Đánh Giá Hiệu Quả PCR và Real-time PCR trong Phát Hiện ASFV trên Mẫu Thực Địa

Luận văn tốt nghiệp kỹ thuật nghiên cứu tốt nghiệp công nghệ sinh học đánh giá hiệu quả phát hiện vi rút gây bệnh dịch tả heo châu phi asfv, điều tra thực trạng, phân tích số

• Tác giả: Phạm Nguyễn Ngọc Châu
• Người hướng dẫn: TS. Đinh Xuân Phát
• Trường học: Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Đánh Giá Hiệu Quả Phát Hiện Vi Rút Gây Bệnh Dịch Tả Heo Châu Phi (Asfv) Của Máy Real-Time Pcr Q16 Và Pcr Truyền Thống Trên Các Mẫu Thực Địa
• Loại tài liệu: Khóa Luận Tốt Nghiệp
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Tp. Thủ Đức

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN
• TÓM TẮT
• ABSTRACT
• DANH SÁCH CAC CHỮ VIET TAT
• DANH SÁCH CAC BANG
• DANH SÁCH CÁC HÌNH
• 1. CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Mục tiêu đề tài
• 2. CHƯƠNG 2: TONG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Một số đặc điểm nghiên cứu về ASEV
• 2.2. Cấu trúc của hạt vi rút ASF
• 2.3. Khả năng đề kháng. Con đường lây bệnh. Đặc điểm dich tễ
• 2.4. Bétnh nh an. Chan đoán phòng thi nghiệm
• 2.5. Chan đoán không
• 2.6. Phong và kiểm soát dich. Tình hình nghiên cứu trên thé giới
• 2.7. Tình hình nghiên cứu tại Việt ÏNam
• 3. CHƯƠNG 3: VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 3.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 3.2. Mẫu
• 3.3. Hoa Chat
• 3.4. Thiết bị và dụng CU. Phường pháp nghiên GỨU
• 3.5. Lay wich DMA từ mẫu thự ÌM
• 3.6. Phản ứng PCR truyền thống
• 3.7. Phan ứng real-time PCR bằng máy real-time PCR ql6
• 3.8. Giải trình tự mẫu DNA
• 3.9. Xử lí số liệu
• 3.10. Sự đồng thuận kết quả đánh giá của hai phương pháp
• 3.11. Ý nghĩa thống kê của số liệu nghiên cứu
• 4. CHƯƠNG 4: KET QUA VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Đánh giá hiệu quả phát hiện vi rút ASF của phương pháp di kèm với máy
• 4.2. Tỉ lệ phát hiện vi rút ASF trong mẫu thu thập ở các tỉnh thành
• 4.3. Tỉ lệ phát hiện vi rút ASF trong mẫu thu thập theo độ tuôi
• 4.4. Sự tương quan kết quả giữa phương pháp đi kèm với máy real-time PCR
• 4.5. Xác định kiểu gen đang lưu hành trong mẫu thực địa
• 5. CHƯƠNG 5: KET LUẬN VA DE NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan so sánh PCR Real time PCR phát hiện Dịch tả lợn

Bệnh Dịch tả lợn Châu Phi (DTLCP), gây ra bởi virus Dịch tả lợn Châu Phi (ASFV), là một trong những dịch bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất đối với ngành chăn nuôi heo toàn cầu. Với tỷ lệ tử vong có thể lên đến 100%, việc chẩn đoán DTLCP một cách nhanh chóng và chính xác đóng vai trò then chốt trong công tác kiểm soát và dập dịch. Hiện nay, các phương pháp sinh học phân tử đang là lựa chọn hàng đầu, trong đó nổi bật là xét nghiệm PCR (Polymerase Chain Reaction) và kỹ thuật Real-time PCR (còn gọi là qPCR). Mặc dù cùng dựa trên nguyên lý khuếch đại DNA của virus, hai kỹ thuật này có những khác biệt cơ bản về cơ chế, quy trình, và khả năng phân tích kết quả. Việc so sánh PCR & Real-time PCR phát hiện virus Dịch tả lợn không chỉ giúp các phòng thí nghiệm lựa chọn phương pháp phù hợp mà còn cung cấp cái nhìn sâu sắc về ưu, nhược điểm của từng kỹ thuật trong bối cảnh thực tiễn. Bài viết này sẽ đi sâu vào việc phân tích, đối chiếu hiệu quả của hai phương pháp dựa trên các nghiên cứu khoa học, đặc biệt là kết quả từ các mẫu thực địa tại Việt Nam, nhằm đưa ra những khuyến nghị xác đáng cho công tác chẩn đoán trong thú y.

