Đặt vấn đề Dâu tây có tên khoa học là Fragaria ananassa, thuộc họ Rosaceae, là loại cây thuộc ngành thực vật hạt kín, cho trái với hàm lượng dinh dưỡng cao và chứa nhiều loại vitamin (vitamin C, vitamin B9, vitamin B6), khoáng chất (Kali, Magie, Mangan) cần thiết cho cơ thể. Theo báo UK Urban AgriTech, sản lượng dâu tây trên toàn thế giới là 8. Trong đó, châu Á là khu vực có sản lượng lớn nhất (4. Trung Quốc, Mỹ, Mexico là ba nước có sản lượng thu hoạch dâu tây lớn nhất trong năm 2019.
Ngoài ra, sản lượng dâu tây ở Trung Quốc chiếm 36% trên tổng số sản lượng thế giới [1][2]. Dâu tây thường được trồng ở vùng ôn đới, nhiệt độ mát mẻ, độ ẩm cao nên chúng khá nhạy cảm với các tác nhân gây bệnh như nấm mốc, sâu bọ, virus, vi khuẩn, … Dâu tây thường bị bệnh ở thân cây, lá, hoa, trái, … do một số tác nhân Botrytis cinerea (thối quả), Colletotrichum acutatum (bệnh đốm đen),. Một số biểu hiện của cây khi bị nhiễm bệnh có thể kể đến: cây kém phát triển, thân cây còi cọc, khả năng tạo trái hoặc hạt bị giảm sút rõ rệt khiến năng suất cây trồng bị ảnh hưởng [3]. Bệnh đốm lá do nấm mốc Nigrospora sphaerica gây ra tình trạng cháy lá, héo rũ ở lá, ảnh hưởng đến khả năng hình thành trái ở cây.
Những báo cáo về tình trạng gây bệnh của chủng nấm này trên các đối tượng khác đã làm ảnh hưởng rất nhiều sản lượng thu hoạch hàng năm. Tuy nhiên, tình trạng lá dâu tây bị nhiễm nấm N. sphaerica chưa có nghiên cứu nào trước 2 đây. Trong đó, xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật tiềm năng có thể ứng dụng trong kiểm soát bệnh thực vật vì nó phân bố rộng rãi trong tự nhiên với khả năng sản sinh ra các chất kháng sinh, tiết enzyme hoặc kết hợp chất chuyển hóa thứ cấp ức chế sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh, thúc đẩy sự tăng trưởng ở thực vật [4].
Do đó, đề tài “Tuyển chọn và khảo sát một số chủng xạ khuẩn có khả năng kháng nấm mốc Nigrospora sphaerica gây bệnh đốm trên lá dâu tây” được thực hiện nhằm làm đa dạng nguồn xạ khuẩn ứng dụng trong các biện pháp kiểm soát sinh học, góp phần xây dựng nền nông nghiệp bền vững. Mục tiêu Tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng với nấm mốc Nigrospora sphaerica gây bệnh đốm lá dâu tây. Phương pháp nghiên cứu 3.1 Phương pháp thu thâp dữ liệu và tổng hợp tài liệu Các tài liệu được tham khảo thông qua sách, bài báo của Việt Nam và Quốc tế trên mạng Internet với các từ khóa tìm kiếm: Streptomyces, antifungal, crude extract, fungal mycelium, in vitro, in leaf strawberry, suspensions culture, … Tham khảo các tài liệu, phương pháp thực hiện thí nghiệm đã được công bố trên tạo chí khoa học, tập san, báo cáo chuyên đề khoa học, Viện nghiên cứu, các nhà máy công nghiệp. Thu thập, tổng hợp tài liệu liên quan đề tài về khả năng đối kháng của xạ khuẩn đối với nấm bệnh gây hại trên cây trồng, từ đó xử lý dữ liệu.2 Phương pháp giữ giống xạ khuẩn Các chủng xạ khuẩn sau 4 ngày cấy ria trên môi trường Gause I agar, khuẩn lạc rời rạc và có những đặc điểm đặc trưng về chủng được lựa chọn để cấy vào môi trường Gause I broth 10ml, nuôi lắc trong 120 vòng/ phút, 7 ngày ở 35℃.
