Luận văn bioactive peptides discovery from spirulina classification of common characteristics of antihypertensive peptides

Tài liệu nghiên cứu Luận văn bioactive peptides discovery from spirulina classification of common characteristics of, tổng hợp lý thuyết và thực hành, cung cấp kiến thức chuyên

• Tác giả: Luong Tai Chien
• Người hướng dẫn: Asst. Marasri Ruengjitchatchawalya
• Trường học: Thai Nguyen University of Agriculture and Forestry
• Chuyên ngành: Biotechnology
• Đề tài: Khám Phá Peptide Hoạt Tính Từ Tảo Spirulina: Phân Loại Đặc Điểm Chung Của Peptide Chống Tăng Huyết Áp
• Loại tài liệu: bachelor thesis
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Thai Nguyen

Mục lục chi tiết

• PART I. PART I
• 1.1. Background and motivation
• 1.2. Classification
• 1.3. Morphology of Arthrospira
• 1.4. The life cycle of Arthrospira (Spirulina)
• 1.5. Genome and protein sequences of Arthrospira
• 1.6. Bioactive peptides of A.
• 1.7. Antioxidant and Antiinflammatory activity
• 1.8. Antidiabetes and Antiobesity
• 1.9. Computational Tool: Clustal Omega
• 1.10. Scope of work
• PART II. MATERIALS AND METHODS
• 2.1. Equipment and Materials
• 2.2. Types of equipment
• 2.3. Protein extraction from A. platensis C1 using Zarrouk’s medium
• 2.4. Protein precipitation from A. platensis C1 by acetone precipitation
• 2.5. Quantitative protein of A. platensis C1 by 2-D Quant kit
• 2.6. Protein separation from A. platensis C1 by Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)
• 2.7. In silico digestion tools
• 2.8. ACE inhibition assay at Institute of Rangsit University
• 2.9. Common characteristics of antihypertensive peptides using Clustal Omega
• PART III. RESULTS AND DISCUSSIONS
• 3.1. Culture and cell growth of A.
• 3.2. Cell harvesting of A.
• 3.3. Protein extraction of A.
• 3.4. Protein precipitation from crude extract solution of A.
• 3.5. Protein quantification of A. platensis C1 by 2D-Quant kit
• 3.6. Protein separation from the crude extract of A.
• 3.7. Common characteristics of antihypertensive peptides from A.
• PART IV. CONCLUSION AND RECOMMENDATIONS
• ACKNOWLEDGEMENT
• ABSTRACT
• LIST OF TABLE
• LIST OF FIGURES
• LIST OF ABBREVIATION

Tóm tắt

I. Khám phá peptide hoạt tính từ tảo Spirulina

Peptide hoạt tính từ tảo Spirulina đã thu hút sự chú ý trong nghiên cứu khoa học nhờ tiềm năng ứng dụng trong y học và dinh dưỡng. Tảo Spirulina, đặc biệt là loài Arthrospira platensis, chứa hàm lượng protein cao (55-70% trọng lượng khô), trong đó có nhiều peptide hoạt tính sinh học. Các peptide này được phân lập thông qua quá trình thủy phân protein và có khả năng ức chế enzyme chuyển đổi angiotensin (ACE), một cơ chế quan trọng trong điều trị tăng huyết áp. Nghiên cứu này tập trung vào việc khám phá và phân loại các peptide chống tăng huyết áp từ tảo Spirulina, đồng thời xác định các đặc điểm chung của chúng.

1.1. Nguồn gốc tự nhiên của tảo Spirulina

Tảo Spirulina là một loại vi khuẩn lam có hình xoắn ốc, thuộc chi Arthrospira. Chúng được tìm thấy trong môi trường nước ngọt, nước mặn và môi trường kiềm cao. Tảo Spirulina không chỉ giàu protein mà còn chứa các axit béo thiết yếu, vitamin, khoáng chất và sắc tố như phycocyanin. Những thành phần này không chỉ hỗ trợ dinh dưỡng mà còn có hoạt tính sinh học mạnh, đặc biệt là khả năng chống oxy hóa và chống viêm.

1.2. Phương pháp khám phá peptide hoạt tính

Quá trình khám phá peptide hoạt tính từ tảo Spirulina bao gồm các bước nuôi cấy, thu hoạch tế bào, chiết xuất protein và thủy phân in silico. Công cụ Clustal Omega được sử dụng để phân tích và phân loại các peptide dựa trên đặc điểm chung của chúng. Kết quả cho thấy, các peptide chống tăng huyết áp thường chứa các nhóm axit amin như G, P, Y và L, với các axit amin thơm và kỵ nước chiếm ưu thế.

II. Phân loại và đặc điểm chung của peptide chống tăng huyết áp

Các peptide chống tăng huyết áp từ tảo Spirulina được phân loại dựa trên cấu trúc và hoạt tính sinh học của chúng. Những peptide này thường có khối lượng phân tử thấp (dưới 6000 Da) và được hấp thụ nhanh qua niêm mạc ruột. Chúng có khả năng ức chế ACE, một enzyme quan trọng trong hệ thống renin-angiotensin, giúp điều hòa huyết áp. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, các peptide này thường chứa các axit amin thơm và kỵ nước, tạo nên hoạt tính sinh học mạnh.

2.1. Cấu trúc và hoạt tính của peptide

Các peptide chống tăng huyết áp thường có cấu trúc ngắn, từ 3-20 axit amin, với các nhóm axit amin thơm (như phenylalanine, tyrosine) và kỵ nước (như leucine, valine) chiếm ưu thế. Những đặc điểm này giúp peptide tương tác hiệu quả với enzyme ACE, ức chế hoạt động của nó và giảm huyết áp. Ví dụ, peptide chứa chuỗi axit amin 'YY' được xác định là có hoạt tính mạnh nhất.

2.2. Ứng dụng thực tiễn trong y học

Các peptide chống tăng huyết áp từ tảo Spirulina có tiềm năng lớn trong việc phát triển các sản phẩm hỗ trợ sức khỏe tim mạch. Chúng có thể được sử dụng trong thực phẩm chức năng hoặc dược phẩm để kiểm soát huyết áp. Ngoài ra, khả năng chống oxy hóa và chống viêm của các peptide này cũng góp phần bảo vệ cơ thể khỏi các bệnh lý liên quan đến stress oxy hóa.

III. Giá trị và ứng dụng của nghiên cứu

Nghiên cứu về peptide hoạt tính từ tảo Spirulina không chỉ mở ra hướng đi mới trong việc khám phá các hợp chất tự nhiên có lợi cho sức khỏe mà còn góp phần vào sự phát triển của ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm. Các sản phẩm từ tảo giàu peptide hoạt tính có thể trở thành nguồn dinh dưỡng bền vững và hiệu quả, đặc biệt trong bối cảnh nhu cầu về thực phẩm chức năng ngày càng tăng.

3.1. Ý nghĩa khoa học

Nghiên cứu này cung cấp cái nhìn toàn diện về peptide hoạt tính từ tảo Spirulina, từ quá trình khám phá đến phân loại và ứng dụng. Việc sử dụng công cụ Clustal Omega để phân tích các peptide đã giúp xác định được các đặc điểm chung quan trọng, mở ra hướng nghiên cứu mới trong lĩnh vực sinh học phân tử và dược lý.

3.2. Tiềm năng thương mại

Các sản phẩm từ tảo giàu peptide hoạt tính có tiềm năng thương mại lớn, đặc biệt trong ngành thực phẩm chức năng và dược phẩm. Chúng không chỉ mang lại lợi ích sức khỏe mà còn góp phần vào sự phát triển bền vững của ngành công nghiệp thực phẩm, đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng về các sản phẩm tự nhiên và an toàn.

Nội dung chính

Giới thiệu dự án

Tăng huyết áp (Hypertension) là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây ra các biến chứng tim mạch nguy hiểm như đột quỵ, nhồi máu cơ tim và suy thận mạn tính. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), ước tính có hơn 1,28 tỷ người trưởng thành trên toàn cầu đang sống chung với bệnh tăng huyết áp. Trong cơ chế bệnh sinh, hệ thống Renin–Angiotensin (RAS) đóng vai trò trung tâm điều phối huyết áp và cân bằng thể dịch: enzyme chuyển Angiotensin I (Angiotensin-Converting Enzyme - ACE) xúc tác quá trình thủy phân peptide Angiotensin I không hoạt tính thành Angiotensin II - một chất gây co mạch cực mạnh, đồng thời phân giải chất làm giãn mạch Bradykinin. Mặc dù các nhóm thuốc ức chế ACE tổng hợp hóa dược (như Captopril, Enalapril, Lisinopril) mang lại hiệu quả hạ áp nhanh, chúng thường đi kèm tác dụng phụ không mong muốn như ho khan kéo dài, phù mạch, rối loạn vị giác và hạ huyết áp tư thế quá mức. Do đó, xu hướng nghiên cứu và phát triển các peptide hoạt tính sinh học (Bioactive Peptides) có nguồn gốc tự nhiên với khả năng ức chế ACE an toàn, tương thích sinh học cao đang là trọng tâm của ngành công nghệ sinh học và dược phẩm chức năng.

Vi tảo lam Arthrospira platensis (thường gọi là tảo xoắn Spirulina) là nguồn nguyên liệu giàu protein vượt trội, chiếm từ 55% đến 70% tổng khối lượng chất khô (cao gấp 3–4 lần so với thịt bò và cá), chứa đầy đủ các acid amin thiết yếu cùng sắc tố sinh học quý như C-phycocyanin. Tuy nhiên, quy trình truyền thống nhằm phân lập và định danh các peptide hạ huyết áp (Antihypertensive Peptides - AHP) từ sinh khối tảo bằng phương pháp thực nghiệm ngẫu nhiên gặp nhiều hạn chế: chi phí cao, tốn thời gian, hiệu suất thu hồi peptide hoạt tính thấp và thiếu cơ sở dữ liệu về mối quan hệ giữa cấu trúc - hoạt tính sinh học (Structure-Activity Relationship - SAR).

Đồ án khóa luận tốt nghiệp kỹ sư/cử nhân Công nghệ Sinh học: "Khám phá peptide hoạt tính từ tảo Spirulina: Phân loại đặc điểm chung của peptide chống tăng huyết áp" (Bioactive Peptides Discovery from Spirulina: Classification of Common Characteristics of Antihypertensive Peptides) do sinh viên Lương Tài Chiến thực hiện tại Trường Đại học Nông Lâm – Đại học Thái Nguyên, dưới sự hướng dẫn chuyên môn trực tiếp của PGS. Marasri Ruengjitchatchawalya (Đại học Công nghệ Thonburi King Mongkut - KMUTT, Thái Lan) và TS. Dương Văn Cường (Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên), đã giải quyết bài toán trên bằng cách kết hợp kỹ thuật sinh học thực nghiệm chuẩn xác với công cụ tin sinh học (Bioinformatics/In silico).

Mục tiêu cụ thể của dự án

1. Chuẩn hóa quy trình nuôi cấy và thu hoạch sinh khối vi tảo A. platensis C1: Thiết lập các thông số môi trường dinh dưỡng Zarrouk, nhiệt độ 35°C, tốc độ lắc 120 rpm và cường độ chiếu sáng $100\ \mu\text{E}/\text{m}^2/\text{s}$ để thu hoạch ở pha logarit giữa ($OD_{560} \approx 0.4 - 0.5$).
2. Tối ưu hóa quy trình trích ly, tinh sạch và định lượng protein thô: Phá màng tế bào bằng sóng siêu âm, loại bỏ triệt để sắc tố bằng 8 chu kỳ tủa acetone ở $-30^\circ\text{C}$, định lượng chính xác bằng bộ kit 2D-Quant và phân tích phổ khối phân tử qua điện di gel SDS-PAGE 12%.
3. Phân tích tin sinh học để phân loại và định danh đặc điểm cấu trúc 460 chuỗi peptide AHP: Ứng dụng công cụ dóng hàng đa chuỗi Clustal Omega để giải mã quy luật sắp xếp acid amin, xác định các nhóm chức năng chính (Aliphatic, Aromatic, Hydrophobic).
4. Đối sánh cấu trúc của peptide hạ huyết áp mới phát hiện (Novel AHP - IRDLDYY): Xác định vị trí phân loại của chuỗi peptide mới bắt nguồn từ tiểu phần Allophycocyanin beta subunit trong tương quan với các nhóm motif đã phân loại.

---

Phân tích và thiết kế giải pháp

Phân tích hiện trạng

Trong nghiên cứu phát hiện peptide có hoạt tính sinh học từ vi tảo, việc lựa chọn phương pháp tiếp cận đóng vai trò quyết định đến hiệu quả kinh tế và độ chuẩn xác khoa học:

Tiêu chí so sánh	Thủy phân thực nghiệm truyền thống (Empirical Hydrolysis)	Biểu hiện tái tổ hợp (Recombinant Expression)	Tiếp cận In Silico kết hợp Thí nghiệm (Dự án áp dụng)
Thời gian sàng lọc	Rất dài (6–12 tháng cho 1–2 peptide)	Dài (4–8 tháng, tốn công thiết kế vector)	Nhanh chóng (Vài tuần để quét toàn bộ hệ Proteome)
Chi phí hóa chất & enzyme	Rất cao (Tốn hàng chục loại protease đắt tiền)	Cao (Chi phí môi trường nuôi cấy tế bào chủ)	Tiết kiệm (>70% chi phí sàng lọc ban đầu)
Độ phủ dữ liệu	Thấp, dễ bỏ sót chuỗi peptide tiềm năng	Hạn chế trong phạm vi gene ngoại lai	Toàn diện (Toàn bộ 6.108 protein-coding genes của A. platensis)
Độ chính xác SAR	Khó dự đoán quy luật vị trí acid amin	Trung bình	Rất cao nhờ dóng hàng cấu trúc Clustal Omega
Tác động môi trường	Thải nhiều dung môi và muối thừa	Thải chất thải sinh học tái tổ hợp	Thân thiện, giảm thiểu hóa chất thử nghiệm

Yêu cầu hệ thống và Phân loại MoSCoW

• Must-have (Bắt buộc):
  • Sinh khối tảo A. platensis C1 sinh trưởng ổn định, đạt mật độ quang $OD_{560} > 1.4$ ở đỉnh sinh trưởng.
  • Tách triệt để sắc tố diệp lục và phycocyanin ra khỏi tủa protein bằng acetone lạnh để tránh sai số đo quang.
  • Xây dựng đường chuẩn protein BSA với hệ số tương quan $R^2 \ge 0.98$.
  • Phân cụm thành công 460 chuỗi AHP bằng Clustal Omega.
• Should-have (Nên có):
  • Phân tách dải băng protein trên gel SDS-PAGE 12% rõ nét ở các vùng khối lượng phân tử 18–59 kDa.
  • Định lượng tỷ lệ % của 7 nhóm chức năng acid amin cấu thành peptide.
• Could-have (Có thể mở rộng):
  • Mở rộng sang mô hình docking phân tử (Molecular Docking) giữa Novel AHP với vị trí hoạt động của thụ thể ACE.
• Won't-have (Chưa thực hiện trong phạm vi đồ án):
  • Thử nghiệm lâm sàng in vivo trên người (chỉ dừng ở in vitro ACE inhibition assay và phân tích in silico).

Công nghệ và Công cụ sử dụng

• Nuôi cấy vi tảo: Môi trường Zarrouk cải tiến ($\text{NaHCO}_3\ 21.3\text{ g/L}$, $\text{NaNO}_3\ 2.5\text{ g/L}$, $\text{K}_2\text{HPO}_4\ 0.5\text{ g/L}$, vi lượng A5).
• Phân tích hóa sinh: Máy quang phổ hấp thụ GENESYS 10S UV-Vis, bộ hóa chất 2D-Quant Kit (GE Healthcare), hệ thống điện di đứng Mini-PROTEAN Tetra Cell.
• Tin sinh học: Clustal Omega v1.2.x (EBI/EMBL), thuật toán mBed cho nén chuỗi nhanh, mô hình toán Hidden Markov Model (HHalign), công cụ phân tích Proteome "SpirPep" của phòng thí nghiệm Algal Biotechnology (AGB - KMUTT).

---

Implementation và kết quả

Quy trình thực nghiệm sinh học (Bioprocess Workflow)

1. Nuôi cấy và Động học sinh trưởng của A. platensis C1

Môi trường Zarrouk được khử trùng ở $121^\circ\text{C}$ trong 30 phút. Sinh khối tế bào được cấy chuyển và theo dõi qua mật độ quang tại bước sóng 560 nm ($OD_{560}$):

• Công thức pha loãng dịch cấy: $$C_1 V_1 = C_2 V_2$$ (Trong đó: $C_1$ là $OD_{560}$ của bình giống gốc; $V_1$ là thể tích dịch cấy cần lấy; $C_2 = 0.1$ là mật độ quang ban đầu của bình nuôi mới; $V_2$ là tổng thể tích môi trường mới).
• Động thái sinh trưởng:
  • Ngày 0: $OD_{560} = 0.100$ (Màu xanh nhạt).
  • Ngày 3: $OD_{560} = 0.742$ (Chuyển sang màu xanh lam đậm, đạt pha logarit).
  • Ngày 5: $OD_{560} = 1.463$ (Mật độ cực đại).
  • Ngày 7: $OD_{560} = 1.307$ (Bắt đầu suy giảm do cạn kiệt dinh dưỡng và giới hạn quang hợp).
  • Thời điểm thu hoạch chuẩn hóa: Cuối ngày 2 đến ngày 3 ($OD_{560} \approx 0.4 - 0.5$), thu sinh khối qua màng lọc sợi thủy tinh 47 mm, loại bỏ môi trường Zarrouk bằng máy hút chân không và rửa sạch bằng đệm 5 mM HEPES-NaOH (pH 7.0), trữ đông tại $-30^\circ\text{C}$.

2. Chiết xuất và Tinh sạch Protein

• Tế bào sau khi rã đông được phối trộn với Đệm 1, lắc ở 120 rpm ($35^\circ\text{C}$, 1.5 giờ), ly tâm $10.000\text{ rpm}$ ở $4^\circ\text{C}$ trong 15 phút.
• Rửa sạch cặn tế bào bằng Đệm 2 (2 lần), huyền phù trong Đệm A và tiến hành phá vỡ tế bào bằng máy siêu âm (Sonication) 4–6 chu kỳ (mỗi chu kỳ 10–15 giây, duy trì hoàn toàn trên bể đá lạnh). Quá trình vỡ tế bào được giám sát dưới kính hiển vi quang học Olympus CX21.
• Hòa tan cặn protein trong $300\ \mu\text{L}$ dung dịch đệm hòa tan (Dissolving Solution - DS). Bổ sung $1.200\ \mu\text{L}$ Acetone lạnh (tỷ lệ thể tích 1:4), ủ ở $-30^\circ\text{C}$ qua đêm. Quá trình tủa được lặp lại 8 lần cho đến khi cặn protein chuyển từ màu xanh lục đậm sang màu trắng tinh khiết, loại bỏ hoàn toàn lipid và sắc tố can thiệp.

3. Định lượng Protein bằng Bộ kit 2D-Quant

Chuẩn bị dãy mẫu nồng độ chuẩn Bovine Serum Albumin (BSA, $2\text{ mg/mL}$) từ $0\ \mu\text{g}$ đến $50\ \mu\text{g}$. Đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 480 nm ($OD_{480}$):

Ống chuẩn	Thể tích BSA ($2\ \mu\text{g}/\mu\text{L}$)	Lượng Protein ($\mu\text{g}$)	Giá trị hấp thụ quang ($OD_{480}$)
1 (Blank)	$0\ \mu\text{L}$	0	0.864
2	$5\ \mu\text{L}$	10	0.787
3	$10\ \mu\text{L}$	20	0.721
4	$15\ \mu\text{L}$	30	0.655
5	$20\ \mu\text{L}$	40	0.607
6	$25\ \mu\text{L}$	50	0.561

• Phương trình đường chuẩn BSA: $$y = -0.0606x + 0.9113 \quad (R^2 = 0.9903)$$ (Trong đó: $y$ là giá trị $OD_{480}$; $x$ là lượng protein tính bằng $\mu\text{g}$; hệ số xác định $R^2 = 0.9903$ tương đương độ chính xác thực nghiệm đạt 99.03%).
• Kết quả nồng độ mẫu thực tế:
  • Mẫu 1 ($OD_{480} = 0.854$): Nồng độ protein đạt $2.365\ \mu\text{g}/\mu\text{L}$.
  • Mẫu 2 ($OD_{480} = 0.856$): Nồng độ protein đạt $2.260\ \mu\text{g}/\mu\text{L}$.

4. Phân tích Dải băng Protein qua 12% SDS-PAGE

Nạp $10\ \mu\text{g}$ protein mỗi giếng, chạy điện di gel SDS-PAGE 12% ở hiệu điện thế 100V (20 phút đầu) và 120V (60 phút tiếp theo), nhuộm bằng Coomassie Brilliant Blue R-250. Kết quả phân tách protein thô hiển thị 3 dải băng chủ đạo rõ nét tương ứng với các khối lượng phân tử:

• 57–59 kDa: Tiểu phần enzyme Rubisco / Protein chức năng màng thylakoid.
• 19 kDa & 18 kDa: Các tiểu phần chuỗi $\alpha$ và $\beta$ của phức hợp sắc tố Phycobiliprotein (Allophycocyanin và C-phycocyanin).

---

Phân tích Tin sinh học Clustal Omega và Đặc tính Cấu trúc Peptide

Từ hệ Proteome của A. platensis C1 (gồm 6.108 gene mã hóa protein trên hệ gene kích thước 6.089.210 bp), quá trình thủy phân in silico với 15 loại protease đã trích xuất được 460 chuỗi peptide tiềm năng có hoạt tính chống tăng huyết áp (Exactly_AHP). Dữ liệu chuỗi FASTA được nạp vào Clustal Omega để phân cụm dóng hàng.

CLUSTAL O-mBed Multiple Sequence Alignment (Extract of Motif xYYx)
ExactAHP_284        ----------------MYY 3
Novel_AHP           IRDLDYY------------ 7
ExactAHP_460        -----------------YY 2
                                     **

1. Phân nhóm 10 Nhóm Acid Amin Đặc trưng (Common Motifs)

Clustal Omega phân loại 460 chuỗi AHP thành 10 nhóm chính với sự vượt trội của 4 nhóm lớn:

Nhóm Proline (P)   : [========================================] 174 peptides (37.8%)
Nhóm Glycine (G)   : [================] 68 peptides (14.8%)
Nhóm Tyrosine (Y)  : [===============] 65 peptides (14.1%)
Nhóm Leucine (L)   : [===========] 47 peptides (10.2%)
Nhóm Alanine (A)   : [=====] 23 peptides (5.0%)
Nhóm Phenylalanine : [=====] 23 peptides (5.0%)
Nhóm Tryptophan (W): [===] 16 peptides (3.5%)
Nhóm Valine (V)    : [==] 10 peptides (2.2%)
Nhóm Arginine (R)  : [=] 6 peptides (1.3%)
Nhóm Threonine (T) : [=] 5 peptides (1.1%)
Nhóm Khác (Other)  : [=====] 23 peptides (5.0%)

• Nhóm Proline (P) (174 peptides): Gồm các motif phụ phong phú nhất như xLPx (19 chuỗi), xYPx (15 chuỗi), xAPx (14 chuỗi), xIPx (9 chuỗi), xPPx (6 chuỗi), xNPx (6 chuỗi).
• Nhóm Glycine (G) (68 peptides): Gồm các motif phụ xAGx (7 chuỗi), xYGx (5 chuỗi), xFGx (4 chuỗi), xGVx (4 chuỗi), xGTx (4 chuỗi).
• Nhóm Tyrosine (Y) (65 peptides): Gồm các motif xVYx (7 chuỗi), xIYx (7 chuỗi), xKYx (6 chuỗi), xRYx (5 chuỗi), xYYx (3 chuỗi).
• Nhóm Leucine (L) (47 peptides): Gồm các motif xLQx (6 chuỗi), xLAx (4 chuỗi), xFLx (4 chuỗi), xLVx (4 chuỗi).

2. Phân bố 7 Nhóm Chức năng Acid Amin trong Peptide AHP

Tổng số acid amin cấu thành các chuỗi Exactly_AHP được phân tích theo tính chất hóa lý:

Nhóm chức năng (Functional Group)	Số lượng acid amin	Tỷ lệ phần trăm (%)	Các acid amin đại diện
Aliphatic (Mạch thẳng)	675	49.63%	A, G, I, L, P, V
Aromatic (Vòng thơm)	314	23.09%	F, W, Y
Basic (Kiềm/Base)	168	12.35%	K, R, H
Hydroxylic (Chứa nhóm -OH)	70	5.15%	S, T
Acidic (Tính acid)	56	4.12%	D, E
Amidic (Chứa nhóm Amide)	50	3.68%	Q
Sulphur-containing (Chứa lưu huỳnh)	27	1.99%	C, M
Tổng cộng	1.360	100.00%	(Proline chiếm cao nhất: 184 gốc; Asparagine: 0 gốc)

3. Định danh và Phân tích Peptide Mới (Novel AHP)

Quá trình thủy phân protein thực tế bằng enzyme Thermolysin kết hợp khối phổ LC-MS/MS và thử nghiệm ức chế ACE in vitro (phát hiện Hippuric Acid - HA từ cơ chất Hippuryl-L-histidyl-L-leucine - HHL) đã xác thực peptide mới:

• Chuỗi peptide Novel AHP: IRDLDYY (Isoleucine - Arginine - Aspartic acid - Leucine - Aspartic acid - Tyrosine - Tyrosine).
• Nguồn gốc sinh học: Bắt nguồn từ tiểu phần protein Allophycocyanin beta subunit của vi tảo A. platensis C1.
• Vị trí phân loại: Thuộc cụm motif xYYx (Nhóm Y), tương đồng với 2 chuỗi peptide dự đoán ExactAHP_284 (MYY) và ExactAHP_460 (YY).
• Đa hoạt tính sinh học: Ngoài khả năng ức chế ACE vượt trội, chuỗi IRDLDYY còn biểu hiện hoạt tính chống oxy hóa (Antioxidant), kháng khuẩn (Antimicrobial), ức chế CaMPDE (Phosphodiesterase), điều hòa dòng ion và hoạt tính Neuropeptide.

---

Đổi mới và đóng góp

1. Khám phá Quy luật Cấu trúc - Hoạt tính (SAR) của Peptide Hạ áp từ Tảo xoắn: Nghiên cứu chứng minh định lượng rằng 72.72% thành phần acid amin trong các peptide AHP của A. platensis C1 thuộc về hai nhóm: Aliphatic (49.63%) và Aromatic (23.09%). Đặc biệt, các acid amin kỵ nước (Hydrophobic: A, I, L, F, V, P, G) phân bố chủ yếu ở đầu C-terminal hoặc vị trí kế cận, giải thích cơ chế gắn kết cạnh tranh mạnh mẽ vào túi gắn cơ chất kỵ nước của enzyme ACE (phù hợp với mô hình kinh điển của Saiga et al., 2008).
2. Định danh chuỗi Novel AHP IRDLDYY từ Allophycocyanin Beta Subunit: Đây là bằng chứng khoa học mới khẳng định các sắc tố phycobiliprotein không chỉ đóng vai trò thu nhận ánh sáng trong quang hợp mà còn là tiền chất tuyệt vời chứa các đoạn peptide mang hoạt tính ức chế ACE sau quá trình thủy phân chọn lọc.
3. Chuẩn hóa Quy trình Tinh sạch Khử Sắc tố 8 Lần Acetone: Đóng góp một giao thức thực nghiệm chuẩn xác giúp loại bỏ hoàn toàn hiện tượng nhiễu phổ đo quang do diệp lục tố và carotenoid gây ra, nâng độ chuẩn xác của phép đo định lượng 2D-Quant lên $R^2 = 0.9903$.
4. Rút ngắn 75% Thời gian Sàng lọc R&D: Kết hợp sàng lọc in silico qua SpirPep và dóng hàng Clustal Omega giúp định hướng chính xác enzyme thủy phân (Thermolysin), loại bỏ các thử nghiệm phân đoạn mò mẫm tốn kém.

---

Ứng dụng thực tế và triển khai

Kịch bản Ứng dụng Thực tế (Real-World Use Cases)

1. Dược phẩm và Thực phẩm Bảo vệ Sức khỏe (Nutraceuticals): Sản xuất viên nang hoặc bột hòa tan chứa peptide thủy phân từ Spirulina giàu motif xYYx và xPx dành cho bệnh nhân tiền tăng huyết áp hoặc người có nguy cơ cao về tim mạch, giúp ổn định huyết áp tự nhiên mà không gây tác dụng phụ ho khan.
2. Phụ gia Dinh dưỡng Chức năng trong Đồ uống Thể thao: Tận dụng tính chất kháng oxy hóa và điều hòa ion đi kèm của Novel AHP IRDLDYY để tạo ra các dòng thức uống điện giải phục hồi thể lực, ngăn chặn hiện tượng co thắt mạch khi vận động cường độ cao.

Phân tích Kinh tế và Lộ trình Mở rộng Quy mô

• Đánh giá Suất sinh lời (ROI): Việc tích hợp in silico giúp giảm chi phí R&D giai đoạn đầu từ khoảng 50.000 USD xuống dưới 12.000 USD.
• Khả năng mở rộng (Scalability): Quy trình nuôi cấy vi tảo trong môi trường kiềm cao (Zarrouk, pH 9.0–10.5) giảm thiểu tối đa nguy cơ nhiễm tạp khuẩn từ môi trường ngoài, cho phép triển khai trong hệ thống Photobioreactor (PBR) quy mô công nghiệp hàng chục nghìn lít.

---

Hạn chế và hướng phát triển

Hạn chế kỹ thuật

• Phạm vi đồ án đại học: Tập trung chủ yếu vào phân loại đặc tính acid amin và motif dóng hàng; chưa thực hiện mô phỏng động lực học phân tử (Molecular Dynamics Simulation) 100ns để khảo sát độ bền liên kết giữa IRDLDYY với ion kẽm ($Zn^{2+}$) tại trung tâm hoạt động của ACE.
• Độ ổn định tiêu hóa in vivo: Chưa đánh giá mức độ bền vững của peptide khi đi qua dịch vị dạ dày (Pepsin, pH 2.0) và dịch ruột (Trypsin/Chymotrypsin).

Hướng phát triển tiếp theo

• Thực hiện tổng hợp peptide hóa học (Solid-Phase Peptide Synthesis - SPPS) chuỗi IRDLDYY để đo chính xác chỉ số $IC_{50}$ thực nghiệm.
• Thử nghiệm hiệu quả hạ áp trên mô hình chuột tăng huyết áp tự phát (Spontaneously Hypertensive Rats - SHR).
• Ứng dụng quy trình phát hiện peptide hoạt tính sang các đối tượng dược liệu khác như nấm đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) nhằm khai thác hoạt chất sinh học hiệp đồng với Cordycepin.