1.1. Tầm quan trọng của việc chẩn đoán sớm virus ASFV

Virus Dịch tả lợn Châu Phi (ASFV) có sức đề kháng cao và khả năng lây lan nhanh chóng qua tiếp xúc trực tiếp hoặc gián tiếp. Việc phát hiện sớm mầm bệnh là yếu tố quyết định để ngăn chặn sự bùng phát trên diện rộng. Chẩn đoán sớm giúp khoanh vùng ổ dịch, tiêu hủy kịp thời đàn heo nhiễm bệnh và áp dụng các biện pháp an toàn sinh học nghiêm ngặt. Thiếu các công cụ chẩn đoán nhạy và nhanh, virus có thể âm thầm lây lan, gây ra thiệt hại kinh tế khổng lồ. Do đó, việc đầu tư và áp dụng các kỹ thuật tiên tiến như sinh học phân tử là yêu cầu cấp thiết, giúp giảm thiểu thời gian chờ đợi kết quả so với các phương pháp truyền thống như phân lập virus, từ đó đưa ra hành động quyết liệt và hiệu quả hơn.

1.2. Giới thiệu hai phương pháp xét nghiệm PCR phổ biến

Trong lĩnh vực sinh học phân tử, hai kỹ thuật dựa trên phản ứng chuỗi polymerase được sử dụng rộng rãi là PCR truyền thống (Conventional PCR) và Real-time PCR (qPCR). PCR truyền thống khuếch đại một đoạn DNA mục tiêu và phát hiện sản phẩm cuối cùng thông qua điện di trên gel agarose. Phương pháp này mang tính định tính, xác nhận sự có mặt hoặc vắng mặt của virus. Ngược lại, kỹ thuật Real-time PCR theo dõi quá trình khuếch đại DNA trong thời gian thực nhờ tín hiệu huỳnh quang. Điều này không chỉ cho phép phát hiện virus mà còn có khả năng định lượng virus trong mẫu bệnh phẩm, cung cấp thông tin giá trị về tải lượng mầm bệnh.

II. Phương pháp PCR truyền thống phát hiện virus dịch tả lợn

PCR truyền thống là phương pháp nền tảng trong sinh học phân tử, được ứng dụng rộng rãi để phát hiện sự hiện diện của DNA ASFV trong các mẫu bệnh phẩm như máu, mô lách từ heo nghi nhiễm. Nguyên lý của kỹ thuật này là sử dụng enzyme Taq polymerase để khuếch đại một đoạn gen đặc hiệu của virus qua nhiều chu kỳ nhiệt. Cụ thể, các cặp mồi (primer) được thiết kế để bắt cặp chuyên biệt với vùng gen mục tiêu, thường là gen p72 của virus Dịch tả lợn Châu Phi. Sau khi phản ứng kết thúc, sản phẩm khuếch đại được phân tích bằng phương pháp điện di trên gel agarose. Sự xuất hiện của một vạch DNA có kích thước đúng như dự kiến trên gel sẽ khẳng định mẫu dương tính với ASFV. Mặc dù có chi phí tương đối thấp và dễ triển khai, PCR truyền thống vẫn tồn tại những nhược điểm cố hữu. Quá trình phân tích sau phản ứng làm tăng nguy cơ ngoại nhiễm chéo, có thể dẫn đến kết quả dương tính giả. Thêm vào đó, độ nhạy của phương pháp này thường thấp hơn so với các kỹ thuật cải tiến, và nó chỉ cho kết quả định tính, không thể cung cấp thông tin về tải lượng virus trong mẫu.

2.1. Nguyên lý cơ bản của phản ứng chuỗi polymerase PCR

Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) là một chu trình gồm ba bước lặp lại: biến tính, bắt cặp và kéo dài. Ở bước biến tính (khoảng 94-96°C), chuỗi DNA xoắn kép của virus sẽ tách thành hai sợi đơn. Tiếp theo, ở bước bắt cặp (55-65°C), các đoạn mồi ngắn sẽ liên kết đặc hiệu vào vị trí tương ứng trên mỗi sợi DNA khuôn. Cuối cùng, ở bước kéo dài (72°C), enzyme Taq polymerase tổng hợp sợi DNA mới từ đầu mồi, tạo ra bản sao của đoạn gen mục tiêu. Chu trình này được lặp lại 30-40 lần, tạo ra hàng tỷ bản sao DNA từ một vài bản sao ban đầu, đủ để có thể phát hiện được.

2.2. Quy trình và hạn chế của điện di trên gel agarose

Sau khi xét nghiệm PCR hoàn tất, sản phẩm được phân tích bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose. Mẫu DNA được nạp vào giếng trên bản gel và đặt trong một điện trường. Do DNA tích điện âm, nó sẽ di chuyển về phía cực dương. Các đoạn DNA nhỏ hơn sẽ di chuyển nhanh hơn qua mạng lưới agarose so với các đoạn lớn hơn. Bằng cách so sánh với thang DNA chuẩn, kích thước của sản phẩm PCR được xác định. Tuy nhiên, quy trình này tốn thời gian, yêu cầu thao tác thủ công sau phản ứng (mở ống nghiệm), làm tăng đáng kể nguy cơ lây nhiễm sản phẩm PCR vào môi trường và các mẫu khác, gây ra kết quả dương tính giả. Độ nhạy phát hiện của thuốc nhuộm trên gel cũng có giới hạn, khiến phương pháp khó phát hiện các mẫu có nồng độ virus thấp.

III. Kỹ thuật Real time PCR qPCR tối ưu chẩn đoán DTLCP

Kỹ thuật Real-time PCR (qPCR) là một bước tiến vượt bậc so với PCR truyền thống, đặc biệt trong việc chẩn đoán DTLCP. Phương pháp này cho phép theo dõi và định lượng sự tích lũy sản phẩm DNA trong từng chu kỳ của phản ứng, dựa vào tín hiệu phát quang từ các thuốc nhuộm hoặc mẫu dò (probe) đặc hiệu. Các hệ thống hóa chất phổ biến bao gồm SYBR Green và TaqMan. Ưu điểm lớn nhất của qPCR là quy trình khép kín, toàn bộ quá trình từ khuếch đại đến phát hiện diễn ra trong một ống nghiệm duy nhất, loại bỏ hoàn toàn bước điện di và giảm thiểu nguy cơ ngoại nhiễm. Điều này làm tăng độ tin cậy của kết quả. Hơn nữa, Real-time PCR có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn đáng kể, có khả năng phát hiện lượng DNA virus rất nhỏ mà PCR truyền thống có thể bỏ sót. Khả năng định lượng virus thông qua giá trị Ct cũng là một lợi thế quan trọng, giúp đánh giá mức độ nhiễm bệnh và hiệu quả điều trị (nếu có vắc-xin), trở thành công cụ không thể thiếu cho công tác phát hiện sớm mầm bệnh.

3.1. Cơ chế hoạt động vượt trội của kỹ thuật Real time PCR

Cơ chế của kỹ thuật Real-time PCR dựa trên việc đo lường tín hiệu huỳnh quang tỷ lệ thuận với lượng sản phẩm DNA được tạo ra. Với công nghệ TaqMan, một mẫu dò (probe) đặc hiệu mang chất phát quang và chất dập quang được sử dụng. Khi enzyme Taq polymerase tổng hợp sợi DNA mới, nó sẽ phân cắt mẫu dò, giải phóng chất phát quang khỏi chất dập quang, tạo ra tín hiệu. Tín hiệu này được máy ghi nhận sau mỗi chu kỳ. Quy trình khép kín này không chỉ nhanh hơn mà còn đảm bảo an toàn sinh học cao hơn tại phòng thí nghiệm, giảm thiểu rủi ro cho kỹ thuật viên và môi trường.