Sau đó, dịch nuôi cấy được phân phối vào các eppendorf có bổ sung glycerol, nồng độ glycerol cuối cùng là 50% và bảo quản ở - 80℃ [5].3 Phương pháp giữ giống nấm mốc Chủng nấm mốc được nuôi cấy trên môi trường PGA ở 25℃ sau 5 ngày, tiến hành cắt phần thạch có vùng tơ non với kích thước 1 1 mm2 cho vào eppendorf có bổ sung glycerol 50% và bảo quản ở -80℃ [5].4 Phương pháp hoạt hóa các chủng xạ khuẩn được cung cấp từ phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh Nguyên tắc: Hoạt hóa giống là phương pháp kiểm tra khả năng sinh trưởng và phát triển của các chủng xạ khuẩn, đồng thời cung cấp dinh dưỡng để bào tử của xạ khuẩn nảy mầm. Với mục đích đảm bảo giống xạ khuẩn thuần khiết không chứa vi sinh vật gây nhiễm khác, vẫn phát triển tốt, tạo ra các khuẩn lạc riêng rẽ, có thể tiến hành các bước tiếp của nghiên cứu [6]. Cách tiến hành: Giống được trữ trong tủ đông -80°C, tiến hành rã đông và hút 10µl từ eppendorf chứa dịch xạ khuẩn có bổ sung glycerol (1:1) nhỏ lên bề mặt thạch môi trường Gause I Agar. Sử dụng kỹ thuật cấy trải để trải dịch xạ khuẩn phủ đều trên bề mặt thạch cho đến khi khô lại.
Đĩa được để ở nhiệt độ phòng, sau 3-5 ngày kiểm tra hình thái, sự phát triển, độ thuần của chủng xạ khuẩn. Một khuẩn lạc đơn, đặc trưng được chọn để cấy chuyền qua đĩa môi trường Gause I Agar. Để đĩa đã ria lại xạ khuẩn ở nhiệt độ phòng, sau 5 ngày những khuẩn lạc này có thể sử dụng cho các nội dung thí nghiệm tiếp theo [6].5 Phương pháp sàng lọc và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng nấm mốc N. sphaerica gây bệnh đốm trên lá dâu tây Nguyên tắc: Hoạt tính đối kháng nấm của dịch nuôi cấy xạ khuẩn được thể hiện bởi khả năng ức chế sự lan tơ của hệ sợi tơ nấm.
Cách tiến hành: Các chủng xạ khuẩn được hoạt hoá trên môi trường Gause I agar. Các khuẩn lạc 5 ngày tuổi trên môi trường Gause I agar được cấy vào môi trường Gause I broth lắc 120 vòng/ phút, 35℃. Sau 5 ngày dịch nuôi cấy của các chủng xạ khuẩn được thu nhận để xác định hoạt tính đối kháng với nấm N. sphaerica bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch.
Mẫu tơ nấm với đường kính 8mm được đặt lên tâm đĩa môi trường PGA đồng thời 4 lỗ giếng có kích thước tương tự được đục xung quanh đĩa. Mỗi lỗ giếng được nhỏ 100μl dịch nuôi cấy xạ khuẩn. Đĩa thí nghiệm được ủ ở nhiệt độ phòng. Kết quả được thu nhận bằng phương pháp đo đường kính vòng kháng sau 24 đến 48 giờ.
Hoạt tính kháng nấm được đánh giá dựa trên phần trăm đối kháng tính theo công thức: (%) đối kháng = Trong đó D là độ dài từ tâm đến mép giếng đối chứng, d là độ dài từ tâm đến vị trí tơ nấm bị ức chế bởi hoạt tính kháng nấm của các chủng xạ khuẩn [5]. Các mức độ kháng nấm từ 4 mạnh, trung bình và yếu được đánh theo nghiên cứu của Trịnh Thới An (2014). Thí nghiệm được lặp lại 3 lần [7][8].6 Định danh chủng xạ khuẩn 3.1 Quan sát hình thái chủng xạ khuẩn • Quan sát đại thể của các chủng xạ khuẩn trên môi trường Gause I agar sau 3 ngày cấy ria trên môi trường. • Quan sát hình thái vi thể của chủng xạ khuẩn dưới kính hiển vi với độ phóng đại 1000 lần trên tiêu bản phòng ẩm 3.2 Định danh chủng xạ khuẩn bằng phương pháp giải trình tự gene 16S – rRNA Chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng mốc cao được định danh dựa trên phân tích trình tự đoạn gene 16S - rRNA.
Xạ khuẩn được nuôi cấy trong môi trường Gause I broth, 5 ngày ở điều kiện 120 rpm, 35℃ Sau khi ly tâm 6000 rpm trong 15 phút, phần cặn được thu nhận và rửa với nước muối sinh lý ba lần. Nhằm chiết DNA tổng số, sinh khối tế bào được trộn với 100µL Buffer (10mM Tris, 0.1mM EDTA, pH 8.0), đun sôi trong 15 phút. Vùng gene 16S - rRNA được khuếch đại bằng cặp mồi 27F: 5’–AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’ và 1540R: 5’–AAGGAGGTGATCCAACCGCA-3’ [9]. Trong thành phần phản ứng PCR gồm có MasterMix 25µL, mồi xuôi 1µL, mồi ngược 1µL, DNA khuôn 3µL, DMSO 25% 6µL, thêm dH20 16µL cho đủ tổng thể tích là 50 µL [9].
Chu trình nhiệt được thực hiện ở điều kiện biến tính 94℃ – 10 phút, trong 30 chu kỳ tiếp theo 94℃ – 30 giây, 55℃ – 45 phút, 72℃ – 2 phút, 72℃ – 10 phút, cuối cùng bảo quản 4℃ - ∞ [10]. Sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel agarose 1.5% TAE 1X và ghi nhận kết quả. Sản phẩm PCR được gửi đến Công ty Trách nhiệm hữu hạn Nam Khoa (Quận 7, Thành phố Hồ Chí Minh) để giải trình tự. Sau khi có trình tự gen của chủng xạ khuẩn nghiên cứu, các trình tự gen tương đồng được truy xuất từ ngân hàng dữ liệu Genbank (NCBI, https://www.gov/) và được sắp giống bằng phần mềm Seaview4.
Cây phát sinh loài được xây dựng trên thuật toán Neighbor – Joining với boostrap 1000 lần lặp lại bằng phần mềm Mega phiên bản 5.7 Phương pháp khảo sát điều kiện nuôi cấy cho hoạt tính kháng mốc của các chủng xạ khuẩn (carbon, nitrogen, nhiệt độ, pH) Nguyên tắc: Trong điều kiện nuôi cấy thích hợp, chủng xạ khuẩn cho hoạt tính mạnh nhất và rút ngắn thời gian nuôi 5 Cách tiến hành: Các chủng xạ khuẩn được hoạt hoá trên môi trường Gause I agar. Các khuẩn lạc 5 ngày tuổi trên môi trường Gause I agar được cấy vào môi trường Gause I broth lắc 120 vòng/ phút, 35℃. Dịch nuôi cấy của các chủng xạ khuẩn từ môi trường tăng sinh sau 3 ngày được chuyển 1% giống vào bình môi trường khảo sát. Để khảo sát các nguồn carbon thích hợp, tiến hành khảo sát các nguồn carbon khác nhau với nồng độ 1%, trong đó đối chứng là môi trường Gause I broth chứa 2% tinh bột tan.
Tương tự với khảo sát carbon, khảo sát các nguồn nitrogen thích hợp với nồng độ 1% và đối chứng là môi trường Gause I broth chứa 0. Bên cạnh đó, tiến hành khảo sát nhiệt độ (25℃, 30℃, 35℃, 40℃, 45℃); pH (4.0) [11] và lắc ở 120 rpm. Hoạt tính đối kháng nấm của dịch nuôi cấy được xác định từng ngày bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch và kết quả được được ghi nhận tương tự ở mục 2. Tổng kết về kết quả nghiên cứu Đề tài: “Tuyển chọn và khảo sát một số chủng xạ khuẩn có khả năng kháng nấm mốc Nigrospora sphaerica gây bệnh đốm trên lá dâu tây” đã thu được một số kết quả: − Tuyển chọn được 3 chủng xạ khuẩn có hoạt tính ức chế nấm mạnh nhất: CNXK 65.2, CNXK 63, CNXK 3 − Định danh 3 chủng xạ khuẩn đã tuyển chọn − Thu được kết quả khảo sát điều kiện nuôi cấy thích hợp cho hoạt tính kháng mốc tốt nhất của 3 chủng xạ khuẩn 5.
Đánh giá các kết quả đã đạt được và kết luận Chủng xạ khuẩn CNXK 65.2, CNXK 63, CNXK 3 có khả năng kháng nấm mốc N. sphaerica gây bệnh đốm trên lá dâu tây tốt nhất. Có tiềm năng trong ứng dụng sản xuất các hợp chất đối kháng từ xạ khuẩn, áp dụng rộng rãi trong các lĩnh vực của đời sống.