Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Cơ sở khoa học của khảo nghiệm giống hoa lily nhập nội Khảo nghiệm giống cây trồng mới là quá trình theo dõi, đánh giá nhằm xác định tính khác biệt, tính đồng nhất, tính ổn định, giá trị canh tác, giá trị sử dụng của giống cây trồng trong điều kiện và thời gian nhất định. Cơ sở của việc nghiên cứu giống Lily là một trong các loại hoa cắt cành đẹp, có giá trị kinh tế cao và được ưa chuộng trên thế giới. Công tác chọn tạo giống hoa lily đã được tiến hành ở Hà Lan cách đây 35 năm.
Nhờ ứng dụng công nghệ sinh học (cứu phôi, nuôi cấy mô tế bào) trong nghiên cứu, mỗi năm Hà Lan đã tạo ra hàng trăm giống lily mới có giá trị cao và đã trở thành nước đứng đầu thế giới về nghiên cứu – sản xuất – chuyển giao và thương mại đối với loại cây trồng này. Cây hoa lily mới được phát triển mạnh ở nước ta những năm gần đây, giống lily đưa vào sản xuất chủ yếu là nhập nội từ Hà Lan, Trung Quốc hoặc Đài Loan. Chúng chưa được nghiên cứu khảo nghiệm tại các vùng sinh thái một cách hệ thống trước khi trồng, nên dẫn đến một số giống có chất lượng hoa kém, mẫu mã xấu, nở hoa không đúng dịp… gây khó khăn cho người sản xuất, hiệu quả kinh tế thấp, có khi dẫn đến thất bại. Nghiên cứu giống sẽ giúp chúng ta biết được đặc điểm sinh trưởng, phát triển, khả năng phù hợp của chúng với điều kiện ngoại cảnh, từ đó có thể lựa chọn được những giống phù hợp với điều kiện của từng địa phương trước khi đưa vào sản xuất.
Cơ sở của việc nghiên cứu thời vụ Ở mỗi thời vụ có điều kiện ngoại cảnh khác nhau, ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển của cây cũng khác nhau. 4 Hơn nữa, lily là cây hoa cao cấp, hoa thường nở tập trung, giá trị kinh tế cao. Ở những ngày thường, nhu cầu loại hoa này không lớn, khả năng tiêu thụ khó, giá bán thấp, trong khi đó những dịp lễ, tết như: Ngày 8/3, ngày 20/11, Tết Nguyên Đán,… nhu cầu về hoa lily rất lớn, dễ tiêu thụ trên thị trường, giá bán cao. Nghiên cứu thời vụ trồng lily ở nước ta chưa nhiều, việc nghiên cứu thời vụ không những giúp chúng ta xác định được thời gian trồng hợp lý mà còn xác định được thời vụ trồng có hiệu quả kinh tế cao.
Cơ sở của việc nghiên cứu mật độ trồng Mỗi loại cây trồng yêu cầu trồng ở một mật độ nhất định mới sinh trưởng, phát triển thuận lợi, cho năng suất và chất lượng cao. Đối với hoa lily, tùy theo mục đích thương mại làm hoa cắt cành hay hoa chậu mà người ta trồng ở mật độ khác nhau. Ở nước ta, hoa lily là một cây mới, nghiên cứu mật độ trồng còn ít, việc nghiên cứu để xác định mật độ trồng phù hợp sẽ góp phần xây dựng quy trình kỹ thuật và mức đầu tư hợp lý để nâng cao hiệu quả kinh tế cho người sản xuất. Cơ sở khoa học của lai hữu tính ở cây hoa lily 1.
Các khái niệm cơ bản - Thụ phấn (Pollination) là sự tiếp nhận các hạt phấn từ bao phấn tới núm nhụy để thực hiện thụ tinh ở hoa. Ở thực vật có hai phương thức thụ phấn là thụ phấn chéo và tự thụ phấn. - Thụ tinh (Fertilization): Ở thực vật thụ tinh là sự kết hợp của hai giao tử đực và cái (tinh trùng và noãn) là đặc trưng cơ bản của sinh sản hữu tính hay sinh sản lưỡng tính. - Phôi là một nhóm tế bào có khả năng phát triển trung gian giữa hợp tử hay tế bào soma và bào tử thể.