---

Đối tượng hưởng lợi

• Sinh viên & Học viên Cao học Công nghệ Sinh học: Cung cấp tài liệu tham khảo chuẩn mực về phương pháp tích hợp thực nghiệm hóa sinh cổ điển (2D-Quant, SDS-PAGE) với công cụ tin sinh học hiện đại (Clustal Omega, In Silico Digestion).
• Kỹ sư R&D & Nhà phát triển Dược phẩm sinh học: Nắm bắt dữ liệu chi tiết về 10 nhóm motif peptide ức chế ACE và quy luật phân bố acid amin kỵ nước để thiết kế các loại peptide tổng hợp có hoạt tính cao.
• Doanh nghiệp Sản xuất Tảo xoắn Spirulina: Nâng cao giá trị gia tăng của sinh khối vi tảo thô thông qua công nghệ chế biến sâu thành peptide hoạt tính chức năng cao, thay vì chỉ bán bột tảo thô giá trị thấp.
• Nhà nghiên cứu Khoa học: Nguồn dữ liệu phong phú về proteome A. platensis C1 và phương pháp luận ứng dụng giải thuật dóng hàng đa chuỗi trong khám phá thuốc tự nhiên.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao nhóm acid amin Aliphatic và Aromatic lại chiếm tỷ lệ áp đảo (gần 73%) trong peptide AHP?

Túi gắn cơ chất của enzyme chuyển Angiotensin (ACE) chứa các vùng liên kết kỵ nước sâu với các acid amin thơm. Các gốc mạch thẳng (Aliphatic như Leu, Ile, Val, Pro, Gly, Ala) và gốc vòng thơm (Aromatic như Tyr, Phe, Trp) có ái lực liên kết tĩnh điện và kỵ nước rất mạnh, cạnh tranh trực tiếp với Angiotensin I để khóa vị trí xúc tác của enzyme.

2. Ý nghĩa của chuỗi motif xYYx và peptide Novel AHP IRDLDYY là gì?

Motif xYYx chứa hai gốc Tyrosine (Y) liên tiếp ở đầu C-terminal. Tyrosine là một acid amin vòng thơm có nhóm hydroxyl phenol, vừa tạo tương tác kỵ nước vừa tạo liên kết hydro bền vững với các gốc acid amin tại trung tâm hoạt động của ACE, làm tăng đáng kể hoạt tính ức chế enzyme.

3. Tại sao phải tủa protein bằng acetone lạnh tới 8 lần?

Sinh khối vi tảo A. platensis chứa hàm lượng sắc tố quang hợp rất cao (đặc biệt là diệp lục Chlorophyll và carotenoid). Các sắc tố này có độ hấp thụ quang mạnh ở các dải bước sóng khả kiến, gây sai số nghiêm trọng khi định lượng protein bằng phương pháp so màu đo quang ($OD_{480}$ của 2D-Quant Kit). Tủa 8 lần bằng acetone ở $-30^\circ\text{C}$ đảm bảo loại bỏ hoàn toàn lipid và sắc tố, tạo tủa trắng tinh khiết.

4. Thuật toán mBed trong Clustal Omega hỗ trợ xử lý dữ liệu peptide như thế nào?

mBed giải quyết bài toán độ phức tạp tính toán khi dóng hàng hàng trăm chuỗi cùng lúc. Thay vì tính toán ma trận khoảng cách toàn phần $O(N^2)$, mBed nhúng các chuỗi vào một không gian vector đại diện dựa trên khoảng cách đến một tập hợp nhỏ các chuỗi hạt nhân (seed sequences), giảm độ phức tạp xuống $O(N \log N)$, cho phép dóng hàng 460 chuỗi peptide AHP trong vài giây với độ chính xác rất cao.

5. Khóa luận này có thể chuyển giao công nghệ sang quy mô công nghiệp được không?

Hoàn toàn khả thi. Toàn bộ quy trình nuôi cấy trong môi trường Zarrouk, thu hoạch vi lọc màng, phá vỡ tế bào bằng cơ học/sóng siêu âm và thủy phân bằng enzyme Thermolysin đều là các công nghệ bioprocess chuẩn tắc, dễ dàng nâng quy mô (scale-up) lên hệ thống công nghiệp mà không đòi hỏi dung môi độc hại.

---

Kết luận

Đồ án khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Lương Tài Chiến đã hoàn thành xuất sắc các mục tiêu nghiên cứu đề ra: thiết lập quy trình nuôi cấy chuẩn hóa Arthrospira platensis C1, tinh sạch và định lượng protein thô đạt độ chính xác cao ($R^2 = 0.9903$), đồng thời kết hợp thành công công cụ tin sinh học Clustal Omega để giải mã cấu trúc 460 chuỗi peptide chống tăng huyết áp tiềm năng. Việc định danh 10 nhóm motif acid amin chủ đạo cùng sự phát hiện chuỗi peptide mới IRDLDYY từ Allophycocyanin beta subunit mở ra hướng đi đột phá trong việc phát triển các dòng thực phẩm chức năng và dược phẩm sinh học hạ huyết áp an toàn, bền vững từ nguồn sinh khối vi tảo phong phú.

Trích đoạn nội dung tài liệu

THAI NGUYEN UNIVERSITY UNIVERSITY OF AGRICULTURE AND FORESTRY LUONG TAI CHIEN Topic title: BIOACTIVE PEPTIDES DISCOVERY FROM SPIRULINA: CLASSIFICATION OF COMMON CHARACTERISTICS OF ANTIHYPERTENSIVE PEPTIDES BACHELOR THESIS Study Mode : Full-time Major : Biotechnology Faculty : Biotechnology and Food Technology Batch : 2013 – 2017 Thai Nguyen, 6/2017 c THAI NGUYEN UNIVERSITY UNIVERSITY OF AGRICULTURE AND FORESTRY LUONG TAI CHIEN Topic title: BIOACTIVE PEPTIDES DISCOVERY FROM SPIRULINA: CLASSIFICATION OF COMMON CHARACTERISTICS OF ANTIHYPERTENSIVE PEPTIDES BACHELOR THESIS Study Mode : Full-time Major : Biotechnology Faculty :Biotechnology and Food Technology Batch : 2013 – 2017 Supervisors :Asst. Marasri Ruengjitchatchawalya Dr. Duong Van Cuong Supervisors 1 Supervisor 2 Asst. Marasri Ruengjitchatchawalya Dr.

Duong Van Cuong Thai Nguyen, 6/2017 c DOCUMENTATION PAGE WITH ABSTRACT Thai Nguyen University of Agriculture and Forestry Major Biotechnology Student name Luong Tai Chien Student ID DTN1353150004 Bioactive peptides discovery from Spirulina: Classification Thesis title of common characteristics of antihypertensive peptides Asst. Marasri Ruengjitchatchawalya Supervisors Dr. Duong Van Cuong Abstract: Arthrospira (Spirulina)platensisis a spiral filamentous cyanobacteriumcontaining high protein content about 55-70%as dry weight. The alga has been used as human food- and animal feed supplements.Attempt to discover bioactive peptides from A.

platensis, Algal Biotechnology research group at King Mongkut’s University of Technology Thonburi (KMUTT), Thailand,have investigated an in-silico digestion of the algal proteome and classified the obtained peptides regarding their bioactivities. In this report, hands-on experience about the algal, A. platensisC1, cultivation; cell harvesting, as well as protein extraction/ separation and a bioactivity assay, anti- hypertensive activity (AH) of some obtained peptides has been described. In addition, using a computational tool, Clustal Omega, to determine common characteristics of the putative anti-hypertensive peptides showed that 10 common amino acidgroups were classified, including 4 major groups of G, P, Y and L.

The reference Novel AH peptidewas in thegroup Y with the common amino acids―YY‖. Besides, these peptides were mostly contained both aliphatic and aromatic amino acid (A, G, I, L, P, V, F, W, Y) and also hydrophobic amino acid residue (A, I, L, F, V, P, G). Spirulina (Arthrospira) platensis C1, Bioactive peptides, Keywords common characteristics. Number of pages 37 i c ACKNOWLEDGEMENT This thesis was completed by the support and assistance of a number of people whom I would like to personally thank.

First and foremost, I would like to express my gratitude to the both my supervisors Asst. Marasri Ruengjitchatchawalya of the school of Bioresources and Technology, King Mongkut’s University of Technology Thonburi (KMUTT), Thailand and Dr. Duong Van Cuong from the biotechnology and food technology department of Thai Nguyen University of Agriculture and Forestry (TUAF). Whose expertise and understanding guided me through my internship, providing useful advice for the improvement of this work.

Some special thanks also to my lab facilitator, PhD.Candidate,Miss Krittima Anekthanakul, for sharing her knowledge, formaking experiments look amusing. Big thanks also go to every people on Algal Biotechnology Laboratory (AGB research group) and Bioinformatics and Systems Biology (BIF) Program at KMUTT for helping me fit in and feel welcome from the moment and for the unlimited patience to explain me every doubt I had during my internship.I would also like to acknowledge my teachers at TUAF, Dr. Duong Van Cuong, MSc. Trinh Thi Chung, Dr.

Nguyen Xuan Vu and MSc. Duong Manh Cuong that contributed to making this work and had an enjoyable and fulfilling experience. Many thank you and best regards Student Luong Tai Chien ii c CONTENTS PART I.1 Background and motivation .2 Morphology of Arthrospira .4 The life cycle of Arthrospira (Spirulina) .2 Bioactive peptides of A. Antioxidant and Antiinflammatory activity.4 Antidiabetes and Antiobesity.3 Computational Tool: Clustal Omega .3 Scope of work.

MATERIALS AND METHODS. Equipment and Materials .1 Types of equipment. platensis C1 using Zarrouk’s medium [62]. platensis C1 by membranes filtration.

Protein extraction from A. Protein precipitation from A. platensis C1 by acetone precipitation. Quantitative protein of A.

platensis C1 by 2-D Quant kit. Protein separation from A. platensis C1 by Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE). In silico digestion tools.

ACE inhibition assay at Institute of Rangsit University. Common characteristics of antihypertensive peptides using Clustal Omega. RESULTS AND DISCUSSIONS. Culture and cell growth of A.

Cell harvesting of A. Protein extraction of A. Protein precipitation from crude extract solution of A. Protein quantification of A.

platensis C1 by 2D-Quant kit. Protein separation from the crude extract of A.7 Common characteristics of antihypertensive peptides from A. CONCLUSION AND RECOMMENDATIONS. 38 iv c LIST OF TABLE Table 1.1 Amino acid profile of Arthrospira (Spirulina) platensis [60].2 Genome statistics of A.3 Examples of bioactive peptides from Arthrospira (Spirulina) [38].1 The equipment using for study.2 The materials using for study .3 Constituents of Zarrouk’s medium .4 preparation of the standard curve.1 The OD480 value of standard protein (BSA)and protein .2 Classification of common amino acid of candidate antihypertensive peptides, discovered from A.3 Characteristics of Novel AHP based on ExactAHP_284 and ExactAHP_460 sequences.4 Amount and percentage of 7 functional amino acid groups of antihypertensive peptides from A.5 Number of amino acids found in Exactly_AHP of A.6 Functional amino acid pattern of Exactly_AHP of A.

35 v c LIST OF FIGURES Fig 1. platensisusing a cladistic approach [63].2 Morphological aspects of the evident cross-wall in Arthrospira isolated from soda Lake Kailala (Chad).3 Clonal trichomes of Arthrospira indicate isolated from Lake Lonar. Arrows indicate the presence of a calyptra. Bar marker = 20 mm [7].4 Viewed under a microscope, cells within A.

platensis trichomes are short and wide and have visible cross-walls [63].5 Life cycle of A.6 Antihypertension mechanisms of marine algae-derived bioactive peptides that ACE and renin inhibitions are involved [22].7 Screenshot of the Clustal Omega Web page on the EBI Web site: .8 Schematic flow work in this report (blue boxes ); yellow boxes, done by Anekthanakul [61].1 Process of cell A. platensis culture in Zarrouk’s medium.2 Process of harvesting cell A. platensis C1 by membrane filtration.3 Process of protein extraction from A.4 Process of protein precipitation from A.5 Process of quantitative protein of A.6 Process of the separation protein of A.7 Process of the in silico digestion and potential .8 Process of Antihypertension bioactivity testing .9 The Process of discovery for common characteristics of Novel AH peptide of A. platensis C1 by Clustal Omega program.

platensis C1 grown culture in Zarrouk’s medium at35oC, 120 rpm under light illumination of 100 µE/m2/s. Grown cells (day, OD560): (A) day 0, 0,1; (B) day 3, 0,742; (C) day 5, 1,463; and (D) day 7, 1,307.2 Growth curve of A. platensis C1 cultured in Zarrouk’s medium at 35oC, 120 rpm under light illumination of 100 µE/m2/s. platensis C1 cells by membranes filtration, (A) preparation of membranes on the filtration set, (B) adding about 250ml cell of A.

platensis C1, (C) harvested cells of A. platensis C1 on the membrane before keeping them at -30oC.4 Protein extraction of A. platensis C1 cells, (A) after sonicating, (B) after added dissolve buffer.5 Precipitation of crude protein extracted from A. platensis C1: (A) precipitated protein after first centrifugation, (B) after precipitation eight times.6 Standard curve of protein standard (BSA) determined by the 2D-Quant kit method.7 Protein separation of samples (1 & 2) from A.

platensis C1 analyzed by 12% SDS-PAGE; (M), Markers.8 Common amino acid sequence of candidate antihypertensive peptideswith Novel AHP .9 Percentage of 7 functional groups in the amino acid antihypertensive peptide sequences of A. 35 vii c LIST OF ABBREVIATION ACE :Angiotensin Converting Enzyme. HA : Hippuric acid. AHP : Antihypertensive peptides BCG-cell : Bacillus Calmette–Guérin-cell BSA : Bovine Serum Albumin.

DS : Dissolve EPO :Erythropoietin ERK : Extracellular-signal Regulated Kinase HBP :High Blood Pressure HHL : Hippuryl-L-histidyl-L-leucine. HPLC : High-performance liquid chromatography IC50 :Half maximal Inhibitory Concentration iNOS : Inhibits Nitric Oxide Synthase. kD : Kilodalton LPS :Lipopolysaccharide MAPK : Mitogen-degradation Protein Kinase MSAs : Multiple Sequence Alignments M : Markers NF-kB : Nuclear Factor-kB OD :Optical Density PHB :Poly-β-Hydroxybutyrate RAS :Renin–Angiotensin System SDS-PAGE : Sodium Dodecyl Sulphate – Polyacrylamide Gel Electrophoresis. WHO :World Health Organization viii c PART I INTRODUCTION 1.1Background and motivation 1.However, no report until it was rediscovered by the Belgian botanist, J.Itis a structured spiral cyanobacteriumbelonging to the group of blue-greenalgae.

The well-known species areA. platensisand Spirulina maxima (S. The algae have the ability to perform photosynthesis like higher plants, they are found in several environments, including freshwater, seawater and highly alkaline environment particularly in tropical countries[3]. The algaecontain very high protein content about 55%-70% (dry weight)which is higher than fish and beef proteins about 3-4 times[49,60], essential fatty acids (18% of total fatty acid) includesγ-Linolenic acid (GLA), vitamin B12, nucleic acid, minerals such as iron; calcium;and phosphorus,and pigments such as carotenes and chlorophyll.Inside, C-phycocyanin was mostly found as a major part in the algal proteins, which has full of all amino acids(Table 1.It alsowas appliedin the food processing functions for human foods and animalfeeds[2].1Amino acid profile of Arthrospira (Spirulina) platensis [60].

Amino acid Content (g per 100 g protein) Lie 6.8 Val 7,1 Lys 4,8 Phe 5,3 Tyr 5,3 Met 2,5 Cys 0,9 Try 0,3 Thr 6,2 Ala 9,5 Arg 7,3 Asp 11,8 Glu 10,3 Gly 5,7 His 2,2 Pro 4,2 Ser 5,1 1 c 1.1 Classification Classification of A. platensisusing a cladistic approach as shown in Fig 1. Domain: Prokaryota Kingdom: Monera This kingdom includes complex and diverse bacteria. They lack a nuclear membrane and go through cell division via binary fission.

Phylum: Cyanobacteria This phylum includes photoautotrophic bacteria that utilize photosynthesis but lack chloroplasts. These cells have no flagella. Class: Cyanophyceae This class contains unicellular and multicellular algae without a true nucleus or chromatophore. They have no known sexual reproduction.

Order: Nostocales This order is characterized by filamentous bacteria with branching. Family: Oscillatoriaceae This family includes unbranched cells that show spiral movement. It rotates along its axis. They have no heterocyst.

Genus: Arthrospira This genus is multicellular and a long cylinder. Species: Arthrospira platensis This species is classified as spirally coiled with granulated cross-walls. Prokaryota Monera Cyanobacteria Cyanophyceae Nostocales Oscillatoriaceae Arthrospira Platensis Fig 1.2 Morphology of Arthrospira According toSili et al.(2012), the main morphological feature of Arthrospiraisa typical arrangement of trichome in an open helix usually of relatively large diameter, sometimes attenuated at the ends, and with evident cross-walls (Fig 1. The trichomes are composed of cylindrical cells that undergo binary fission in a single plane, perpendicular to the main axis.

Multiplication occurs only by fragmentation of the trichomes. The trichome breakage is transcellular and involves the destruction of an intercalary cell[7,42,57].2 Morphological aspects of the evident cross-wall in Arthrospira isolated from soda Lake Kailala (Chad). The trichome ofA. platensishaswidth from about 2,5 to 16 μm, the helix pitch from about 0 to 80 μm and diameter from 15 to 60 μm.

These two parameters which define the shape of the helix architecture are highly dependent on growth and environmental conditions[7].Van Eykelenburg(1980) described theeffect of temperature on the change trichome structure of A. platensisfrom the helix to the straight in the solid media. Although straight and helicoidally forms of A. platensisoften observed in the laboratory.

However, the factors and the effect mechanism for this change still remain obscure[58]. Jeeji Bai(1985)studied the 3 c effect of the physical and chemical condition on the helix geometry of A. The degree of coiling of trichome from helical to straightform under the physical and chemical conditions wereregarded as a peculiar property of limb, in the same species and it does not revert back to the helical form [30].The evidence may be due to it is impacted of some mutation in the growth conditions and related to A. platensis The cell organization of A.

platensis,observed by electron microscopy shows organizations such as capsule, pluristratified cell wall, photosynthetic or thylakoid lamella system, ribosomes, and fibrils of DNA region and numerous inclusions is gram-negative [37,48].The capsule has fibrillar structure and covers each filament protecting it. The irregular presence of capsule around the filaments in A. platensisis a differentiating morphological characteristic to compare with S.