3.2. Ý nghĩa của giá trị Ct trong việc định lượng virus

Giá trị Ct (Cycle threshold) hay ngưỡng chu kỳ là số chu kỳ mà tại đó tín hiệu huỳnh quang của phản ứng vượt qua một ngưỡng nền có thể phát hiện được. Giá trị này tỷ lệ nghịch với nồng độ DNA ban đầu trong mẫu. Cụ thể, giá trị Ct càng thấp, nồng độ virus trong mẫu bệnh phẩm càng cao, và ngược lại. Việc xác định được giá trị Ct cho phép định lượng virus một cách tương đối hoặc tuyệt đối (khi so sánh với đường chuẩn), cung cấp thông tin quý giá về tải lượng virus, giúp theo dõi diễn biến bệnh và đánh giá nguy cơ lây nhiễm trong đàn. Đây là một đặc điểm mà PCR truyền thống hoàn toàn không thể thực hiện được.

IV. Đánh giá hiệu quả PCR Real time PCR qua nghiên cứu thực địa

Để có cái nhìn khách quan về hiệu quả của hai phương pháp, việc phân tích dữ liệu từ các nghiên cứu thực địa là vô cùng cần thiết. Một nghiên cứu tiêu biểu được thực hiện bởi Phạm Nguyễn Ngọc Châu tại Đại học Nông Lâm TP.HCM (2023) đã so sánh PCR & Real-time PCR phát hiện virus Dịch tả lợn trên 41 mẫu bệnh phẩm thu thập từ Đồng Nai, Bình Dương và Tây Ninh. Kết quả tổng thể cho thấy một sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). Cụ thể, kỹ thuật Real-time PCR (sử dụng máy q16) phát hiện được 38/41 mẫu dương tính (chiếm 92.7%), trong khi PCR truyền thống chỉ phát hiện được 32/41 mẫu (chiếm 78.0%). Sự chênh lệch này đặc biệt rõ rệt tại tỉnh Đồng Nai, nơi Real-time PCR cho tỷ lệ dương tính là 92.3% so với 69.2% của PCR truyền thống. Những con số này chứng minh độ nhạy vượt trội của qPCR trong việc phát hiện các ca nhiễm có tải lượng virus thấp, những trường hợp mà PCR truyền thống có thể cho kết quả âm tính giả, gây nguy cơ bỏ sót mầm bệnh trong cộng đồng.

4.1. Phân tích độ nhạy và độ đặc hiệu của hai phương pháp

Nghiên cứu trên đã chỉ ra tổ hợp kết quả qPCR(+)/PCR(-) chiếm tới 14.63% (6/41 mẫu). Điều này có nghĩa là có 6 mẫu được Real-time PCR xác định là dương tính nhưng PCR truyền thống lại cho kết quả âm tính. Các mẫu này thường có giá trị Ct cao (Ct > 34), tương ứng với nồng độ virus rất thấp. Kết quả này khẳng định độ nhạy của qPCR cao hơn, có khả năng phát hiện dấu vết DNA của ASFV mà phương pháp điện di không thể nhận diện. Về độ đặc hiệu, cả hai phương pháp đều sử dụng mồi được thiết kế chuyên biệt cho gen p72 của ASFV, do đó đều có độ đặc hiệu cao. Tuy nhiên, quy trình khép kín của qPCR giảm thiểu nguy cơ dương tính giả do ngoại nhiễm, giúp tăng độ tin cậy tổng thể của kết quả.

4.2. Kết quả tỷ lệ phát hiện ASFV chênh lệch đáng kể

Sự chênh lệch về tỷ lệ phát hiện ASFV không chỉ thể hiện qua tổng số mẫu mà còn qua từng nhóm đối tượng. Ở nhóm heo nái, qPCR phát hiện 93.1% mẫu dương tính so với 75.86% của PCR truyền thống. Tương tự ở nhóm heo thịt, tỷ lệ là 91.67% so với 83.33%. Sự khác biệt này cho thấy kỹ thuật Real-time PCR là công cụ mạnh mẽ hơn để sàng lọc và giám sát dịch bệnh trên quy mô lớn, bất kể độ tuổi của vật nuôi. Việc phát hiện được nhiều ca dương tính hơn giúp công tác kiểm soát dịch bệnh được thực hiện triệt để, giảm thiểu nguy cơ mầm bệnh tồn tại và tái bùng phát trong đàn.

4.3. Xác định kiểu gen virus Dịch tả lợn Châu Phi đang lưu hành

Ngoài việc phát hiện, sản phẩm PCR còn được sử dụng để giải trình tự gen nhằm xác định kiểu gen của virus Dịch tả lợn Châu Phi đang lưu hành. Trong nghiên cứu đã trích dẫn, các mẫu dương tính sau khi giải trình tự đoạn gen p72 đều được xác định thuộc kiểu gen II. Đây là thông tin dịch tễ học cực kỳ quan trọng, giúp các nhà khoa học hiểu rõ hơn về nguồn gốc và con đường lây lan của dịch bệnh tại Việt Nam, đồng thời cung cấp dữ liệu nền tảng cho việc nghiên cứu và phát triển vắc-xin đặc hiệu trong tương lai.

V. Kết luận Phương pháp tối ưu phát hiện virus dịch tả lợn

Tổng hợp từ các phân tích về nguyên lý, quy trình và dữ liệu thực chứng, có thể khẳng định rằng kỹ thuật Real-time PCR là phương pháp tối ưu hơn trong việc phát hiện virus Dịch tả lợn. Mặc dù có chi phí đầu tư ban đầu cao hơn, những ưu điểm mà qPCR mang lại là không thể phủ nhận. Đó là độ nhạy và độ đặc hiệu vượt trội, khả năng định lượng virus, thời gian cho kết quả nhanh chóng và quy trình khép kín giúp giảm thiểu tối đa nguy cơ ngoại nhiễm. Việc so sánh PCR & Real-time PCR phát hiện virus Dịch tả lợn đã cho thấy, lựa chọn qPCR giúp tăng cường hiệu quả giám sát dịch tễ, phát hiện sớm mầm bệnh và đưa ra các quyết định can thiệp chính xác, kịp thời. Đây là công cụ không thể thiếu trong chiến lược quốc gia nhằm kiểm soát và tiến tới thanh toán bệnh Dịch tả lợn Châu Phi, bảo vệ ngành chăn nuôi heo một cách bền vững. Việc chuẩn hóa và mở rộng áp dụng kỹ thuật này tại các phòng thí nghiệm địa phương là một bước đi chiến lược và cần thiết.

5.1. Real time PCR Lựa chọn hàng đầu trong chẩn đoán thú y

Với những ưu điểm đã được chứng minh, Real-time PCR xứng đáng là lựa chọn hàng đầu cho công tác chẩn đoán trong thú y hiện đại, không chỉ đối với ASFV mà còn với nhiều tác nhân gây bệnh khác. Khả năng cho kết quả nhanh và định lượng giúp các bác sĩ thú y và nhà quản lý đưa ra quyết định nhanh chóng, từ việc cách ly, điều trị đến tiêu hủy, góp phần hạn chế thiệt hại kinh tế. Sự phát triển của các bộ kit thương mại và các hệ thống máy nhỏ gọn, di động như q16 cũng làm cho kỹ thuật này ngày càng dễ tiếp cận hơn.

5.2. Hướng phát triển cho công tác kiểm soát dịch bệnh

Trong tương lai, việc kết hợp kỹ thuật Real-time PCR với các công nghệ mới như giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) sẽ mở ra hướng đi mới trong việc giám sát sự biến đổi của virus, phát hiện các chủng mới và đánh giá hiệu quả của vắc-xin. Đồng thời, cần tiếp tục nghiên cứu để tối ưu hóa quy trình, giảm chi phí xét nghiệm PCR, và đào tạo nhân lực có trình độ cao để vận hành hiệu quả các hệ thống chẩn đoán hiện đại, xây dựng một mạng lưới phòng chống dịch bệnh chủ động và vững chắc trên toàn quốc.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Việt Nam là một quốc gia đang phát triển, có thé mạnh về nông nghiệp, là ngành kinh tế quan trọng của nước ta. Năm 2009, giá trị sản lượng của nông nghiệp đạt 71,473 nghìn tỷ đồng, tăng 1,32% so với năm 2008 và chiếm 13,85% tổng sản phẩm quốc nội. Trong đó, ngành chăn nuôi là ngành đóng vai trò quan trọng, góp phần đáng kể trong cơ cấu nông nghiệp nước ta. Tuy nhiên, ngành chăn nuôi hiện nay đang gặp phải nhiều thách thức, điều này gây ảnh hưởng lớn đến người chăn nuôi nói riêng cũng như sự phát triển bền vững của toàn ngành nói chung và mảng chăn nuôi heo là một trong những lĩnh vực đáng chú ý.

Trong khoảng thời gian từ năm 2018 đến 2019, ngành chăn nuôi thé giới đã phải đối mặt với một dịch bệnh rất nghiêm trọng mang tên “dịch tả heo châu Phi” do vi rút địch tả heo châu Phi (ASFV) gây ra. Đây là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm với tỉ lệ nhiễm bệnh và tỉ lệ tử vong rất cao, đa phần heo nhiễm bệnh sẽ chết và tỉ lệ tử vong được ghi nhận lên đến 100% (Blome và ctv, 2020). Vào ngày 19/02/2019, Chi cục Thú y Việt Nam ghi nhận ô dịch đầu tiên tại Hưng Yên và Thái Bình đồng thời tại các khu vực khác của châu Á như Hàn Quốc, Indonesia, Philippine. cũng ghi nhận nhiều trường hợp nhiễm ASEV trước đó.

Theo tổ chức thú y thế giới (OIE) tinh từ đầu năm 2017 đến ngày 18/02/2019, thế giới đã có 20 quốc gia báo cáo xuất hiện dịch tả heo châu Phi (DTHCP), trong đó Trung Quốc là quốc gia chịu thiệt hại nặng nề nhất. Kiểu gen I và II được xác định đang chiếm ưu thé tại nhiều quốc gia xuất hiện DTHCP cho thấy tỉ lệ tử vong cao hơn so với các kiểu gen còn lại, trong đó kiểu gen II được ghi nhận là kiểu gen phô biến ở các nước châu Âu và chau A. Dịch tả heo châu Phi đã khiến nhiều nước buộc phải tiêu hủy số lượng heo lớn, ước tính tổng số heo buộc phải tiêu hủy trên toàn thế giới lên đến hàng trăm triệu con. Theo thống kê của OIE, tổng đàn heo của thế giới vào tháng 1 năm 2020 đạt khoảng 678 triệu con, giảm gần 12% so với cùng kỳ năm 2019 với tổng đàn heo ước tinh khoảng 768 triệu con.

Trung Quốc là nước chịu thiệt hại nghiêm trọng nhất trong đợt bùng phát dịch này. Cũng theo thông tin của OIE, tổng đàn heo của Trung Quốc tháng 1 năm 2020 là 335 triệu con, giảm 53% so với 710 triệu con trước khi có dịch bệnh. Thời gian dé kiểm soát dich tại Trung Quốc là 17 tháng. Tại Việt Nam, vào năm 2021 chi cục Thú y Việt Nam đã báo cáo rằng cả nước đã phải tiễn hành tiêu hủy hơn 5 triệu cá thé tính đến ngày 22/09/2019 dé lại thiệt hại rất lớn cho nền nông nghiệp nước nha, dịch bệnh đã phát sinh tại 47 xã trong 5 tháng đầu năm 2020, cụ thé có 25 xã mới có dịch và 22 xã tái phát dịch.

Như vậy, DTHCP đã lây lan đến nhiều quốc gia trên thế giới, gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi heo thế giới đồng thời ảnh hưởng đáng kế đến chuỗi cung ứng thịt heo toàn cầu. Song song đó, DTHCP còn cho thấy những điểm yếu trong lĩnh vực chăn nuôi thú y, trong công tác phòng, kiểm soát dịch bệnh tại châu Á nói chung và Việt Nam nói riêng trong bối cảnh vắc xin phòng bệnh hiệu quả chưa có. Chính vì thế, việc phát hiện sớm tác nhân gây bệnh này đóng vai trò cấp thiết trong công tác phòng chống bệnh DTHCP. Hiện nay, thị trường có nhiều loại hệ thống real-time PCR nhưng nhược điểm chung tốn kém nhiều chi phí lắp đặt và vận hành.

Với kích thước nhỏ gon, may real-time PCR q16 (Primerdesign Ltd, England) là một thiết bị real-time PCR đi kèm với bộ kit được thiết kế đặc hiệu cho máy, được hiểu là phương pháp real-time PCR đi kèm với máy q16, là một trong những lựa chọn hiệu quả. Đề tài này được thực hiện nhằm đánh giá hiệu quả phát hiện ASFV của phương pháp đi kèm với máy real-time PCR q16 và một quy trình PCR truyền thống trên các mẫu thực địa. Mục tiêu đề tài Đánh giá hiệu qua phát hiện ASFV giữa phương pháp đi kèm với máy real-time PCR q16 và một quy trình PCR truyền thống và xác định kiểu gen lưu hành của ASFV trên mẫu thực địa. Nội dung thực hiện 1.

Đánh giá hiệu qua phát hiện vi rút ASF của phương pháp đi kèm với may real-time PCR q16 và một quy trình PCR truyền thống. Xác định kiêu gen của vi rat ASF đang lưu hành trong mẫu thực địa. TONG QUAN TÀI LIEU 2. Một số đặc điểm nghiên cứu về ASFV 2.

Phần loại học Vi rút dich tả heo Châu Phi (ASFV) được phân loại là loài duy nhất của chi Asfivirus, thuộc họ Asfaviridae (Dixon va ctv, 2005). Vào tháng 7 năm 2019, Uỷ ban quốc tế về phân loại vi rút (ICTV) đã công bố rằng họ Asfaviridae thuộc bộ Asfuvirales, lớp Pokkesviricetes (Alonso và ctv, 2018). Bên cạnh danh pháp chính thức này, một số tranh cãi xoay quanh cách phân loại này đã xếp ASFV vào bộ Megavirales (Andres và ctv, 2020). Cau trúc của hat vi rút ASF Hat vi rút (virion) của ASFV mang thông tin di truyén là một sợi DNA xoắn kép, không đóng vòng, có kích thước từ 170 — 193 kb.

Bộ gen chứa khoảng 150 — 167 khung đọc mở (ORF) với vùng bảo tồn có kích thước khoảng 125 kb và hai đầu biến đổi có kích thước lần lượt là 38 — 48 kb, 13 — 22 kb (Dixon và ctv, 2019). Các trình tự đầu và cuối của bộ gen là các trình tự lặp lại đối xứng đảo ngược có khả năng đóng vòng tạo thành những cấu trúc kẹp tóc (Salas và Andrés, 2013). Bộ gen mã hóa cho nhiều protein khác nhau liên quan đến quá trình lắp ráp, tái bản, sửa chữa DNA (Reis và ctv, 2017). Nhìn chung, cấu trúc của một hat vi rút rất phức tạp có đường kính là 175 — 215 nm, nằm ở trung tâm vùng nhân (nucleoid) là một axit nucleic liên kết với protein (nucleoprotein) có đường kính 70 — 100 nm, một lớp vỏ lõi được bao bọc bởi một lớp màng don lipid, bên ngoài là lớp vỏ capsid đôi được hình thành từ 1892 — 2172 capsomer, ngoài cùng là lớp màng ngoài lipid (envelope) (Alonso và ctv, 2018; Salas va Andrés, 2013) (Hình 1.

Theo Qu va ctv (2022), gen B646L mã hóa cho protein p72, yếu tố lây nhiễm chủ yếu của ASFV và cho phép phân loại các chủng ASFV thành 24 kiểu gen I — XXIV. Có 68 protein cau trúc được xác định có hiện điện trong các hat vi rút có đường kính 200 nm, chiếm 39% khả năng mã hóa của bộ gen, 44 polypeptide liên quan đến đóng gói hạt vi rút và một nửa trong số đó vẫn chưa xác định rõ chức nang (Alejo va ctv, 2018). Hơn 100 protein được xác định có liên quan đến khả năng lây nhiễm ở đại thực bao của heo nhiễm bệnh, trong số đó có ít nhất 50 protein có phản ứng huyết thanh học ở các heo bị nhiễm hoặc đã hồi phục (Sanchez-Vizcaino va Arias, 2012). Outer Envelope Outer Capsid ATIVE 4 Inner Membrane tf Nucleoid Core Shell Inner Capsid Hình 1.

Cấu trúc của hạt vi rat ASFV. Bên trái là hình chụp dưới kính hiển vi điện tử của một hạt vi rút ASFV được cô định hóa học bằng resin; bên phải là hình vé 2D mô phỏng lại cau trúc của hạt vi rút ASFV (Blome và ctv, 2020). Nuôi cấy Vi rút DTHCP xâm nhiễm các tế bào bạch cầu đơn nhân, tế bào bạch cầu trung tính, các tế bào đại thực bao ở tủy xương và trong máu, tế bao thận, tế bào gan (Wilkinson và ctv, 1978; Casal và ctv, 1984; Sierra va ctv, 1987). Vi rút DTHCP được nuôi cấy trên các loại tế bao như tế bao đại thực bào phế nang phối (PAM), tế bao sơ cấp tủy xương (PBMC), Cos | hay Vero (Knudsen và ctv, 1987; Carrascosa và ctv, 1982; Carrascosa va ctv, 2011).

Trước tiên, ta áp dụng quy trình chuẩn bị mẫu nhằm thu nhận tế bào từ heo nhiễm ASFV tùy theo từng loại tế bào, chẳng hạn như tế bào sơ cấp tủy xương (Enjuanes và ctv, 1976), tế bào đại thực bào phế nang phôi (Carrascosa và ctv, 1982). Tiếp theo, ta chọn dòng tế bào mục tiêu cho quá trình nuôi cấy, các dòng tế bào mục tiêu thường được sử dụng như Cos | hay Vero có nguồn gốc từ khi. Kế đến, tế bao sẽ được nuôi cấy trên môi trường phù hợp (phổ biến là môi trường DMEM), sau đó tiến hành lây nhiễm và thu nhận các tế bao nhiễm ASFV đã tăng sinh. Khả năng đề kháng Năm 2019, theo Cục Thú y, ASFV có sức đề kháng cao, có thê tồn tại trong máu, phân và mô, trong xác động vật, thực phẩm được chế biến từ thịt heo như xúc xích, giăm bông.

Vi rút tồn tại trong thịt đông lạnh đến 15 tuần, đến 6 tháng đối với giăm bông bảo quản và 399 ngày đối với giăm bông Parma (Vizcaino và ctv, 2009; McKercher và ctv, 1978; Mebus va ctv, 1993). Vi rút tồn tại ở nhiệt độ 56°C trong 70 4 phút hoặc ở 60°C trong 20 phút (Mebus và ctv, 1997). Vi rút tồn tại trong máu dạng lỏng ở nhiệt độ phòng trong 18 tháng và lên đến 6 năm ở nhiệt độ 4°C (Blome và ctv, 2020): trong máu đã khô được 70 ngày, trong giăm bông được 140 ngày và ở nhiệt độ 50°C tổn tại trong 3 giờ (Cục Thú y, 2019); trong phân chuồng ở nhiệt độ phòng được 11 ngày (Africarne và ctv, 2019). Theo Cục thú y (2019), trong lách heo ASFV được bảo quản ở nhiệt độ sâu (-20°C đến -70°C) có thể tồn tại trong 82 đến 105 tuần và khong phát hiện ASFV trong thịt heo được nấu chín ở nhiệt độ 70°C.

Trong môi trường không có huyết thanh, vi rút có thể bị bat hoạt ở điều kiện pH < 3,9 hoặc pH > I1,5 (Mebus và ctv, 1997); trong môi trường với 25% huyết thanh với pH = 13.4, vi rút có thê tồn tại được trong 7 ngày và khi không có huyết thanh vi rút có thé tồn tại được 21 giờ (OIE, 2019). Theo Cục Thú y (2019), ASFV man cam với ether, chloroform, có thể bất hoạt vi rút bằng 0,8% sodium chloride, hop chat iodine, hypochlorites có chứa 2,3% chlorine, 0,3% formalin hoặc ortho-phenylphenol 3% và phải duy trì thời gian 30 phút.