Có hai loại phôi: Phôi hữu tính và phôi vô tính. + Phôi hữu tính: Là phôi trong hạt được tạo ra do thụ tinh giữa tế bào trứng và giao tử đực (do lai hoặc tự thụ) còn gọi là phôi hợp tử. 5 + Phôi vô tính: Là phôi được phát sinh từ tế bào sinh dưỡng 2n chỉ của bố hoặc mẹ và tế bào ấy có cấu trúc như một phôi gọi là phôi vô tính. - Nuôi cấy phôi (cứu phôi): Là sự tách rời và nuôi cấy in-vitro phôi hợp tử đã thành thục hoặc chưa thành thục cây hoàn chỉnh.
Các phương pháp thụ phấn 1. Phương pháp thụ phấn thông thường Đây là phương pháp đơn giản, được sử dụng hầu hết trong chọn tạo giống cây trồng nói chung và cây hoa nói riêng. Nguyên tắc chung của phương pháp này là khi hoa nở (đầu nhụy hoa tiết dịch) và khi bao phấn mở thì tiến hành thụ phấn cho hoa. Lấy pang gắp bao phấn hoặc dùng bút lông chấm vào hỗn hợp hạt phấn và thụ lên đầu nhụy.
Khi lai xong thì dùng giấy bạc bao đầu nhụy hoa lại. Phương pháp thụ phấn cắt vòi nhụy (Cut style method – CSM) Là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất khi lai xa giữa các loài thuộc chi Lilium. Khi hoa nở (kiểm tra thấy đầu nhụy tiết dịch nhờn) thì tiến hành thụ phấn cho hoa. Đầu tiên dùng dao sắc cắt gần hết phần vòi nhụy, cắt lên phía trên bầu nhụy, chỉ để lại phần vòi nhụy có chiều dài 1 – 2 mm.
Sau đó dùng đầu nhụy vừa cắt chấm vào hỗn hợp hạt phấn cần thụ và thụ lên trên phần vòi nhụy còn lại (đỉnh của mặt cắt). Trong trường hợp này, số lượng hạt phấn nảy mầm có thể giảm, tuy nhiên số lượng hạt phấn nảy mầm mà thâm nhập được vào trong noãn lại tăng. Những nghiên cứu gần đây đã được tiến hành bởi việc so sánh giữa 2 phương pháp: Thụ phấn thông thường và thụ phấn cắt vòi nhụy để tạo ra con lai khác loài F1 và BC1. Các kết quả chỉ ra rằng thụ phấn cắt vòi nhụy là tốt hơn đối với thế hệ lai F1 và phương pháp thụ phấn thông thường là tốt hơn đối với quần thể BC được tạo ra.
Phát hiện này có thể được giải thích bằng rào cản khi lai giữa các loài. Trong trường hợp con lai khác loài F1, thành 6 phần genome là dị hợp tử, khi lai lại bởi phương pháp thụ phấn thông thường đã cho thấy sự nảy mầm hạt phấn bình thường và ống phấn phát triển xuyên qua vòi nhụy (Theo Đặng Văn Đông, 2010) [5]. Phương pháp ghép vòi nhụy (Grafted style method – GSM) Phương pháp ghép vòi nhụy được phát triển bởi vì phương pháp cắt vòi nhụy thông thường chỉ tạo ra một vài phôi trên quả lily. Khi sử dụng phương pháp cắt vòi nhụy, ống phấn còn ngắn và hầu hết trong số chúng không thể xâm nhập màng noãn (micropyle).
Ghép vòi nhụy nên được sử dụng kết hợp với thụ phấn in-vitro (Van Tuyl & cs, 1991) [35]. Phương pháp này được tiến hành như sau: Trước tiên, người ta nuôi in- vitro bầu nhụy của cây cho và cây nhận. Các hạt phấn hữu dục từ cây cho được thụ phấn lên phía trên với đầu nhụy tương hợp của chính cây đó. Sau từ 1 – 2 ngày, vòi nhụy được cắt 1 – 2 mm phía trên bầu nhụy và người ta gắn vòi nhụy đã cắt này (phần được thụ phấn) lên vòi nhụy (đã được cắt ngắn với bầu nhụy) của cây nhận.
