Đặt vấn đề Nấm dƣợc liệu đã đƣợc biết đến từ hàng ngàn năm nay đƣợc sử dụng hoặc nghiên cứu và điều trị bệnh. Hơn hai phần ba số ca tử vong liên quan đến ung thƣ có thể đƣợc ngăn ngừa hoặc giảm đi bằng cách bổ sung nấm vào trong khẩu phần ăn [24]. Nấm phân bố trên toàn thế giới và phát triển ở nhiều dạng môi trƣờng sống khác nhau, kể cả sa mạc. Đa phần các nấm đều không thể nhìn thấy đƣợc bằng mắt thƣờng, chúng sống phần lớn ở trong đất, chất mùn, xác sinh vật chết, cộng sinh hoặc kí sinh trên cơ thể động, thực vật [1].
Những loại nấm nhƣ nấm Hƣơng, nấm Chaga, nấm Linh chi, nấm phục linh, nấm Đông trùng hạ thảo đã đƣợc tập trung nghiên cứu bởi khả năng chống ung thƣ, chống virus và tăng cƣờng hệ miễn dịch [1]. Đông trùng hạ thảo (ĐTHT - tên khoa học Cordyceps) là tên gọi chung chỉ những loài nấm thuộc lớp Ascomycetes kí sinh trên ấu trùng các loài bƣớm thuộc chi Thitarodes. Vào mùa đông nấm xâm nhiễm vào cơ thể ấu trùng ẩn dƣới mặt đất, vào mùa hè với nhiệt độ vào độ ẩm thích hợp, hệ sợi nấm phát triển thành cây nấm nhú lên trên mặt đất. Trong Cordyceps, có rất nhiều thành phần quan trọng bao gồm các loại acid amin thiết yếu, vitamin: B1, B2, B12 và K, các loại carbohydrate khác nhau nhƣ monosaccharide, oligosaccharides và các polysaccharide, protein, sterole, nucleoside và các nguyên tố vi lƣợng khác [24].
Quả thể nấm còn chứa nhiều axit amin khác nhƣ lysine, glutamic acid, proline và threonine. Hoạt chất chính trong Cordyceps là cordycepin và adenosine [24]. Cordyceps có rất nhiều tác dụng chẳng hạn nhƣ chống ung thƣ, chống oxy hóa, điều hòa miễn dịch, bồi bổ sinh khí, tăng cƣờng khả năng sinh lý của phái mạnh…. c 2 Hiện nay, trƣớc nhu cầu tiêu thụ đông trùng hạ thảo ngày một lớn, giá trị kinh tế mang lại từ hoạt động nuôi trồng nấm đông trùng hạ thảo ngày càng cao, do vậy một số công ty, các viện nghiên cứu, trƣờng Đại học… đang tiến hành đẩy mạnh nghiên cứu sản xuất loại dƣợc thảo này.
ĐTHT trên thị trƣờng Việt Nam vẫn chƣa đƣợc khai phá hết tiềm năng. Các cơ sở nuôi trồng nấm đa số thực hiện trên môi trƣờng rắn, sản phẩm chỉ đƣợc thƣơng mại hóa dƣới dạng sơ chế (quả thể tƣơi, khô dùng để bổ sung vào thực phẩm hoặc làm thức uống). Nuôi cấy trên môi trƣờng rắn mất thời gian dài để hình thành quả thể. Trong khi đó nuôi cấy trên môi trƣờng lỏng có nhiều lợi thế, thời gian nuôi cấy ngắn hơn với nguy cơ nhiễm thấp, tiết kiệm đƣợc chi phí sản xuất.
Việc nghiên cứu các loại môi trƣờng lỏng thích hợp để tăng hàm lƣợng hoạt chất có trong ĐTHT sẽ đáp ứng đƣợc nhu cầu về mặt dƣợc liệu, mở ra hƣớng đi mới trên quy mô công nghiệp. Xuất phát từ thực tiễn đó, tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Khảo sát ảnh hƣởng thành phần môi trƣờng lỏng đến sự phát triển hệ sợi và hàm lƣợng cordycepin của nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris”. Mục tiêu đề tài 1.1 Mục tiêu tổng quát Tìm ra môi trƣờng lỏng thích hợp để tăng sinh trƣởng hệ sợi và nâng cao hàm lƣợng cordycepin trên chủng giống C.2 Mục tiêu cụ thể - Tìm ra đƣợc công thức môi trƣờng lỏng phù hợp cho sự sinh trƣởng, phát triển của hệ sợi và đạt đƣợc tổng hàm lƣợng cordycepin cao nhất. - Tìm ra đƣợc độ pH môi trƣờng lỏng phù hợp cho sự sinh trƣởng, phát triển của hệ sợi và đạt tổng hàm lƣợng cordycepin cao nhất.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 1. Ý nghĩa khoa học của đề tài Quá trình nghiên cứu sẽ đƣa ra đƣợc sự ảnh hƣởng của thành phần môi trƣờng, độ pH của môi trƣờng đến sự phát triển hệ sợi và hàm lƣợng cordycepin của nấm Cordyceps militaris. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài - Kết quả nghiên cứu là căn cứ khoa học giúp cho việc hoàn thiện quy trình nuôi trồng nấm C. miltaris trên môi trƣờng lỏng để sản xuất cordycepin - Mở ra hƣớng ứng dụng sản xuất cordycepin trên quy mô công nghiệp.
- Tạo ra sản phẩm nấm ĐTHT có chất lƣợng đảm bảo với chi phí hợp lý. - Thúc đẩy phong trào nghiên cứu khoa học của sinh viên Khoa CNSH- CNTP và nhà trƣờng c 4 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Giới thiệu Đông Trùng Hạ Thảo Nấm Đông trùng hạ thảo (ĐTHT) là các loài nấm thuộc ngành phụ nấm túi Ascomycetes ký sinh trên cơ thể côn trùng, đƣợc xem nhƣ là một dƣợc liệu nổi tiếng từ cổ xƣa. Chi nấm Cordyceps đã đƣợc thu mẫu và định loại trên 400 loài khác nhau và theo hệ thống phân loại các loài này đƣợc xếp vào họ Clavicipitaceae.
Dựa trên đặc điểm hình thái cũng nhƣ đặc điểm về cấu trúc phân tử, các loài nấm trên đƣợc xếp trong 162 đơn vị phân loại, bao gồm các chi chủ yếu là: Cordyceps, ElaphoCordyceps, MetaCordyceps và OphioCordyceps thuộc 2 họ Cordycipitaceae và Ophiocordycipitaceae. Trong chi Cordyceps loài đƣợc biết đến nhiều nhất là Cordyceps sinensis lần đầu tiên đƣợc biết đến với tên gọi là “yartsa gunbu” tại Tây Tạng trong thế kỷ 15 [17]. Trong y học Trung Quốc loài nấm này có tên là “Dong Chong Xi Cao”, còn trong y học Nhật Bản có tên là “Tochukaso/Tochukasu”, “totsu kasu” [9]. Nấm đƣợc phát hiện ở độ cao 3800m so với mực nƣớc biển trên các đồng cỏ ở cao nguyên Himalaya miền núi Tây Tạng, Nepal và các tỉnh Trung Quốc: Tứ Xuyên, Cam Túc, Hồ Bắc, Chiết Giang, Sơn Tây, Thanh Hải, Vân Nam.
Giai đoạn thu hoạch nấm thƣờng vào giữa tháng 4 và tháng 8 [10]. Ở Việt Nam, loài nấm này phân bố ở rừng nhiệt đới lá rộng thƣờng xanh ở độ cao từ 400-1800m so với mực nƣớc biển. Tần suất xuất hiện rất khác biệt giữa các địa điểm điều tra, phân bố phổ biến ở vƣờn quốc gia Hoàng Liên và Vƣờn Quốc gia Ba Vì, Vƣờn Quốc gia Tam Đảo, Khu Bảo tồn Thiên nhiên Copia [4],[5]. Nấm dƣợc liệu từ lâu đã là thành phần quan trọng trong nền y học thế giới.
Đặc biệt các loài trong chi Cordyceps đƣợc đánh giá cao do chứa nhiều c 5 dƣợc chất. Hiện nay Cordyceps có hai loài đƣợc nghiên cứu phổ biến là Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris bởi nó có nhiều hoạt chất sinh học tốt cho sức khỏe nhƣ: adenosine, cordycepin, acid béo, polysaccaride, inosine, thymine, guanidin, thymidine, uracil… [16]. Theo y học truyền thống của Trung Quốc, nấm Đông trùng hạ thảo có tác dụng chữa trị nhiều chứng bệnh: chữa bệnh về thận, bệnh về phổi, bệnh tim, chống suy nhƣợc, phục hồi sức khỏe, chữa trị ung thƣ, chứng nấc, giảm đau, chống lão hóa, chống viêm, chống virus, chống nấm, chống lại bệnh viêm màng phổi [9]. Có hơn 1200 loại nấm xâm nhiễm, trong đó Cordyceps là một trong những chi lớn nhất chứa khoảng 500 loài và các giống.
Nhiều loài khác nhau của Cordyceps đang đƣợc trồng bao gồm C. Tƣơng tự, nhiều loài Cordyceps khác đã đƣợc ghi nhận nhƣ C.tricentri… Loài nấm Cordyceps sinensis xuất hiện nhiều bên ngoài tự nhiên hơn cả, thƣờng phân bố ở độ cao trên 2000m so với mực nƣớc biển, tập trung chủ yếu ở Tây Tạng – Trung Quốc. Tuy nhiên hiện nay các nhà khoa học đang gặp khó khăn trong việc tìm ra môi trƣờng phù hợp để nuôi cấy loài nấm này. Để giải quyết vấn đề này, các nhà nghiên cứu đã tiến hành nuôi trồng nấm C.
miltaris trên môi trƣờng nhân tạo, loài nấm này có các hoạt chất hóa học tƣơng tự và dễ dàng nuôi trồng trên môi trƣờng nhân tạo so với loài C. Nấm Cordyceps militaris Cordyceps militaris là loài nấm thuộc họ Clavicipitaceae, giống Cordyceps. Loài này đƣợc Carl Linnaeus mô tả vào năm 1753 với tên gọi Clavaria militaris. miltaris đƣợc đặt tên là “Dong Chong c 6 Xia Cao” hoặc “Chong Cao” đƣợc sử dụng nhƣ một loại thuốc y học cổ truyền và thực phẩm chức năng trong các loại thảo mộc của Trung Quốc [2].1: Nấm Cordyceps militaris [30] Bảng 2.1: Bậc phân loại nấm Giới Fungi Ngành Ascomycota Lớp Ascomycetes/ Pyrenonmycetes Bộ Hypocreales Họ Clavicipataceae Chi Cordyceps Loài Cordyceps militaris Ký chủ Nấm C.
miltaris là loài đƣợc nghiên cứu kỹ nhất trong tất cả các loài của giống Cordyceps. Ký chủ phổ biến của loài C. miltaris trong tự nhiên bao c 7 gồm ấu trùng và nhộng của các loài bƣớm. Ngoài ra, còn có các ký chủ khác nhƣ các loài côn trùng thuộc bộ cánh cứng (Coleoptera), bộ cánh màng (Hymenoptera) và bộ hai cánh (Diptera).
Ví dụ: Lachnosterna quercina (thuộc bộ cánh cứng), Cimbex similis (thuộc bộ cánh màng) và Tipula paludosa (thuộc bộ hai cánh) [2].2: Một số ký chủ của nấm Cordyceps militaris Bộ Họ Loài Coleoptera Scarabaeidae Lachnosterna quercina Diptera Tipulidae Tipula paludosa Hymenoptera Cimbicidae Cimbex similis Lepidoptera Bombycidae Andraca bipunctata Chu trình sống của nấm C. miltaris Giống nhƣ hầu hết các loài Cordyceps khác, C.miltaris là một loại nấm ký sinh trên cơ thể côn trùng. Lớp biểu bì của côn trùng đƣợc bao phủ bởi một lớp biểu bì dày bao gồm chitin, protein và lipid. Trong tất cả các thành phần này, chitin là một loại heteropolysaccharide đƣợc tạo ra bằng quá trình trùng hợp N-acetyl glucosamine thông qua liên kết 1-4 β tạo thành cấu trúc quan trọng trong thành phần của côn trùng, đóng vai trò nhƣ một rào cản bảo vệ côn trùng với các tác nhân gây bệnh và ngăn ngừa sự mất nƣớc.
Chất gây bệnh phải vƣợt qua lớp vỏ cứng này để có thể xâm nhập vào cơ thể côn trùng.Vào mùa đông, sâu non, sâu trƣởng thành của một số loài nằm dƣới đất hoặc ở trên mặt đất, bị nấm ký sinh côn trùng xâm nhiễm (bào tử nấm hình thành các ống có các thể bám, các ống này tiết ra các loại enzyme nhƣ: lipase, chitinase, protease làm tan vỏ ngoài của ký chủ và xâm nhập vào bên trong cơ thể), sử dụng các chất trong cơ thể côn trùng để sinh trƣởng phát triển, làm cho côn trùng chết. Giai đoạn này nhiệt độ và ẩm độ không khí thấp, nấm ký c 8 sinh ở dạng hệ sợi. Đến mùa hè, nhiệt độ và ẩm độ không khí cao nấm chuyển sang giai đoạn hình thành quả thể và nhú lên khỏi mặt đất nhƣng gốc vẫn dính liền vào thân sâu [24].2: Các dạng bào tử trong chu trình sống của nấm. Thành phần hóa học của nấm Cordyceps militaris Các phân tích hoá học cho thấy trong sinh khối của C.
miltaris có 17 acid amin khác nhau, D-mannitol, lipit và nhiều nguyên tố khoáng (Se, Zn, Cu. Quan trọng hơn là trong sinh khối có nhiều chất có hoạt tính sinh học mà các nhà khoa học phát hiện đƣợc nhờ các tiến bộ của ngành hoá học các hợp chất tự nhiên. Theo số liệu của Viện sinh thái ứng dụng thuộc Viện Hàn lâm khoa học Trung Quốc, thành phần hóa học của thể quả nấm C.