CHƯƠNG 1. Khái quát về Bacillus 1. Đặc điểm sơ bộ về Bacillus Theo khóa phân loại của Bergey, Bacillus được phân loại như sau: Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Bacillales Họ: Bacillaceae Chi: Bacillus Chi Bacillus phân bố rộng trong tự nhiên như trong đất, nước, không khí, cơ thể thực vật, động vật, là các vi khuẩn hình que, Gram dương, hiếu khí, các tế bào vi khuẩn có thể tồn tại riêng lẻ hay dính với nhau thành chuỗi ngắn bao gồm nhiều tế bào, đa số có khả năng tạo nội bào tử. Sự tạo thành nội bào tử được coi là một tính chất để phân biệt các thành viên của chi.
Đối với Bacillus có nội bào tử thì bào tử hình trụ, oval, tròn, thỉnh thoảng có hình bầu dục. Tùy theo loài, bào tử có thể nằm ở giữa, gần cuối hoặc ở cuối và túi bào tử phồng hoặc không phồng. Tế bào sinh dưỡng Bacillus thẳng, có đầu tròn hoặc vuông, kích thước từ 0,5-1,2 x 2,5-10 µm, ở dạng đơn lẻ hay chuỗi ngắn hoặc dài [7, 8]. Dinh dưỡng và phát triển của Bacillus [7, 8] Môi trường nuôi cấy Bacillus phát triển tốt trên các môi trường dinh dưỡng thương mại gồm các thành phần cơ bản như: pepton, cao thịt, glucose, lactose, chất khoáng… Trong phòng thí nghiệm, ở điều kiện phát triển tối ưu, thời gian thế hệ của Bacillus khoảng 25 phút.
Hầu hết các loài Bacillus cần một môi trường đặc biệt để tạo bào tử. Sự tạo bào tử được cảm ứng sau pha tăng trưởng hàm mũ do nồng độ dinh dưỡng, đặc biệt là nguồn carbon, nitrogen, hoặc phospho bị cạn kiệt. SVTH: Lê Uyên Nhàn 2 Khóa luận tốt nghiệp GVHD: PGS TS Trần Cát Đông Nhiệt độ phát triển Phần lớn Bacillus ưa nhiệt trung tính, tạo khuẩn lạc đặc trưng sau 24 giờ nuôi cấy ở 37oC. Các loài ưa nhiệt phát triển từ 55 đến 70oC, thường là khoảng 60oC.
Loài ưa nhiệt trung bình phát triển tốt tại 45 - 50oC. Loài gây bệnh cho côn trùng phát triển ở nhiệt độ từ 25 - 30oC. Tổng quan về Bacillus indicus [14] Hiện nay, chưa có nhiều tài liệu nghiên cứu Bacillus indicus, các đặc điểm về loài này được mô tả dưới đây dựa trên nghiên cứu về Bacillus indicus Sd/3T phân lập từ các mẫu đất của vùng Tây Bengal, Ấn độ của Suresh và cộng sự năm 2004. Theo nghiên cứu này, các đặc điểm hình thái, phát triển, sinh hóa và phân loài dựa trên giải trình tự 16S rRNA đã được mô tả chi tiết.
Phổ UV-Vis của sắc tố từ dịch chiết sinh khối của Bacillus indicus trong acetone có ba đỉnh hấp thu đặc trưng của carotenoid ở 404, 428 và 451 nm. Phân loài [14] Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Bacillales Họ: Bacillaceae Chi: Bacillus Loài: Bacillus indicus Dựa trên việc giải trình tự 16S rRNA, mối liên hệ về loài giữa Bacillus indicus và một số Bacillus khác đã được trình bày như trong hình 1. Trong đó, Bacillus indicus có liên hệ gần (94%) với B. flexus và 95% với B.
cohnii DSM 6307T, Bacillus pumilus IFO 15566T và Bacillus bataviensis LMG 21833T. SVTH: Lê Uyên Nhàn 3 Khóa luận tốt nghiệp GVHD: PGS TS Trần Cát Đông Hình 1. Cây phân loài dựa trên việc giải trình tự 16S rRNA 1. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa [14] 1.
Hình thái: Bacillus indicus thuộc nhóm vi khuẩn hiếu khí, gram dương, tế bào hình que có kích thước 0,9 -1,2 μm x 3,3 – 3,5 μm. Có khả năng tạo nội bào tử hình ovan, nằm ở gần cuối túi bào tử phồng. Khuẩn lạc có bề mặt nhẵn, mịn, rìa trơn, tròn không đều, tâm hơi nhô lên, màu vàng cam và đường kính từ 3,0 - 4,0 mm sau một ngày nuôi cấy ở 300C trên môi trường DSM. SVTH: Lê Uyên Nhàn 4 Khóa luận tốt nghiệp GVHD: PGS TS Trần Cát Đông 1.
Sinh lý Nhiệt độ tăng trưởng tối ưu của Bacillus indicus là 30oC, phát triển được trong khoảng nhiệt độ từ 15 đến 37 oC, không phát triển được ở nhiệt độ cao hơn 40oC. Phát triển tối ưu trong khoảng pH từ 6-7. Nồng độ NaCl thích hợp cho sự phát triển của Bacillus indicus là 2,0 %. Đặc điểm sinh hóa Bacillus indicus Đặc điểm Đặc điểm Khả năng thủy phân: D-maltose + Aesculin + D-manose + Tween 20 - L-mroline + Tinh bột + Pyruvate - Khả năng lên men: Raffinose - Aesculin + L-rhamnose + L-arginine + D-ribose + Arabinose - L-serine + D-cellobiose + Sucrose - Meso-erythritol + L-tryptophan + Inositol + L-tyrosine + Glutarate - Đề kháng kháng sinh: Lactose + Amoxylixin (10µg) R D-melibiose + Ampicillin (10µg) S D-maltose + Nalidixic (30µg) S Tetraciclyne D-manose + S (30µg) Ghi chú: + : dương tính R: đề kháng - : âm tính S: nhạy cảm SVTH: Lê Uyên Nhàn 5 Khóa luận tốt nghiệp GVHD: PGS TS Trần Cát Đông 1.
Vài nét về carotenoid Thuật ngữ carotenoid dùng để chỉ một họ gồm khoảng 600 hợp chất khác nhau. Những hợp chất này là dạng sắc tố hữu cơ tự nhiên trong thực vật và các loài sinh vật quang hợp khác như là tảo, một số loài vi nấm, vi khuẩn. Mặc dù trong thiên nhiên số lượng carotenoid nhiều như vậy nhưng số có lợi cho sức khỏe không nhiều. Theo những mô tả của Wackenroder ( 1831) và Berzelius (1837) thì người ta phân loại carotenoid chia ra hai dạng : • Hydrocacbon carotenod: chỉ có H và C (lycopen, β- caroten, ε-caroten…) • Oxidized carotenoid: dẫn chất alcol, aldehyd, ceton, epoxit…(canthaxanthin, astaxanthin, lutein,… ) β – Carotene Canthaxanthin 1.
Ứng dụng của carotenoid 1. Tác dụng sinh học - Tiền tố của vitamin A Khoảng 600 loại carotenoid từ tự nhiên đã được xác định với khoảng 10% là tiền tố của vitamin A trong đó β-caroten có giá trị dinh dưỡng cao nhất. Tuy nhiên, khác với vitamin A, β-caroten không gây nhiều tác hại cho cơ thể khi dùng quá liều. Vitamin A là một vitamin tan trong dầu nên khi quá liều sẽ được dự SVTH: Lê Uyên Nhàn 6 Khóa luận tốt nghiệp GVHD: PGS TS Trần Cát Đông trữ và gây độc cho cơ thể.
Ngược lại, nếu dùng nhiều β-caroten thì chỉ có một lượng nhất định β-caroten được chuyển hóa tạo thành vitamin A, số còn lại sẽ được dự trữ ở mô mỡ. Vì thế nếu dùng nhiều có thể gây nên vàng da, nhưng không gây độc chết người như khi dùng quá liều vitamin A [9, 10]. - Đánh bắt ánh sáng Carotenoid được xem là các yếu tố đánh bắt ánh sáng do có thể tác dụng được với dạng oxi đơn bội (1O2). Đây là dạng oxi hoạt động mạnh gây phá hủy mô được tạo thành dưới tác dụng của ánh sáng.
Do đó, carotenoid có tác dụng bảo vệ chống lại sự hủy hoại mô do ánh sáng mặt trời [9, 10]. - Dập tắt gốc tự do Carotenoid dập tắt các gốc tự do trong các phản ứng dây chuyền của quá trình oxi hóa với vai trò của một chất ngắt mạch để ngăn chặn sự sản sinh các sản phẩm độc hại đối với cơ thể. Do đó, carotenoid được bào chế ở dạng dược phẩm bổ sung hay thực phẩm chức năng đem lại lợi ích sức khỏe cho con người [9, 10]. Tác dụng dược lý - Ngăn ngừa các bệnh tim mạch Nguyên nhân chủ yếu của các tai biến về tim mạch có liên quan đến xơ vữa động mạch.
Nhiều nghiên cứu cho rằng trong vành động mạch bị đóng bởi chất mỡ xấu gọi là LDL. Sự bám chặt của LDL vào thành mạch diễn ra rất chậm. Khi các LDL bị các gốc tự do có oxi tấn công sẽ tạo ra các sản phẩm peroxid hóa làm thương tổn cho thành động mạch, làm hư hao các cơ, và tiến sâu vào thành động mạch với tốc độ nhanh hơn 20 – 30 lần tác động của LDL. Do vậy, một trong những bước quan trọng trong việc ngăn ngừa các bệnh lý tim mạch là phòng chống sự oxi hóa LDL [5].
- Ngăn ngừa ung thư Với khả năng chống lại các gốc tự do trong việc tấn công vào các ADN làm sai lệch vi trí các cặp base dẫn đến đột biến và ung thư, carotenoid đã và đang được nghiên cứu trên lâm sàng để chứng minh khả năng làm giảm nguy cơ hay ngăn ngừa ung thư như ung thư phổi, ung thư da, ung thư vú, tuyến tiền liệt, thực quản… SVTH: Lê Uyên Nhàn 7 Khóa luận tốt nghiệp GVHD: PGS TS Trần Cát Đông Tác dụng đối với thị giác β-caroten là tiền tố vitamin A. β-caroten cũng có những tác dụng tương tự như vitamin A cụ thể là chống khô giác mạc của mắt, tăng độ nhạy của mắt, chống bệnh quáng gà. Một carotenoid khác là lutein cũng được dùng để ngăn ngừa thoái hóa võng mạc – một bệnh có thể dẫn đến mù ở những người trên 60 tuổi. Con đường sinh tổng hợp carotenoid ở vi khuẩn Sự tổng hợp carotenoid trong cơ thể vi khuẩn dù đi theo hai con đường tổng hợp mevalonat hay không tổng hợp mevalonat đều tổng hợp ra đơn vị isopren đầu tiên là isopentenyl pyrophosphat (IPP).
Dưới tác dụng của một số enzym xúc tác, một loạt phản ứng trùng hợp được thực hiện tạo ra hợp chất geranylgeranyl pyrophosphat (GGPP) và tạo thành carotenoid. Các chủng vi khuẩn khác nhau chứa các gen khác nhau điều hòa sự tổng hợp các enzym xúc tác phản ứng tạo các carotenoid đặc trưng cho từng chủng vi khuẩn [12]. Con đường Non-mevalonate Hình 1. Con đường sinh tổng hợp carotenoid SVTH: Lê Uyên Nhàn 8 Khóa luận tốt nghiệp GVHD: PGS TS Trần Cát Đông 1.
Vai trò của carotenoid đối với vi khuẩn Nhìn chung, cường độ màu các carotenoid nằm trong tế bào vi khuẩn sẽ được tăng lên nhờ vào tác động của ánh sáng và tăng lên trong cuối pha tăng trưởng của vi khuẩn (khoảng 0,06% trọng lượng khô). Các carotenoid chủ yếu tập trung ở màng tế bào chất (chứa khoảng 0,14%). Tùy theo cấu trúc hóa học mà các carotenoid có vị trí khác nhau trong màng tế bào. Do đó, carotenoid có vai trò quan trọng trong việc bảo vệ vi khuẩn chống lại tác hại của ánh sáng nên được gọi là những sắc tố đánh bắt ánh sáng.
Ngoài ra, carotenoid còn có những vai trò khác như ổn định màng lipid tế bào, giảm tính lỏng và tăng độ bền của màng tế bào giúp vi khuẩn có thể chịu được nhiệt độ cao và tia phóng xạ, tăng sự đề kháng của vi khuẩn giúp cho vi khuẩn có thể sống được ở nhiều môi trường khắc nghiệt như môi trường acid, kiềm hay môi trường có độ mặn cao [11, 12]. Carotenoid Carotenoid không phân phân cực cực Hình 1. Vị trí các carotenoid trong màng tế bào 1. Khái niệm Lên men là tất cả các quá trình biến đổi do vi sinh vật thực hiện trong điều kiện yếm khí hay hiếu khí.
Hay nói một cách khác lên men là sự tích lũy các sản phẩm trao đổi chất hữu ích cho con người trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật.