi một giải pháp chẩn đoán phân tử tiên tiến, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, giúp xác định chính xác sự hiện diện của gen độc lực của EPEC, từ đó đưa ra cảnh báo sớm và hiệu quả.

2.1. Hạn chế của các phương pháp xét nghiệm truyền thống

Phương pháp nuôi cấy trên đĩa thạch là kỹ thuật kinh điển để xác định vi khuẩn. Tuy nhiên, nó có nhiều nhược điểm khi áp dụng để giám sát mầm bệnh E. coli trong chăn nuôi. Thứ nhất, thời gian chờ kết quả kéo dài, làm lỡ "thời điểm vàng" để can thiệp. Thứ hai, độ đặc hiệu không cao. Nhiều vi khuẩn khác có thể phát triển trên môi trường nuôi cấy và có hình thái khuẩn lạc tương tự E. coli, gây nhầm lẫn. Để xác định chính xác chủng EPEC, cần thực hiện thêm nhiều thử nghiệm sinh hóa phức tạp, tốn kém và đòi hỏi kỹ thuật viên có chuyên môn cao. Thứ ba, phương pháp này không thể phát hiện các vi khuẩn ở trạng thái không thể nuôi cấy (viable but non-culturable - VBNC), một trạng thái mà vi khuẩn vẫn có khả năng gây bệnh. Những hạn chế này làm cho việc giám sát an toàn sinh học nhà yến trở nên bị động và kém hiệu quả, thúc đẩy nhu cầu tìm kiếm các kỹ thuật PCR định danh vi khuẩn hiện đại hơn.

2.2. Nguồn lây nhiễm và nguy cơ từ phân chim yến

Phân chim yến là nguồn lây nhiễm chính của EPEC và nhiều mầm bệnh khác trong nhà yến. Theo nghiên cứu của Leong et al., phân chim chứa một hệ vi sinh vật đa dạng, bao gồm cả các tác nhân gây bệnh. Do tập tính di cư và sinh sống thành bầy đàn lớn, chim yến có thể dễ dàng phát tán mầm bệnh trong môi trường. Vi khuẩn EPEC từ phân có thể phát tán qua nhiều con đường: tiếp xúc trực tiếp, qua không khí (dưới dạng bụi), hoặc nhiễm vào nguồn nước sử dụng trong nhà yến. Khi tổ yến bị nhiễm bẩn, vi khuẩn có thể tồn tại và phát triển, làm giảm chất lượng tổ yến thô và gây nguy hiểm cho người sơ chế và người tiêu dùng. Việc quản lý và xử lý phân yến đúng cách, kết hợp với việc xét nghiệm EPEC trong tổ yến định kỳ, là biện pháp cốt lõi để giảm thiểu nguy cơ ô nhiễm vi khuẩn và bảo vệ toàn diện cho hệ sinh thái nhà yến.

III. Giải pháp Multiplex PCR Phát hiện EPEC nhanh và chính xác

Để khắc phục những hạn chế của phương pháp truyền thống, kỹ thuật Multiplex PCR nổi lên như một giải pháp vượt trội để phát hiện EPEC trong nhà yến. Đây là một kỹ thuật chẩn đoán phân tử cho phép khuếch đại và phát hiện đồng thời nhiều đoạn DNA mục tiêu trong cùng một phản ứng. Thay vì tìm kiếm sự hiện diện của cả con vi khuẩn, Multiplex PCR tập trung vào việc xác định các gen độc lực của EPEC, cụ thể là các gen như eae và escV. Gen eae mã hóa protein intimin, giúp vi khuẩn bám dính vào tế bào ruột, trong khi gen escV là một phần của hệ thống bài tiết type III (T3SS), bộ máy giúp vi khuẩn "bơm" các yếu tố độc lực vào tế bào chủ. Việc phát hiện sự có mặt của các gen này là bằng chứng xác thực về sự tồn tại của EPEC có khả năng gây bệnh. Ưu điểm lớn nhất của quy trình Multiplex PCR là tốc độ, độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Kết quả có thể có trong vòng vài giờ, giúp đưa ra quyết định can thiệp nhanh chóng, là công cụ đắc lực cho việc kiểm soát dịch bệnh chim yến.

3.1. Nguyên lý kỹ thuật PCR định danh vi khuẩn đa mồi

Kỹ thuật PCR định danh vi khuẩn đa mồi, hay Multiplex PCR, hoạt động dựa trên nguyên tắc của phản ứng chuỗi polymerase (PCR). Quá trình này mô phỏng sự nhân đôi DNA tự nhiên trong một ống nghiệm. Một phản ứng Multiplex PCR bao gồm nhiều cặp mồi (primer) khác nhau, mỗi cặp được thiết kế đặc hiệu để nhận diện và bám vào một gen mục tiêu duy nhất (ví dụ: một cặp cho gen eae, một cặp cho gen escV). Khi có mặt DNA của vi khuẩn EPEC trong mẫu, các cặp mồi tương ứng sẽ bám vào gen mục tiêu. Dưới tác động của enzyme Taq polymerase và các chu kỳ nhiệt, các đoạn gen này sẽ được nhân lên hàng triệu lần. Sản phẩm sau khuếch đại được phân tích bằng phương pháp điện di trên gel agarose. Sự xuất hiện của các vạch DNA có kích thước mong đợi xác nhận sự hiện diện của các gen độc lực, qua đó khẳng định mẫu dương tính với EPEC. Kỹ thuật này cho phép phân tích DNA vi khuẩn một cách nhanh chóng và chính xác.

3.2. So sánh Multiplex PCR và phương pháp Real time PCR

Cả Multiplex PCR và phương pháp Real-time PCR đều là những công cụ chẩn đoán phân tử mạnh mẽ. Multiplex PCR thường cho kết quả định tính (có hoặc không có mầm bệnh) bằng cách phân tích sản phẩm cuối cùng qua điện di. Ưu điểm của nó là khả năng phát hiện nhiều mục tiêu cùng lúc với chi phí thiết bị ban đầu thấp hơn. Ngược lại, Real-time PCR (hay qPCR) cung cấp kết quả định lượng, cho biết số lượng bản sao DNA mục tiêu có trong mẫu ban đầu. Nó theo dõi sự khuếch đại DNA trong thời gian thực thông qua tín hiệu huỳnh quang, không cần bước điện di sau phản ứng, do đó giảm nguy cơ ngoại nhiễm và nhanh hơn. Tuy nhiên, chi phí cho thiết bị và hóa chất của Real-time PCR cao hơn. Trong bối cảnh sàng lọc và phát hiện EPEC trong nhà yến, Multiplex PCR là một lựa chọn hiệu quả về chi phí để xác định sự hiện diện của mầm bệnh. Khi cần đánh giá mức độ ô nhiễm, Real-time PCR sẽ là công cụ bổ sung hữu ích.

IV. Hướng dẫn quy trình phát hiện EPEC bằng Multiplex PCR tối ưu

Việc xây dựng một quy trình Multiplex PCR chuẩn hóa là điều kiện tiên quyết để đảm bảo kết quả xét nghiệm chính xác và đáng tin cậy. Dựa trên nghiên cứu "Nhận biết sự hiện diện của atypical EPEC trong môi trường nhà yến bằng kỹ thuật multiplex-PCR" của tác giả Trần Thị Thanh Trang (Đại học Nông Lâm TP.HCM), một quy trình tối ưu đã được thiết lập. Quy trình này bao gồm các bước chính: thu thập và xử lý mẫu, tách chiết DNA, thực hiện phản ứng Multiplex PCR với các điều kiện tối ưu, và cuối cùng là điện di phân tích kết quả. Sự thành công của quy trình phụ thuộc rất nhiều vào việc tối ưu hóa các thông số quan trọng như nhiệt độ bắt cặp của mồi, nồng độ mồi, và giới hạn phát hiện của phản ứng. Việc tuân thủ nghiêm ngặt quy trình này sẽ giúp các phòng thí nghiệm và đơn vị chăn nuôi có được một công cụ mạnh mẽ để giám sát an toàn sinh học nhà yến, từ đó bảo vệ sức khỏe đàn yến và nâng cao chất lượng sản phẩm.

4.1. Bước 1 Thu thập và tách chiết DNA vi khuẩn từ mẫu

Chất lượng của kết quả phân tích DNA vi khuẩn phụ thuộc lớn vào khâu lấy mẫu và tách chiết ban đầu. Mẫu xét nghiệm có thể là mẫu phân chim yến hoặc mẫu phết bề mặt tổ yến, sàn nhà, tường. Mẫu cần được thu thập bằng dụng cụ vô trùng và bảo quản lạnh để tránh sự phát triển của vi khuẩn tạp nhiễm. Tại phòng thí nghiệm, DNA tổng số sẽ được tách chiết từ mẫu bằng các bộ kit thương mại chuyên dụng. Nguyên tắc chung của quá trình này là phá vỡ tế bào vi khuẩn để giải phóng vật chất di truyền, sau đó loại bỏ các thành phần không mong muốn như protein, lipid và các mảnh vụn tế bào. DNA tinh sạch thu được sẽ là khuôn cho phản ứng PCR. Một quy trình tách chiết hiệu quả sẽ đảm bảo thu được lượng DNA đủ và sạch, không chứa các chất ức chế phản ứng PCR, là tiền đề cho một xét nghiệm thành công.

4.2. Bước 2 Tối ưu hóa điều kiện phản ứng Multiplex PCR

Đây là bước quan trọng nhất trong việc xây dựng quy trình. Nghiên cứu của Trần Thị Thanh Trang đã chỉ ra các thông số tối ưu để phát hiện EPEC trong nhà yến một cách hiệu quả. Nhiệt độ bắt cặp (annealing temperature) tối ưu được xác định là 60°C. Đây là nhiệt độ mà các mồi đặc hiệu cho gen eae và escV có thể bám vào DNA khuôn một cách chính xác nhất, tránh việc bám nhầm gây ra sản phẩm không mong muốn. Tỷ lệ nồng độ tối ưu giữa hai cặp mồi cho gen escV và eae được xác định là 1:2. Việc tối ưu nồng độ mồi giúp đảm bảo các gen mục tiêu được khuếch đại một cách cân bằng. Giới hạn phát hiện (Limit of Detection - LoD) của quy trình được xác định ở mức 10⁻⁵ ng/µL, cho thấy phản ứng có độ nhạy rất cao, có thể phát hiện được lượng DNA vi khuẩn rất nhỏ trong mẫu. Những thông số này là kim chỉ nam để thực hiện phản ứng một cách chuẩn xác.

4.3. Bước 3 Phân tích kết quả qua điện di trên gel agarose

Sau khi phản ứng PCR kết thúc, sản phẩm khuếch đại sẽ được phân tích bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose. Mẫu PCR được nạp vào các giếng trên bản gel và một dòng điện được chạy qua. Do DNA mang điện tích âm, chúng sẽ di chuyển về phía cực dương. Các đoạn DNA có kích thước nhỏ hơn sẽ di chuyển nhanh hơn và xa hơn các đoạn lớn. Một thang chuẩn DNA (DNA ladder) với các đoạn có kích thước đã biết được chạy song song để so sánh. Sau khi điện di, bản gel được nhuộm bằng chất phát quang dưới ánh sáng UV. Nếu mẫu dương tính với EPEC, các vạch sáng tương ứng với kích thước của gen eae (881 bp) và/hoặc gen escV (266 bp) sẽ xuất hiện. Sự hiện diện của vạch escV xác nhận sự tồn tại của EPEC không điển hình (aEPEC), cung cấp một kết quả rõ ràng và đáng tin cậy.

V. Kết quả thực tiễn Phát hiện EPEC tại nhà yến miền Nam

Việc áp dụng quy trình Multiplex PCR tối ưu vào thực tế đã mang lại những kết quả quan trọng, cung cấp một cái nhìn tổng quan về tình hình nhiễm EPEC trong các nhà yến tại khu vực miền Nam Việt Nam. Nghiên cứu của Trần Thị Thanh Trang đã tiến hành khảo sát trên 90 mẫu thực địa, bao gồm mẫu phân và mẫu phết bề mặt, thu thập từ các nhà yến tại Đồng Nai, Bình Dương và TP. Hồ Chí Minh. Kết quả là một minh chứng rõ ràng cho hiệu quả của phương pháp chẩn đoán phân tử. Việc phát hiện được sự hiện diện của gen độc lực của EPEC cho thấy nguy cơ ô nhiễm vi khuẩn trong tổ yến là có thật và cần được quan tâm đúng mức. Những dữ liệu này không chỉ có giá trị khoa học mà còn là cơ sở để các cơ quan quản lý và chủ nhà yến xây dựng các chiến lược kiểm soát dịch bệnh chim yến hiệu quả hơn, góp phần nâng cao chất lượng tổ yến thô và bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

5.1. Tỷ lệ nhiễm EPEC qua xét nghiệm 90 mẫu thực địa

Kết quả phân tích 90 mẫu cho thấy một tỷ lệ nhiễm đáng chú ý. Cụ thể, có 19 trên 90 mẫu (chiếm 21,11%) cho kết quả dương tính với gen escV. Trong số đó, có 13 mẫu là mẫu phân và 6 mẫu là mẫu phết bề mặt tổ yến. Đáng chú ý, không có mẫu nào được ghi nhận dương tính với gen eae. Sự hiện diện của gen escV mà không có gen eae là đặc điểm của chủng EPEC không điển hình (aEPEC). Gen escV là một thành phần cốt lõi của hệ thống bài tiết type III, cần thiết cho khả năng gây bệnh của EPEC. Kết quả này khẳng định sự lưu hành của aEPEC trong môi trường nhà yến tại khu vực khảo sát. Tỷ lệ 21,11% là một con số cảnh báo, cho thấy việc xét nghiệm EPEC trong tổ yến và môi trường xung quanh cần được thực hiện thường xuyên để giám sát và phòng ngừa.

5.2. Diễn giải kết quả Sự hiện diện của aEPEC EPEC không điển hình

Việc tất cả các mẫu dương tính đều chỉ có gen escV cho thấy tác nhân lưu hành chủ yếu là aEPEC. EPEC không điển hình (atypical EPEC) đang ngày càng được công nhận là một tác nhân gây tiêu chảy quan trọng trên toàn cầu, đặc biệt ở các nước công nghiệp hóa. Mặc dù cơ chế gây bệnh của chúng vẫn đang được nghiên cứu, sự hiện diện của hệ thống bài tiết type III (được mã hóa bởi các gen trong đó có escV) là đủ để chúng gây ra các tổn thương đặc trưng trên tế bào ruột. Phát hiện này có ý nghĩa quan trọng đối với an toàn sinh học nhà yến. Nó cho thấy rằng ngay cả khi không phát hiện các chủng EPEC "kinh điển", nguy cơ từ các chủng không điển hình vẫn hiện hữu. Do đó, các quy trình Multiplex PCR cần bao gồm các gen chỉ thị cho cả hai nhóm EPEC để có một bức tranh toàn cảnh về các mầm bệnh E. coli trong chăn nuôi yến.

Nội dung chính

Giới thiệu dự án

Nghề nuôi chim yến (Aerodramus fuciphagus) tại Việt Nam đã phát triển bùng nổ từ năm 2004, trở thành ngành kinh tế nông nghiệp kỹ thuật cao có giá trị gia tăng vượt trội. Với giá trị thương phẩm dao động từ 1.500 – 2.000 USD/kg tổ yến thô và kim ngạch xuất khẩu đạt từ 100 – 125 triệu USD/năm, mô hình này đã mở rộng trên 42/63 tỉnh thành cả nước. Tuy nhiên, chim yến là loài chim hoang dã có tập tính sống bầy đàn mật độ cao, di cư liên vùng và bài tiết trực tiếp trong không gian khép kín của nhà yến. Phân chim yến và bề mặt tổ là môi trường tích tụ nhiều mầm bệnh nguy hiểm, đặc biệt là vi khuẩn Escherichia coli gây bệnh đường ruột không điển hình (atypical Enteropathogenic E. coli - aEPEC).

Chủng aEPEC là tác nhân hàng đầu gây viêm dạ dày ruột cấp tính và tiêu chảy kéo dài ở trẻ em (chỉ đứng sau Rotavirus về tỷ lệ nhập viện và độ nghiêm trọng lâm sàng). Khác với tEPEC mang plasmid pEAF mã hóa thể bám tạo búi (Bundle-Forming Pilus - BFP), aEPEC mang đảo sinh bệnh học LEE (Locus of Enterocyte Effacement) nhưng thiếu plasmid pEAF. Do đó, việc xác định aEPEC đòi hỏi phải phát hiện đồng thời các chỉ thị phân tử đặc hiệu gồm gen mã hóa protein intimin (eae) và gen mã hóa tiểu phần bộ máy tiết loại III T3SS (escV).

   +-------------------------------------------------------------------------+
   |                     HỆ THỐNG GIÁM SÁT NHÀ YẾN                           |
   |                                                                         |
   |   [Mẫu phân chim yến / Mẫu phết tổ] ---> [Tách chiết DNA hệ gen]        |
   |                                                      |                  |
   |                                                      v                  |
   |   [Gen eae (881 bp)] <==== [Multiplex-PCR (60°C)] ====> [Gen escV (266 bp)]
   |           |                                                      |      |
   |           +-----------------> [Điện di Gel Agarose 1.2%] <-------+      |
   |                                      |                                  |
   |                                      v                                  |
   |                  [Xác định mầm bệnh aEPEC (LoD: 10^-5 ng/µL)]           |
   +-------------------------------------------------------------------------+

Vấn đề cốt lõi hiện nay là ngành nuôi yến Việt Nam thiếu quy chuẩn an toàn sinh học và quy trình chẩn đoán phân tử tại chỗ nhanh chóng, dẫn đến nguy cơ ô nhiễm chéo mầm bệnh từ phân vào tổ yến thương phẩm, đe dọa trực tiếp sức khỏe người tiêu dùng và các tiêu chuẩn kiểm dịch xuất khẩu chính ngạch.

Mục tiêu dự án

1. Thiết kế và tối ưu hóa quy trình kỹ thuật Multiplex-PCR (mPCR) nhằm phát hiện đồng thời hai gen độc lực eae (881 bp) và escV (266 bp) của aEPEC.
2. Chuẩn hóa các thông số vận hành then chốt: Xác định nhiệt độ bắt cặp tối ưu ($T_a$), tỷ lệ nồng độ mồi (escV : eae), giới hạn phát hiện thấp nhất (LoD) và độ đặc hiệu đối với các chủng vi khuẩn đối chứng.
3. Ứng dụng quy trình vào thực địa: Khảo sát và đánh giá tỷ lệ lưu hành thực tế của aEPEC trên 90 mẫu (phân và phết bề mặt tổ yến) thu thập từ các nhà nuôi yến tại 3 tỉnh thành phía Nam (Đồng Nai, Bình Dương, TP. Hồ Chí Minh).

Phạm vi và giới hạn

• Phạm vi nghiên cứu: Đánh giá các biến thể gen độc lực phân tử của aEPEC trong môi trường nhà yến khu vực Đông Nam Bộ; chuẩn hóa phản ứng PCR đa mồi trên hệ thống luân nhiệt quy chuẩn.
• Giới hạn: Không bao gồm giải trình tự toàn bộ hệ gen (Whole Genome Sequencing) và chưa đánh giá độc lực thông qua mô hình gây nhiễm in vivo.

---

Phân tích và thiết kế giải pháp

Phân tích hiện trạng

Phương pháp	Thời gian thực hiện	Độ nhạy & Giới hạn phát hiện (LoD)	Chi phí / Mẫu	Ưu điểm	Nhược điểm
Nuôi cấy & Sinh hóa truyền thống (TCVN 8400-16)	48 - 72 giờ	Thấp ($10^3 - 10^4 \text{ CFU/g}$)	Thấp (~2 USD)	Chi phí thiết bị thấp, định danh vi khuẩn sống	Không phân biệt được pathotype (aEPEC vs commensal E. coli)
Ngưng kết kháng huyết thanh O:H	24 - 48 giờ	Trung bình	Trung bình (~5 USD)	Định danh serogroup cổ điển	Bỏ sót >200 serogroup aEPEC không điển hình
Singleplex PCR từng gen riêng lẻ	4 - 6 giờ	Cao ($10^{-3} \text{ ng/\mu L}$)	Cao (thực hiện nhiều phản ứng)	Độ chính xác từng locus cao	Tốn hóa chất gấp 2 lần, nguy cơ sai số thao tác
Multiplex-PCR tối ưu hóa (Giải pháp đề xuất)	2.5 - 3.5 giờ	Rất cao ($10^{-5} \text{ ng/\mu L}$)	Tối ưu (~3.5 USD)	Phát hiện đồng thời eae & escV trong 1 ống phản ứng	Cần kiểm soát nghiêm ngặt hiện tượng tạo primer dimer

Phân loại yêu cầu hệ thống theo mô hình MoSCoW:

• Must have: Khả năng khuếch đại đồng thời 2 vạch đặc hiệu 266 bp (escV) và 881 bp (eae); giới hạn phát hiện $\le 10^{-4} \text{ ng/\mu L}$; không phản ứng chéo với STEC, ETEC, EAEC, EIEC, DAEC.
• Should have: Thời gian chu nhiệt $\le 120$ phút; nồng độ mồi cân bằng không gây ức chế cạnh tranh.
• Could have: Tích hợp quy trình ly trích DNA nhanh từ nền mẫu phức tạp (phân chim yến nhiều acid uric).
• Won't have (lần này): Bộ kit multiplex qPCR dạng đông khô thương phẩm.

---

Thiết kế hệ thống sinh học phân tử

                       QUY TRÌNH PHÂN TÍCH PHÂN TỬ aEPEC
                                
   [Mẫu phân / Swab tổ yến]
              |
              v
   [Tách chiết DNA (WizPrep Kit V2)] ---> [Đo quang phổ BioDrop A260/A280]
                                                          |
              +-------------------------------------------+
              |
              v
   [Hỗn hợp phản ứng Multiplex-PCR (20 uL)]
   * DreamTaq Green Master Mix (2X): 10 uL
   * Primer escV-F/R (0.2 uM): 1 uL
   * Primer eae-F/R (0.4 uM): 1 uL
   * Nuclease-free water: 6 uL
   * DNA Template: 2 uL
              |
              v
   [Hệ thống chu nhiệt Bioer Thermal Cycler]
   * 95°C (7 min) -> 35x [95°C (30s) - 60°C (45s) - 72°C (45s)] -> 72°C (7 min)
              |
              v
   [Điện di ngang Gel Agarose 1.2% (Bio-Rad) - Đệm TAE 1X]
              |
              v
   [Đọc kết quả UV Transilluminator: Band 266 bp (escV) & 881 bp (eae)]

Ma trận thiết kế đoạn mồi (Primer Design Matrix):

1. Gen eae (Mã hóa phân tử bám dính Intimin):
   • Forward: 5'-CCCGAATTCGGCACAAGCATAAGC-3'
   • Reverse: 5'-CCCGGATCCGTCTCGCCAGTATTCG-3'
   • Kích thước amplicon: 881 bp | Nhiệt độ nóng chảy tính toán ($T_m$): $65.56^\circ\text{C}$
2. Gen escV (Mã hóa protein kênh màng trong của hệ thống T3SS):
   • Forward: 5'-TAACGCCTGCGCGCATATCACC-3'
   • Reverse: 5'-GTTGATGCGCCTGTCGCTAGT-3'
   • Kích thước amplicon: 266 bp | Nhiệt độ nóng chảy tính toán ($T_m$): $66.32^\circ\text{C}$

Danh mục hóa chất và thiết bị tiêu chuẩn:

• Hóa chất khuếch đại: DreamTaq Green Master Mix 2X (Thermo Scientific, Mã: #K1081).
• Kit ly trích: WizPrep™ Viral DNA/RNA Mini Kit V2 (Wizbiosolutions, Mã: W73052-100); TopPURE® Tissue Viral Extraction Kit.
• Chuẩn DNA: GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder (Thermo Scientific); Thuốc nhuộm Midori Green Advance (NIPPON Genetics Europe).
• Thiết bị: Máy luân nhiệt Bioer Thermal Cycler, Buồng điện di Bio-Rad Wide Mini-Sub Cell GT, Máy quang phổ BioDrop LITE UV/Vis, Bàn soi gel UV Transilluminator.

---

Phương pháp nghiên cứu (Methodology)

Quy trình thực nghiệm được triển khai qua 4 giai đoạn chuẩn hóa nghiêm ngặt:

1. Giai đoạn 1 (Simplex Optimization): Thử nghiệm dải nhiệt độ $54^\circ\text{C}, 56^\circ\text{C}, 58^\circ\text{C}, 60^\circ\text{C}, 62^\circ\text{C}, 64^\circ\text{C}$ cho từng cặp mồi đơn.
2. Giai đoạn 2 (Multiplex Balancing): Phối hợp 2 cặp mồi trong cùng 1 phản ứng, điều chỉnh tỷ lệ mol giữa các mồi để loại trừ sự cạnh tranh dNTP và polymerase.
3. Giai đoạn 3 (Analytical Sensitivity & Specificity): Pha loãng bậc 10 DNA chứng dương từ $1 \text{ ng/\mu L}$ xuống $10^{-9} \text{ ng/\mu L}$ để tìm LoD; kiểm tra chéo với 7 hệ gen vi sinh vật đường ruột khác.
4. Giai đoạn 4 (Field Validation): Thu thập và xử lý 90 mẫu thực địa từ các nhà yến tại TP.HCM, Bình Dương và Đồng Nai.

---

Triển khai thực nghiệm và Kết quả

Quy trình phân tích dữ liệu & Code mô phỏng thông số phản ứng

Đoạn mã Python dưới đây mô phỏng việc tính toán nồng độ mastermix, kiểm tra điều kiện $T_m$ và phân tích dữ liệu mẫu thực địa:

import numpy as np
import pandas as pd

class MultiplexPCROptimizer:
    def __init__(self, target_genes: dict):
        self.target_genes = target_genes

    def calculate_reaction_mix(self, num_samples: int, excess_factor: float = 1.1) -> pd.DataFrame:
        """Tính toán thể tích hóa chất cho Multiplex-PCR với hệ số hao hụt."""
        base_recipe = {
            "DreamTaq MasterMix (2X) [uL]": 10.0,
            "escV Primer (10 uM) [uL]": 1.0,     # Final conc: 0.2 uM (Ratio 1)
            "eae Primer (10 uM) [uL]": 2.0,      # Final conc: 0.4 uM (Ratio 2)
            "Nuclease-free Water [uL]": 5.0,
            "DNA Template [uL]": 2.0
        }
        total_samples = num_samples * excess_factor
        mastermix_table = {k: v * total_samples for k, v in base_recipe.items()}
        return pd.DataFrame(list(mastermix_table.items()), columns=["Component", "Total Volume (uL)"])

    def evaluate_field_data(self, data: list) -> dict:
        """Phân tích tỷ lệ mẫu dương tính với escV và eae."""
        df = pd.DataFrame(data)
        summary = {
            "Total Samples": len(df),
            "escV Positive": int(df['escV'].sum()),
            "eae Positive": int(df['eae'].sum()),
            "aEPEC Rate (%)": (df['escV'].sum() / len(df)) * 100
        }
        return summary

# Thông số mồi
genes = {
    "escV": {"size_bp": 266, "Tm": 66.32, "ratio": 1},
    "eae": {"size_bp": 881, "Tm": 65.56, "ratio": 2}
}

optimizer = MultiplexPCROptimizer(genes)
mix_plan = optimizer.calculate_reaction_mix(num_samples=90)
print(mix_plan.to_string(index=False))

---

Kết quả tối ưu hóa thông số kỹ thuật

1. Tối ưu hóa nhiệt độ bắt cặp ($T_a$)

• Phản ứng singleplex xác nhận cả hai cặp mồi đều bắt cặp tốt trên dải nhiệt từ $54^\circ\text{C}$ đến $64^\circ\text{C}$.
• Trên hệ thống Multiplex-PCR, tại mốc nhiệt $60^\circ\text{C}$, cả 2 vạch amplicon 881 bp (eae) và 266 bp (escV) đạt độ sắc nét cao nhất, hạn chế tối đa hiện tượng mờ dải băng và vạch phụ.

Chu trình luân nhiệt tối ưu:
  Giai đoạn 1: Biến tính ban đầu: 95°C trong 7 phút (Kích hoạt enzym)
  Giai đoạn 2 (35 chu kỳ):
    - Biến tính: 95°C trong 30 giây
    - Bắt cặp: 60°C trong 45 giây (Điểm tối ưu tuyệt đối)
    - Kéo dài: 72°C trong 45 giây (Tốc độ khuếch đại: 1 kb/phút)
  Giai đoạn 3: Kéo dài kết thúc: 72°C trong 7 phút
  Giai đoạn 4: Bảo quản: 4°C

2. Cân bằng nồng độ mồi (Primer Concentration Ratio)

Do amplicon eae (881 bp) dài hơn đáng kể so với escV (266 bp), enzyme Taq polymerase có xu hướng ưu tiên khuếch đại đoạn ngắn (escV), dẫn đến hiện tượng vạch eae bị mờ khi dùng tỷ lệ 1:1 ($0.2,\mu\text{M} : 0.2,\mu\text{M}$).

• Tỷ lệ tối ưu được thiết lập: escV : eae = 1 : 2 (tương ứng $0.2,\mu\text{M} : 0.4,\mu\text{M}$). Tại tỷ lệ này, cả 2 vạch phát quang đồng đều dưới ánh sáng UV.

3. Giới hạn phát hiện (LoD) và Độ đặc hiệu

• Thử nghiệm pha loãng bậc 10 cho thấy phản ứng duy trì tín hiệu dương tính rõ ràng từ nồng độ $1\text{ ng/\mu L}$ xuống đến $10^{-5}\text{ ng/\mu L}$ (Lane 1 đến Lane 7). Tín hiệu bắt đầu mất hẳn từ mốc $10^{-6}\text{ ng/\mu L}$.
• Độ đặc hiệu đạt 100%: Không có hiện tượng bắt cặp chéo hoặc xuất hiện vạch lạ khi thử nghiệm trên các chủng đối chứng âm bao gồm: Proteus spp., STEC, ETEC, DAEC, EIEC, EAEC, Staphylococcus spp., Clostridium perfringens, và Streptococcus spp.

Bảng kiểm tra giới hạn phát hiện (LoD) qua 3 lần lặp lại (Replication):
+-----------+------+-------+-------+-------+-------+-------+-------+-------+-------+
| Lần lặp   | 1 ng | 10^-1 | 10^-2 | 10^-3 | 10^-4 | 10^-5 | 10^-6 | 10^-7 | 10^-8 |
+-----------+------+-------+-------+-------+-------+-------+-------+-------+-------+
| Lần 1     | (+)  | (+)   | (+)   | (+)   | (+)   | (+)   | (-)   | (-)   | (-)   |
| Lần 2     | (+)  | (+)   | (+)   | (+)   | (+)   | (+)   | (-)   | (-)   | (-)   |
| Lần 3     | (+)  | (+)   | (+)   | (+)   | (+)   | (+)   | (-)   | (-)   | (-)   |
+-----------+------+-------+-------+-------+-------+-------+-------+-------+-------+
Kết luận: LoD đạt ngưỡng chuẩn xác tại 10^-5 ng/uL.

---

Kết quả khảo sát trên 90 mẫu thực địa nhà yến

Loại mẫu thực địa	Tổng số mẫu ($n$)	Số mẫu dương tính escV	Tỷ lệ dương tính escV (%)	Số mẫu dương tính eae	Nhận định pathotype
Mẫu phết bề mặt tổ yến (Swab)	23	6	26.09%	0 (0.00%)	aEPEC lưu hành
Mẫu phân chim yến (Feces)	67	13	19.40%	0 (0.00%)	aEPEC lưu hành
Tổng cộng	90	19	21.11%	0 (0.00%)	aEPEC lưu hành

                TỶ LỆ PHÁT HIỆN aEPEC TRÊN CÁC LOẠI MẪU THỰC ĐỊA
   +-------------------------------------------------------------------------+
   | Phết bề mặt tổ yến  [████████████████              ]  26.09% (6/23 mẫu) |
   | Phân chim yến       [████████████                  ]  19.40% (13/67 mẫu)|
   | Tổng đàn khảo sát   [█████████████                 ]  21.11% (19/90 mẫu)|
   +-------------------------------------------------------------------------+

• Phân tích hiện tượng gen eae âm tính: Trong 19 mẫu dương tính với escV, không có mẫu nào cho tín hiệu dương tính với đoạn mồi eae. Hiện tượng này hoàn toàn phù hợp với các công bố quốc tế về dịch tễ học phân tử: các chủng aEPEC hoang dã từ chim tự nhiên thường có tính đa hình cao (polymorphism) ở gen mã hóa intimin (eae mang nhiều phân lớp $\alpha, \beta, \gamma, \theta, \varepsilon...$), hoặc locus này bị đột biến điểm/mất đoạn dưới áp lực môi trường, trong khi gen escV thuộc hệ thống bài tiết T3SS có tính bảo tồn tiến hóa cao hơn.

---

Đổi mới và Đóng góp kỹ thuật

1. Cải tiến kỹ thuật đột phá

• Tối ưu hóa tỷ lệ nồng độ mồi bất đối xứng (Asymmetric Primer Ratio 1:2): Giải quyết triệt để sự chênh lệch hiệu suất khuếch đại giữa đoạn gen ngắn (266 bp) và đoạn gen dài (881 bp), ngăn chặn hiện tượng lấn át tín hiệu trong mPCR.
• Độ nhạy vượt trội: Đạt giới hạn phát hiện $10^{-5}\text{ ng/\mu L}$, cao hơn gấp 100 lần so với các kỹ thuật PCR truyền thống ($10^{-3}\text{ ng/\mu L}$), cho phép phát hiện vi khuẩn ngay cả khi mật độ tế bào trong phân cực thấp.

2. So sánh với các giải pháp hiện hành

Tiêu chí	Nuôi cấy sinh hóa cổ điển	Phương pháp Multiplex 16-plex	Quy trình Multiplex 2-plex (Đề tài)
Số lượng mục tiêu	Định danh loài chung	16 gen gây tiêu chảy	2 gen độc lực then chốt (escV, eae)
Thời gian chẩn đoán	48 - 72 giờ	5 - 6 giờ	2.5 - 3.5 giờ
Chi phí phản ứng	Thấp	Rất cao	Tiết kiệm 60% so với 16-plex
Độ phức tạp vận hành	Dễ sai sót định danh	Rất khó cân bằng mồi, dễ tạo mồi phụ	Độ lặp lại cao, quy trình chuẩn hóa cao
Mức độ sẵn sàng chuyển giao	Lạc hậu	Chỉ dùng trong viện nghiên cứu lớn	Phù hợp mọi lab kiểm nghiệm thú y

3. Đóng góp khoa học và thực tiễn ngành yến

• Cung cấp bằng chứng dịch tễ phân tử đầu tiên khẳng định tỷ lệ nhiễm aEPEC lên tới 21.11% trong môi trường nhà nuôi chim yến tại 3 tỉnh trọng điểm Đông Nam Bộ.
• Cảnh báo nguy cơ lây nhiễm vi sinh vật qua đường tiêu hóa từ tổ yến thô (tỷ lệ nhiễm trên bề mặt tổ đạt 26.09%), cung cấp cơ sở khoa học để Cục Thú y và các hiệp hội yến sào xây dựng quy chuẩn tiền xử lý nhiệt và khử trùng sinh học cho tổ yến xuất khẩu.

---

Ứng dụng thực tế và Triển khai thương mại

Các kịch bản ứng dụng (Use Cases)

1. Kiểm chuẩn xuất khẩu tổ yến chính ngạch: Sử dụng quy trình mPCR làm chỉ tiêu vi sinh bắt buộc trong hồ sơ COA (Certificate of Analysis) xuất khẩu sang thị trường Trung Quốc, Mỹ và EU.
2. Giám sát an toàn sinh học định kỳ tại nhà yến: Các công ty quản lý chuỗi nhà yến có thể xét nghiệm mẫu phân định kỳ 3 tháng/lần để phát hiện ổ dịch và xử lý tiêu độc khử trùng kịp thời.
3. Chẩn đoán dịch tễ thú y và nhi khoa: Ứng dụng chẩn đoán phân biệt nhanh tác nhân tiêu chảy aEPEC với các pathotype E. coli khác tại các bệnh viện nhi và viện thú y.

                       LỘ TRÌNH TRIỂN KHAI THỰC ĐỊA (ROADMAP)
                                
   Tháng 1 - 3: SOP & Validation         Tháng 4 - 6: Triển khai 30 Lab      Tháng 7 - 12: Mở rộng toàn quốc
   +------------------------------+     +-------------------------------+   +-------------------------------+
   | * Chuẩn hóa bộ SOP phòng lab | --> | * Đào tạo KTV kiểm nghiệm     |-> | * Chuyển giao cho 42 tỉnh yến |
   | * Đăng ký bản quyền quy trình|     | * Thử nghiệm liên phòng lab   |   | * Tích hợp hệ thống quản lý   |
   | * Thiết lập panel mẫu chuẩn  |     | * Kiểm tra độ ổn định hóa chất|   |   chất lượng ISO 17025        |
   +------------------------------+     +-------------------------------+   +-------------------------------+

Phân tích hiệu quả kinh tế (ROI & Cost-Benefit)

• Chi phí cho 1 test mPCR: ~80.000 VNĐ (~3.5 USD).
• Giá trị bảo vệ: Một nhà yến quy mô trung bình (thu hoạch 5 kg tổ/tháng, trị giá ~150 – 200 triệu VNĐ) nếu bị nhiễm khuẩn nặng làm hỏng chất lượng tổ có thể thiệt hại hàng trăm triệu đồng. Chi phí kiểm soát định kỳ chỉ chiếm <0.5% doanh thu, mang lại ROI vô cùng vượt trội trong phòng ngừa rủi ro thu hồi sản phẩm xuất khẩu.

---

Hạn chế và Hướng phát triển

Hạn chế kỹ thuật

1. Sự biến đổi di truyền cao của locus eae khiến cặp mồi thử nghiệm chưa bắt cặp được các biến thể hiếm gặp của gen intimin trên thực địa.
2. Phương pháp mPCR thông thường kết hợp điện di gel agarose vẫn mang tính chất bán định lượng, chưa đo lường chính xác mật độ vi khuẩn (bacterial load) dạng số lượng bản sao.
3. Phạm vi lấy mẫu tập trung ở khu vực Đông Nam Bộ (90 mẫu), chưa bao phủ khu vực Duyên hải Miền Trung và Tây Nguyên.

Định hướng nghiên cứu mở rộng

• Phát triển Multiplex Real-time PCR (qPCR): Tích hợp đầu dò TaqMan probe đa kênh gắn huỳnh quang (FAM/HEX) để định lượng trực tiếp số lượng bản sao gen escV và eae mà không cần bước chạy điện di.
• Mở rộng bộ mồi Intimin đa phân lớp: Thiết kế hệ thống mồi thoái hóa (degenerate primers) để khuếch đại toàn bộ 28 phân lớp intimin của aEPEC.
• Giải trình tự gen thế hệ mới (NGS): Giải mã toàn bộ hệ gen (Whole Genome) các chủng E. coli phân lập được từ nhà yến để lập bản đồ kháng kháng sinh (antimicrobial resistance genes - ARG).

---

Đối tượng hưởng lợi

+---------------------------------------------------------------------------------------------------+
|                                    CÁC BÊN HƯỞNG LỢI DỰ ÁN                                        |
+---------------------------------------------------------------------------------------------------+
|                                                                                                   |
|   [Sinh viên & Giảng viên]       --->  Tài liệu chuẩn mực về tối ưu hóa mPCR, cân bằng mồi        |
|   [Kỹ thuật viên Lab]            --->  Quy trình thao tác chuẩn (SOP), tối ưu hóa hóa chất        |
|   [Chủ nhà yến & Doanh nghiệp]   --->  Bảo vệ thương hiệu tổ yến sạch, đủ tiêu chuẩn xuất khẩu   |
|   [Nhà dịch tễ học & Bác sĩ]     --->  Dữ liệu cảnh báo tỷ lệ nhiễm aEPEC từ nguồn chim hoang dã  |
|                                                                                                   |
+---------------------------------------------------------------------------------------------------+

• Sinh viên & Học viên Công nghệ Sinh học: Cung cấp case study hoàn chỉnh về phương pháp luận tối ưu hóa phản ứng PCR đa mồi, kỹ thuật xử lý mẫu phân tích vi sinh vật và phương pháp luận viết báo cáo khoa học.
• Chuyên viên xét nghiệm vi sinh: Nhận được một quy trình kỹ thuật rõ ràng với thông số chi tiết (tỷ lệ mồi 1:2, chu nhiệt $60^\circ\text{C}$, hóa chất DreamTaq), có thể ứng dụng ngay tại phòng lab.
• Doanh nghiệp và Nông hộ nuôi yến: Sở hữu công cụ kiểm soát an toàn sinh học hiệu quả, nâng cao giá trị thương phẩm tổ yến thêm 15 - 20% nhờ chứng nhận không nhiễm khuẩn đường ruột nguy hiểm.
• Cơ quan quản lý Thú y & Dịch tễ: Có số liệu thực chứng (21.11% nhiễm aEPEC) để tham mưu chính sách kiểm soát vệ sinh thú y đối với các cơ sở nuôi chim yến đô thị.

---

Câu hỏi thường gặp (FAQ)

1. Yêu cầu cấu hình phòng lab để triển khai quy trình này là gì?

Phòng xét nghiệm đạt tiêu chuẩn an toàn sinh học cấp II, bao gồm: Tủ an toàn sinh học (Biosafety Cabinet Class II), Máy luân nhiệt PCR (Bioer hoặc tương đương), Bộ nguồn và bể điện di nằm ngang (Bio-Rad), Bàn soi gel UV/Blue Light Transilluminator, Máy ly tâm tốc độ cao ($13.000\text{ rpm}$), Micropipette đơn kênh các dải từ $0.5 - 1000,\mu\text{L}$.

2. Vì sao trong nghiên cứu này mẫu thực địa chỉ dương tính với gen escV mà âm tính với eae?

escV mã hóa thành phần cấu trúc cốt lõi của hệ thống bài tiết loại III (T3SS) nằm trên đảo sinh bệnh học LEE, có tính bảo tồn rất cao giữa các chủng E. coli gây tổn thương bám dính và xóa mòn (Attaching and Effacing - A/E). Trong khi đó, gen eae mã hóa protein intimin có tính đa hình cực kỳ lớn (>28 subtype kháng nguyên khác nhau) và dễ bị đột biến mất đoạn ngoài tự nhiên. Khi vi khuẩn mang escV mà thiếu eae hoặc mang biến thể eae khác, chúng vẫn được xếp vào nhóm aEPEC có khả năng gây bệnh.

3. Quy trình này có thể áp dụng trực tiếp cho các nền mẫu khác như thực phẩm hay nước thải không?

Hoàn toàn có thể. Tuy nhiên, với nền mẫu nước thải hoặc thực phẩm nhiều chất ức chế PCR (Polyphenol, Heme, Acid Humic), cần sử dụng kit ly trích DNA chuyên dụng có cột lọc silica loại bỏ chất ức chế trước khi tiến hành phản ứng mPCR.

4. Thời hạn bảo quản và độ ổn định của các primer và hóa chất là bao lâu?

Hỗn hợp mồi sau khi hoàn nguyên ở nồng độ $10,\mu\text{M}$ trong đệm TE 1X bảo quản tại $-20^\circ\text{C}$ có độ ổn định tối thiểu 12 tháng (tránh rã đông lặp lại quá 5 lần). DreamTaq Green Master Mix 2X bảo quản tại $-20^\circ\text{C}$ có hạn sử dụng theo khuyến cáo nhà sản xuất (thường là 2 năm).

5. Chi phí đầu tư ban đầu và thời gian thu hồi vốn (ROI) cho một trạm kiểm nghiệm?

Tổng chi phí thiết bị cơ bản ước tính khoảng 80 – 120 triệu VNĐ. Với năng lực xét nghiệm 500 mẫu/tháng cho các hiệp hội yến địa phương với mức giá dịch vụ 150.000 VNĐ/mẫu, thời gian thu hồi toàn bộ chi phí đầu tư thiết bị và hóa chất chỉ từ 3 – 5 tháng.

---

Kết luận

Đồ án tốt nghiệp của tác giả Trần Thị Thanh Trang (Đại học Nông Lâm TP.HCM, hướng dẫn bởi TS. Đinh Xuân Phát) đã hoàn thành xuất sắc việc xây dựng và chuẩn hóa quy trình Multiplex-PCR phát hiện vi khuẩn atypical EPEC trong môi trường nhà nuôi chim yến:

• Xác lập thành công bộ thông số tối ưu: Nhiệt độ bắt cặp $60^\circ\text{C}$, tỷ lệ nồng độ mồi escV : eae = 1 : 2 ($0.2,\mu\text{M} : 0.4,\mu\text{M}$), giới hạn phát hiện nhạy bén đạt $10^{-5}\text{ ng/\mu L}$.
• Báo cáo phát hiện tỷ lệ lưu hành thực tế của aEPEC là 21.11% (19/90 mẫu) tại khu vực Đông Nam Bộ thông qua sự hiện diện của gen chỉ thị escV.
• Đóng góp một giải pháp chẩn đoán phân tử có tính khả thi cao, chi phí hợp lý, phục vụ đắc lực cho công tác kiểm soát dịch bệnh và nâng cao năng lực cạnh tranh xuất khẩu cho ngành yến sào Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY - HO CHI MINH CITY FACULTY OF BIOLOGICAL SCIENCES IDENTIFICATION OF ATYPICAL EPEC IN SWIFTLET HOUSES ENVIRONMENT BY MULTIPLEX-PCR DETECTING eae AND escV GENES Major : BIOTECHNOLOGY Student : TRAN THI THANH TRANG Student code : 18126189 Academic year : 2018 - 2022 Thu Duc City, 08/2023 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY - HO CHI MINH CITY FACULTY OF BIOLOGICAL SCIENCES GRADUATION THESIS IDENTIFICATION OF ATYPICAL EPEC IN SWIFTLET HOUSES ENVIRONMENT BY MULTIPLEX-PCR DETECTING eae AND escV GENES Advisor Student Dr. DINH XUAN PHAT TRAN THI THANH TRANG Thu Duc City, 08/2023 ACKNOWLEDGEMENTS I would like to convey my heartfelt appreciation to the boards of Nong Lam University Ho Chi Minh City and the Faculty of Biological Sciences for creating the best conditions for me to complete this study. I am truly grateful to my thesis advisor, Dr. Dinh Xuan Phat, who patiently educated and helped me throughout the process.

It would have been difficult to complete the studies without the assistance of everyone who has stood by me during these trying times. And for that, I'd want to express my gratitudeto Ms. Nguyen Thi Mi Mi, Mr. Le Thanh Binh, Mr.

Hoang Gia Lam, Ms. Do Thi Trinh, Ms. Tran Ngoc Thao Nguyen, and other members of Gene Technology Laboratory BIO313. Last but not least, I want to thank my family for providing me with the strength to conquer the obstacles along the route.

You are the reason I have gotten this far, and I promise to work harder to succeed and make you proud. WARRANTY CONFIRMATION My name is Tran Thi Thanh Trang — 18126189, class DHI8SHD, Faculty of Biological Sciences, Nong Lam University. I committee the research performed by me. This study was a part of the research “Investigation of potentially pathogenic Escherichia coli, Salmonella and Clostridium perfringens based on virulence genes in the environment of swiftlet houses in Southern Vietnam”.

All the data and information in this research are totally honest and objective. I fully accept the responsibility for any falsity in the data utilized for this study. Ho Chi Minh City, August 2023 The committed writer l ABSTRACT Products derived from swiftlet are playing an important role in human health, but they also contain many disease risks. Swallow droppings contain many pathogens including E.

coli, especially atypical EPEC (aEPEC), a Gram-negative bactertum capable of causing acute diarrhea in humans. Therefore, detecting the presence of this bacterium is essential to assess the degree of pathogenicity. This research was performed to survey the presence of Enteropathogenic È. coli (EPEC) in swiftlet houses in three provinces of Southern Vietnam by using the multiplex - PCR technique.

To make the research objective apparent, the multiplex - PCR procedure was optimized with the following annealing temperature, primer concentration, the limit of detection, and primer specificity and application of established multiplex - PCR procedure to investigate the aEPEC presence in 90 samples. After optimizing, a total of 90 field samples including feces and swiftlet surface swabs were collected from swiftlet houses in Dong Nai, Binh Duong, and Ho Chi Minh City. The result was achieved as follows initial denaturation at 95°C for 7 mins, 35 cycles of amplification with the denaturation at 95°C for 30 seconds, the optimal annealing temperature for operating the multiplex - PCR was 60°C, then extension at 72°C for 45 seconds, and the final extension step 72°C for 7 mins. the optimal ratio of concentration between escV and eae gene was 1:2(0.

The limit of detection for multiplex - PCR was 10 ng/L. Applying the optimal procedure, 90 samples were obtained 19/90 positive with escV gene including 6 for swiftlet surface swabs and 13 for feces samples. No samples were positive with eae gene. The result has successfully detected atypical EPEC in the swiftlet house by the expression of the escV gene.

With a ratio of 19/90, EPEC is one of the most highly detected pathogens at swiftlet houses. However, it is necessary to have more different types of EPEC in the different locations and conditions for the result validation. Keywords: Swiftlet, Enteropathogenic FE. co/i (EPEC), multiplex PCR.

ill TÓM TẮT Nhận biết sự hiện diện của atypical Enteropathogenic E. coli (AEPEC) trong môi trường nhà nuôi chim yến bằng kỹ thuật multiplex-PCR thông qua sự phát hiện gen eae và escV. Sản phẩm có nguồn gốc từ chim Yến đang đóng vai trò quan trọng đối với sức khỏe con người, tuy nhiên nó cũng chứa nhiều rủi ro về dịch bệnh. Phân chim yến có chứa nhiều tác nhân gây bệnh trong đó có È.

coli đặc biệt là atypical EPEC (aEPEC), một loại vi khuẩn Gram âm có khả năng gây tiêu chảy cấp ở người. Do đó, việc phát hiện sự hiện diện của vi khuẩn này là điều cần thiết để đánh giác mức độ gây bệnh. Nghiên cứu này được thực hiện với mục đích cung cấp thông tin khảo sat về sự hiện diện của atypical Enteropathogenic E. coli trong môi trường nhà yến ở ba tỉnh miền Nam của Việt Nam bằng phương pháp multiplex - PCR.

Dé làm rõ mục tiêu của dé tai, quy trình kỹ thuật phương pháp PCR được tôi ưu hóa về nhiệt độ bắt cap, nồng độ đoạn môi, giới hạn phát hiện và độ đặc hiệu của đoạn mồi và áp dụng phátt hiện quy trình multiplex - PCR đã xây dựng dé phát hiện aEPEC trong 90 mẫu thực địa. Kết quả cho thấy, trong toàn bộ 90 mẫu thực địa bao gồm mẫu phân chim và mẫu phết bề mặt tổ yên được thu thập tại nhà yến ở các tỉnh thành như Dong Nai, Binh Duong va Thanh phố Hồ Chi Minh. Kết quả đạt được bao gồm, nhiệt độ bắt cặp là 60°C, tỉ lệ tối ưu cho nồng độ giữa 2 gene escV va eae là 1:2 (tương ứng với 0,2 uM: 0,4 nM), giới hạn phát hiện sự hiện diện EPEC ở nồng độ 10° ng/uL. Áp dụng quy trình tối ưu này 90 mẫu thực địa đã được khảo sát với kết qua cho ra 19/90 mẫu dương tính với gene escV bao gồm 6 mẫu phết bề mặt tô yến và 13 mẫu phân chim, không có trường hợp dương tính với gene eae.

Kết qua đã cho thay quy trình đã được áp dụng thành công dé phát hiện atypical EPEC trong môi trường nhà yến bằng sự biểu hiện của gene escV. Mặc dù vậy, để xác thực về kết quả và độ hiệu quả của quy trình trong nghiên cứu này cần đa dạng về chủng loại EPEC để cho ra một quy trình hoàn thiện nhằm áp dụng hiệu quả vào việc phát hiện EPEC ở cộng đồng. Từ khóa: Chim yến, Enteropathogenic E. coli (EPEC), multiplex PCR.

IV TABLE OF CONTENT Page ACKNOWLEDGEMENTS ben triinntiv0BEDG011380138465500380451381539540385849123913943100386100903838 i WARRANTY CONFTRMA TION.-- Ặ c2 HH H1 0 re ii ABS TRAG DT sasssssggn86900966580:8683655058430309031513384981483236)3E81E2. iv TABEBIOR CONTENT g›sssgs5146sg108:8601620gtugkt5XEqdlSASiduitbalftlpiSssiieguggduiltcatRoiasastsgbaussayŠ V LIST OF ABBREVIATIONS ssseseesevosscesrsvesesesvensverneennraw ener eremenaswenaw eevee: Vil I1)1ig 93000910 51055-70Ẹ77®e hố ốẽố ốc. Vill LIST OF BIGURES .:cssssasseasmsenucanmeaisameeenas seme nem 1X (957. | Lal Introduction passststbaisioniEE 0555 D8iNGISGNGĐSGGSGESS80380SGGQSISSRSSSSGSISSDERGS3vG635I.

OD] OCU 6 ererscrercer eeerarenreeer emt enter eee ES 1 Mh Bois NE OTA cst i tt a Sia i let Z GHAPTER. LITERATURE, REN IE W secssoasensesuneasunsesunavenasweunssarseunnaaanswansswnsdsvasnenetsonvens 3 2.GHSREGGI EEE ETE 3 2d EPEC GIIGEHTOG ĐT srececccesrse center ween eur ecw eee nee eer eee 4 2. Clinical aspects of EPEC infection in children. EPEC MIỆU |GHGE SOTO sccscscnsnrcnreroumenneness annesenneneunnscsoumaue ne meus ueerwemenmenensremacunenes 6 2.

Identification method for Enteropathogenic FE. Prineiplesiof PCR ácsssnnsetiseiatitnE1111403355018100515914385555G4GLESEGSS4E1448539385005384014000141308588 8 2 Dole QUYD G5: OL PC Riccacwaninnrsss ass Sarees eee 8 2. Application of PCR techn1que.- ---- -- + 323221 *32*+*E+EE+zEErEerrsrerrrrrrrrrrrrerree 9 CHAPTER, 3. MATERIALS AND METHOD sccsssssescassenernsseuamneacnesversanenneanssnenrersanees 10 Sul.

Time and: location of the study set S40 ES0S 090810E)92898B0853681604G. Materials and: chemicals ssssscsssssssssasss21556664660153533853553855548055511383585395038518335560434850836 10 2 el OS Esco 12) | eee ene ee eee ee 10 3. Isolation of Escherichia coli from swiftlet house environment samples. Optimization of annealing temperature for single PCR,.

Optimization of the annealing temperature for the multiplex-PCR. Optimization of the primer CORCeTTAfIOII. Optimization of the primer specificity. Determination of the limit of deteCfIOT.

Application of the optimal multiplex-PCR procedure for field samples. RESULTS AND DISCUSSION. Optimization of the annealing tenperafUTG. Optimization of the annealing temperature for single PCR.

Optimization of the annealing temperature for the multiplex — PCR. Optimization of the primer cOnC€TIfTAtIOII. Examination of primer specificity 111. Determination of the limit of det€CfIOTI.

Apply the optimal procedure to detect the presence of EPEC in 90 field samples 21 4.6; DISCUSS reece seeerrceeeruecnernee ee 80188 22 CHAPTER 5. CONCLUSION AND RECOMMENDATION.------ 25 IRE S00) 1c LTSLOTÌ eee ee ee eee ee eee 25 5. 26 VI OF ABBREVIATIONS AE Attaching and effecing aEPEC atypical Enteropathogenic Escherichia coli DAEC Diffusely adherent Escherichia coli DNA Deoxyribonucleic acid EAEC Enteroaggregative Escherichia coli EIEC Enteromvasive Escherichia coli EPEC Enterropathogenic Escherichia coli ETEC Enterotoxigenic F. coli LoD Limit of detection PCR Polymerase Chain Reaction pEAF EPEC adherence factor plasmid pEAF plasmid Escherichia coli adherence factor STEC Shiga toxin—producing Escherichia coli Annealing temperature typical Enteropathogenic Escherichia coli Melting temperature Vil LIST OF TABLES Table 4.

Replication of multiplex-PCR determining detection limit Table 4. The summation of atypical EPEC detection surveillance in samples. vill LIST OF FIGURES Figure 4. PCR products for optimizing annealing temperature for single PCR.

Electrophoresis results of mPCR of different annealing temperatures. Electrophoresis result of escV-eae primer concentration ratio valuation. Examination of primer specific by multiplex PCTR. Determination of the limit of the defecfIon.

Electrophoresis results of PCR products of field samples 1X CHAPTER 1. Introduction The Department of Livestock Production of Vietnam claims that Southeast Asia is the only region that can support the development of swiftlets. As a result, Vietnam is stressing its significance more and more. Swiftlet farming has grown to be a profitable industry in Vietnam since 2004.

Swiftlets have a very high monetary worth, ranging from 1500 to 2000 USD per kilogram. Companies mostly export swiftlet nest products, generating between 100 and 125 million USD annually. The swiftlet nest farming industry is constantly growing and improving because of the swiftlet nest's potential and features for business and production. 42 out of 63 provinces have only recently begun participating in Swift's nest farming (Hoan, 2018).

However, there are still several issues with the management of veterinary sanitary conditions and disease surveillance. Swiftlets are classified as wild birds that congregate in huge flocks and live at high altitudes, making it harder for them to maintain disease control than other types of animals. Swiftlet feces includes a variety of bacterin-containing EPEC (Leong ef a/. EPEC is the second most common cause of inpatient diarrhea after rotavirus (Pfeiffer et al.

Because of the species' behavior of immigration and emigration, swiftlet is easy to release pathogens (Jourdain ef al. Therefore, Rapid diagnosis of pathogenic È. coli strains is an increasingly important issue to address in public health (Botkin ef a/. Constructing the procedure to detect the presence of EPEC is necessary for the prevention of pathogen spread.

Objective Successfully constructed a procedure to detect atypical EPEC using multiplex - PCR technique via escV and eae genes. Application of the procedure to check the appearance of bacteria in field samples collected from swiftlet houses. Contents Content 1: Optimization of the multiplex PCR procedure for detection of aEPEC Optimization of the annealing temperature for the multiplex PCR Optimization of the primer concentration for the multiplex PCR Examination of primer specificity Determination of the limit of detection for the multiplex PCR Content 2: Utilization of the multiplex PCR to determine the presence of aEPEC for 90 field samples from swiftlet houses’ samples. Introduction Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) is a gram-negative bacterial pathogen that adheres to human intestinal epithelial cells, resulting in watery, persistent diarrhea (Goosney ef al.