Mô ghép này được giữ trong vòng 2 ngày cho đến khi hạt phấn đi vào bầu nhụy của cây nhận hoàn toàn. Sau 5 ngày, bầu nhụy được nuôi cấy theo phương pháp nuôi cấy lát cắt bầu nhụy. Kỹ thuật này đòi hỏi độ chính xác cao cần nhiều nhân công và chỉ dùng để kết hợp với thụ phấn in-vitro mà không kết hợp được với các kỹ thuật khác. Phương pháp thụ phấn In-vitro (In-vitro pollination) Điều kiện để thực hiện thành công sự thụ phấn trong ống nghiệm là phải nuôi cấy được bầu quả hay noãn trần và chủ động điều khiển quá trình nảy mầm của hạt phấn trên môi trường vô trùng.
Sau quá trình thụ phấn, thụ tinh, phôi hình thành sẽ được nuôi cấy ngay trên môi trường dinh dưỡng vô trùng. Phương pháp thụ phấn in-vitro bằng kỹ thuật cắt vòi nhụy và ghép vòi nhụy đã được phát triển và áp dụng rộng rãi vào nhiều phép lai cùng loài, trong đó sử dụng L. longiflorum và cả giống lai Asiatic và Oriental làm bố mẹ. Các phương pháp cứu phôi 1.
Nuôi cấy lát cắt bầu nhụy (Ovary-slice culture) Nuôi cấy lát cắt được ứng dụng bởi Kanoh & cs (1988) và Van Tuyl & cs (1991) cho việc tạo ra các con lai khác loài. Bầu nhụy được thu hoạch 7 – 10 ngày sau thụ phấn, cắt thành các lát cắt có độ dày 2 mm, và được đặt trên môi trường gồm 10% sucrose. Số điểm phồng lên của noãn trong nuôi cấy bầu nhụy được dùng để ước lượng hiệu quả trung bình về sự phát triển noãn. Trong vòng 30 ngày, noãn và phôi có thể được chia tách từ các lát cắt và nuôi cấy riêng biệt cho tới khi nảy mầm (Theo Lim Ki-Byung, 2006) [39].
Nuôi cấy noãn (Ovule culture) Phương pháp nuôi cấy noãn phải được ứng dụng trong suốt quá trình sinh trưởng của phôi và trước khi phôi bị thoái hóa. Thời gian cho nuôi cấy noãn phụ thuộc vào sự kết hợp của phép lai (kiểu gen con lai) và nằm trong phạm vi từ 30 – 45 ngày sau thụ phấn. Do phương pháp cứu phôi tốn nhiều nhân lực nên phương pháp nuôi cấy noãn có thể được sử dụng khi một số lượng lớn các noãn được lai phải được tiến hành trong một thời gian ngắn. Tuy nhiên, tỷ lệ nảy mầm của phôi ở phương pháp nuôi cấy noãn là thấp hơn so với phương pháp nuôi cấy phôi.
Nuôi cấy phôi (Embryo culture) North & Wills (1969) đã nuôi cấy phôi thành công từ hạt không có nội nhũ và có nguồn gốc từ phép lai xa liên quan đến L. Nuôi cấy phôi có thể được ứng dụng thành công trong các phép lai mà sự thoái hóa của phôi diễn ra một cách chậm chạp. Điều này thường xảy ra với các phép lai giữa các loài có quan hệ gần gũi một cách tương đối. Trong hầu hết các trường hợp, phôi có thể được cứu khi chúng đạt đến giai đoạn hình cầu.
Kỹ thuật này rất đáng tin cậy và các phôi sinh trưởng nhanh mà không có bất kỳ sự phát triển khác thường nào. Thời gian tốt nhất cho phương pháp cứu phôi là khoảng 40 – 60 ngày sau thụ phấn (Theo Đặng Văn Đông, 2010) [5]. Cơ sở khoa học về khả năng tái sinh ở thực vật 1. Tính toàn năng của tế bào Haberlandt (1902), lần đầu tiên đã quan niệm rằng mỗi tế bào bất kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh.