Luận án tiến sĩ: Khả năng kháng oxy hóa và ức chế enzyme tyrosinase của cây dứa tại Kiên Giang

Dứa (Ananas comosus) là một loại trái cây nhiệt đới quen thuộc, không chỉ được ưa chuộng bởi hương vị thơm ngon mà… 257 trang · Trường Đại học Cần Thơ · 2022.

• Tác giả: Nguyễn Thị Thu Hậu
• Người hướng dẫn: PGS. Trần Nhân Dũng
• Trường học: Trường Đại học Cần Thơ
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Khả Năng Kháng Oxy Hóa và Ức Chế Enzyme Tyrosinase của Cây Dứa (Ananas comosus)
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Kiên Giang

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU
• 1.1. Đặt vấn đề
• 1.2. Mục tiêu luận án
• 1.3. Nội dung nghiên cứu
• 1.4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
• 1.4.1. Đối tượng nghiên cứu
• 1.4.2. Phạm vi nghiên cứu
• 1.5. Ý nghĩa của nghiên cứu
• 1.5.1. Ý nghĩa khoa học
• 1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn
• 1.6. Tính mới của luận án
• 2. CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Tổng quan về cây dứa (Ananas comosus)
• 2.1.1. Đặc điểm sinh học của cây dứa
• 2.2. Các nghiên cứu trong và ngoài nước
• 2.2.1. Những nghiên cứu ngoài nước
• 2.2.2. Những nghiên cứu trong nước
• 2.3. Tổng quan về các hợp chất thứ cấp thực vật
• 2.3.1. Terpene và các dẫn xuất của terpene
• 2.4. Tổng quan về kháng oxy hóa, chất kháng oxy hóa và cơ chế
• 2.4.1. Khái quát về quá trình oxy hóa tế bào
• 2.4.2. Khái quát về gốc tự do
• 2.4.3. Tác hại của gốc tự do đối với cơ thể
• 2.4.4. Chất kháng oxy hóa
• 2.4.5. Cơ chế hoạt động của các chất kháng oxy hóa tự nhiên
• 2.5. Tổng quan về tyrosinase, cơ chế hoạt động và chất ức chế tyrosinase
• 2.5.1. Tổng quan về enzyme tyrosinase
• 2.5.2. Cơ chế hoạt động của tyrosinase
• 2.5.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của tyrosinase
• 2.5.4. Các chất ức chế Tyrosinase
• 2.5.5. Cơ chế ức chế enzyme tyrosinase
• 2.5.6. Tiềm năng sử dụng các chất ức chế tyrosinase
• 2.6. Tổng quan về melanocyte, cơ chế hoạt động và chất ức chế
• 2.6.1. Tế bào hắc tố
• 2.6.2. Cơ chế hoạt động của melanocyte
• 2.7. Tổng quan về các phương pháp định danh thực vật
• 2.7.1. Nhận diện và định danh thực vật bằng đặc điểm hình thái
• 2.7.2. Nhận diện và định danh thực vật bằng di truyền phân tử
• 2.8. Phương pháp chiết xuất và phân tách các hợp chất từ thực vật
• 2.8.1. Phương pháp chiết xuất rắn-lỏng
• 2.8.2. Phương pháp chiết xuất hỗ trợ sóng siêu âm
• 2.8.3. Phương pháp sắc ký cột silica gel
• 2.9. Tổng quan về các phương pháp định lượng, kháng oxy hóa, ức chế enzyme tyrosinase (in vitro), phân tích khối phổ GC-MS
• 2.9.1. Các phương pháp định lượng hợp chất thứ cấp thực vật
• 2.9.2. Các phương pháp xác định hoạt tính kháng oxy hóa
• 3. CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Phương tiện nghiên cứu
• 3.1.1. Thời gian và địa điểm
• 3.1.2. Nguyên vật liệu
• 3.1.3. Dụng cụ và thiết bị
• 3.2. Phương pháp nghiên cứu
• 3.2.1. Nội dung 1: Khảo sát chọn vùng nguyên liệu và dung môi trích ly cao chiết
• 3.2.2. Nội dung 2: Đánh giá khả năng kháng oxy hóa và ức chế tyrosinase của cao methanol dứa Tắc Cậu
• 3.2.3. Nội dung 3: Đánh giá khả năng kháng oxy hóa và ức chế tyrosinase của cao phân đoạn dứa
• 3.2.4. Nội dung 4: Khảo sát khả năng ức chế sự sản sinh melanin trên dòng tế bào hắc tố B16F10 của cao phân đoạn F1
• 3.2.5. Nội dung 5: Phân tích phổ GC-MS của cao phân đoạn F1 vỏ dứa
• 3.3. Phương pháp xử lý số liệu
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Kết quả khảo sát chọn nguồn nguyên liệu
• 4.1.1. Kết quả kháng oxy hóa cao chiết ethanol dứa ở hai vùng sinh thái Hòn Đất và Tắc Cậu
• 4.1.2. Kết quả kháng oxy hóa cao chiết ethanol/methanol dứa vùng Tắc Cậu, Kiên Giang
• 4.1.3. Kết quả giải trình tự gen cây dứa Tắc Cậu
• 4.2. Kết quả khả năng kháng oxy hóa và ức chế tyrosinase của cao methanol dứa Tắc Cậu
• 4.2.1. Kết quả định lượng polyphenol tổng và flavonoid trong cao methanol dứa
• 4.2.2. Kết quả kháng oxy hóa của cao methanol dứa Tắc Cậu
• 4.2.3. Mối quan hệ giữa hàm lượng polyphenol tổng, flavonoid tổng với khả năng kháng oxy hóa của cây dứa Tắc Cậu
• 4.2.4. Kết quả ức chế tyrosinase của cao methanol dứa vùng Tắc Cậu
• 4.3. Kết quả kháng oxy hóa và ức chế tyrosinase của cao phân đoạn vỏ dứa
• 4.3.1. Kết quả sắc ký tách phân đoạn cao chiết methanol vỏ dứa
• 4.3.2. Kết quả định lượng polyphenol tổng và flavonoid tổng trong cao phân đoạn vỏ dứa
• 4.3.3. Kết quả kháng oxy hóa và ức chế tyrosinase của cao phân đoạn vỏ dứa
• 4.3.4. Mối quan hệ giữa hàm lượng polyphenol tổng, flavonoid tổng với khả năng kháng oxy hóa và ức chế tyrosinase của cao phân đoạn vỏ dứa
• 4.3.5. Kết quả ức chế sự sản sinh melanin trên dòng tế bào sắc tố B16F10 của cao phân đoạn F1 vỏ dứa
• 4.3.6. Kết quả phân tích phổ khối GC-MS mẫu cao phân đoạn F1 vỏ dứa
• 5. CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
• PHỤ LỤC B: KẾT QUẢ THỬ TẾ BÀO B16F10
• PHỤ LỤC C: XỬ LÝ THỐNG KÊ
• PHỤ LỤC D: GIẢI GC-MS

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Khả Năng Kháng Oxy Hóa Của Cây Dứa Ananas comosus

Dứa (Ananas comosus) là một loại trái cây nhiệt đới quen thuộc, không chỉ được ưa chuộng bởi hương vị thơm ngon mà còn bởi những lợi ích sức khỏe tiềm năng. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng dứa chứa nhiều hợp chất có khả năng chống oxy hóa, giúp bảo vệ tế bào khỏi tổn thương do các gốc tự do gây ra. Các bộ phận khác nhau của cây dứa, bao gồm lá, thân, thịt quả và vỏ quả, đều có thể chứa các hợp chất này với hàm lượng khác nhau. Điều này mở ra tiềm năng khai thác dứa như một nguồn chất chống oxy hóa tự nhiên, có giá trị trong nhiều lĩnh vực. Dứa thuộc họ Bromeliaceae có nguồn gốc từ Paraguay và là loại trái cây có giá trị dinh dưỡng cao đứng thứ ba trên thế giới chỉ đứng sau chuối và cây có múi (cam quýt). Thịt quả dứa có các hợp chất có hoạt tính sinh học cao như: mangan, vitamin A, B, (B1, B6, folates), C và các loại acid hữu cơ đặc biệt là malic acid, citric acid, folic acid, βcarotene, enzyme bromelain (Ramsden & Riley, 2014).

1.1. Thành Phần Hóa Học Chính Tạo Nên Khả Năng Chống Oxy Hóa Của Dứa

Khả năng chống oxy hóa của dứa chủ yếu đến từ các hợp chất phenolic, flavonoid và vitamin C. Các hợp chất này có khả năng trung hòa các gốc tự do, ngăn chặn quá trình oxy hóa lipid và bảo vệ DNA khỏi tổn thương. Hàm lượng và thành phần cụ thể của các hợp chất này có thể khác nhau tùy thuộc vào giống dứa, điều kiện trồng trọt và bộ phận của cây. Ví dụ, vỏ dứa thường chứa hàm lượng flavonoid cao hơn so với thịt quả, trong khi lá dứa có thể giàu hợp chất phenolic hơn. Kết quả định lượng cho thấy hàm lượng polyphenol tổng cao nhất trong mẫu chiết xuất methanol lá còn hàm lượng flavonoid tổng cao nhất trong mẫu methanol vỏ dứa.

1.2. So Sánh Khả Năng Chống Oxy Hóa Giữa Các Giống Dứa Queen Cayen

Các giống dứa khác nhau, như dứa Queen và dứa Cayen, có thể có sự khác biệt về thành phần hóa học và khả năng chống oxy hóa. Một số nghiên cứu đã so sánh khả năng chống oxy hóa của các giống dứa này, cho thấy rằng một số giống có hoạt tính cao hơn so với các giống khác. Sự khác biệt này có thể liên quan đến hàm lượng các hợp chất chống oxy hóa cụ thể, cũng như sự tương tác giữa các hợp chất này. Việc lựa chọn giống dứa phù hợp có thể là một yếu tố quan trọng trong việc tối ưu hóa khả năng chống oxy hóa của sản phẩm từ dứa.

II. Enzyme Tyrosinase Vấn Đề Sạm Da và Giải Pháp Từ Cây Dứa

Enzyme tyrosinase đóng vai trò quan trọng trong quá trình sản xuất sắc tố melanin, gây ra tình trạng sạm da, nám da và tàn nhang. Việc tìm kiếm các chất ức chế enzyme tyrosinase tự nhiên, an toàn và hiệu quả là một lĩnh vực nghiên cứu quan trọng trong ngành mỹ phẩm và dược phẩm. Cây dứa, với thành phần hóa học đa dạng, đã được chứng minh là có khả năng ức chế enzyme tyrosinase, mở ra tiềm năng ứng dụng trong các sản phẩm làm sáng da và chống lão hóa. Trong cơ thể của sinh vật (kể cả con người) luôn sản sinh ra các gốc tự do, các gốc tự do này dễ phản ứng với các gốc khác gần kề dẫn đến sự sản sinh các gốc tự do mới là nguyên nhân dẫn tới sự phá huỷ các bào quan và cấu trúc bên trong tế bào (đột biến). Đột biến là nguyên nhân dẫn đến sự thoái hóa tế bào làm xuất hiện các bệnh hiểm nghèo (Ghasemzadeh, 2012; Vrianty et al.

2.1. Cơ Chế Ức Chế Enzyme Tyrosinase Của Các Hợp Chất Trong Dứa

Các hợp chất trong dứa, như hợp chất phenolic và flavonoid, có thể ức chế enzyme tyrosinase thông qua nhiều cơ chế khác nhau. Một số hợp chất có thể liên kết trực tiếp với enzyme, ngăn chặn sự gắn kết của cơ chất. Các hợp chất khác có thể làm giảm hoạt tính của enzyme bằng cách thay đổi cấu trúc hoặc môi trường xung quanh enzyme. Hiểu rõ cơ chế ức chế enzyme tyrosinase của các hợp chất trong dứa là rất quan trọng để phát triển các sản phẩm làm sáng da hiệu quả.

2.2. So Sánh Hiệu Quả Ức Chế Tyrosinase Giữa Các Bộ Phận Của Cây Dứa

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng các bộ phận khác nhau của cây dứa có thể có hiệu quả ức chế enzyme tyrosinase khác nhau. Vỏ dứa thường được coi là bộ phận có tiềm năng nhất, do chứa hàm lượng cao các hợp chất có hoạt tính ức chế. Tuy nhiên, các bộ phận khác như lá và thân cũng có thể chứa các hợp chất có giá trị. Việc so sánh hiệu quả ức chế enzyme tyrosinase giữa các bộ phận của cây dứa giúp xác định nguồn nguyên liệu tốt nhất cho các ứng dụng làm sáng da.

III. Phương Pháp Chiết Xuất và Đánh Giá Hoạt Tính Sinh Học Của Dứa

Để khai thác tối đa khả năng chống oxy hóa và ức chế enzyme tyrosinase của dứa, cần có các phương pháp chiết xuất hiệu quả và các phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học chính xác. Các phương pháp chiết xuất khác nhau, như chiết xuất bằng dung môi, chiết xuất hỗ trợ siêu âm, có thể ảnh hưởng đến thành phần và hàm lượng các hợp chất có hoạt tính trong chiết xuất. Các phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học, như phương pháp DPPH, phương pháp FRAP và phương pháp ức chế enzyme tyrosinase in vitro, giúp xác định hoạt tính sinh học của chiết xuất và các phân đoạn của nó. Luận án sử dụng phương pháp định danh loài bằng phương pháp phân tích đặc điểm hình thái đồng thời có kiểm định lại bằng phương pháp giải trình tự, trích ly cao bằng phương pháp ngâm dầm kết hợp với đánh sóng siêu âm, khảo sát khả năng kháng oxy hóa in vitro của các mẫu cao chiết được thực hiện thông qua ba phương pháp gồm: phương pháp trung hòa gốc tự do DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl); phương pháp khử ion Fe3+ và phương pháp khử ion Cu2+, phương pháp khảo sát ức chế hoạt động enzyme tyrosinase in vitro, phương pháp sắc ký cột silica gel để tách cao phân đoạn vỏ dứa Tắc Cậu.

3.1. Tối Ưu Hóa Quy Trình Chiết Xuất Hợp Chất Chống Oxy Hóa Từ Dứa

Việc tối ưu hóa quy trình chiết xuất là rất quan trọng để thu được chiết xuất dứa giàu hợp chất chống oxy hóa và có hoạt tính sinh học cao. Các yếu tố cần xem xét bao gồm loại dung môi, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu, thời gian chiết xuất, nhiệt độ chiết xuất và phương pháp chiết xuất. Các phương pháp chiết xuất hiện đại, như chiết xuất hỗ trợ siêu âm và chiết xuất enzyme, có thể giúp tăng hiệu quả chiết xuất và giảm thời gian chiết xuất. Kết quả nghiên cứu cho thấy, vùng sinh thái Tắc Cậu, Kiên Giang và dung môi methanol là thích hợp phục vụ nghiên cứu của luận án.

3.2. Các Phương Pháp Đánh Giá Hoạt Tính Chống Oxy Hóa và Ức Chế Tyrosinase

Có nhiều phương pháp khác nhau để đánh giá khả năng chống oxy hóa và ức chế enzyme tyrosinase của chiết xuất dứa. Phương pháp DPPH là một phương pháp phổ biến để đánh giá khả năng chống oxy hóa bằng cách đo khả năng trung hòa gốc tự do DPPH. Phương pháp FRAP đo khả năng khử ion sắt (III) thành ion sắt (II). Phương pháp ức chế enzyme tyrosinase in vitro đo khả năng ức chế hoạt động của enzyme tyrosinase. Việc sử dụng kết hợp nhiều phương pháp giúp đánh giá toàn diện hoạt tính sinh học của chiết xuất dứa.

IV. Ứng Dụng Chiết Xuất Dứa Trong Mỹ Phẩm Chống Lão Hóa Làm Sáng Da

Với khả năng chống oxy hóa và ức chế enzyme tyrosinase, chiết xuất dứa có tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong ngành mỹ phẩm. Chiết xuất dứa có thể được sử dụng trong các sản phẩm chống lão hóa, giúp bảo vệ da khỏi tổn thương do các gốc tự do và giảm sự xuất hiện của nếp nhăn. Chiết xuất dứa cũng có thể được sử dụng trong các sản phẩm làm sáng da, giúp giảm sự sản xuất sắc tố melanin và làm mờ các vết thâm nám. Kết quả phân tích sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) của F1 có sự hiện diện của succinic acid, ferulic acid, p-coumaric acid, cinnamic acid, 2-ethylhexyl benzoatelà những hợp chất có khả năng kháng oxy hóa và ức chế tyrosinase mạnh.

4.1. Nghiên Cứu Về Hiệu Quả Làm Sáng Da Của Chiết Xuất Dứa Trên Tế Bào

Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để đánh giá hiệu quả làm sáng da của chiết xuất dứa trên tế bào. Các nghiên cứu này thường sử dụng các dòng tế bào hắc tố (melanocytes) để mô phỏng quá trình sản xuất sắc tố melanin trong da. Kết quả của các nghiên cứu này cho thấy rằng chiết xuất dứa có thể làm giảm sự sản xuất sắc tố melanin và làm sáng da một cách hiệu quả. Sử dụng phương pháp nuôi cấy tế bào động vật, khảo sát sự ức chế hình thành melanin trên dòng tế bào hắc tố B16F10 và phân tích phổ GC-MS của cao phân đoạn có hoạt tính kháng oxy hóa và ức chế tyrosinase mạnh.

4.2. Ứng Dụng Chiết Xuất Dứa Trong Các Sản Phẩm Chăm Sóc Da Thương Mại

Chiết xuất dứa đã được sử dụng trong nhiều sản phẩm chăm sóc da thương mại, bao gồm kem dưỡng da, serum, mặt nạ và sữa rửa mặt. Các sản phẩm này thường được quảng cáo với các công dụng như chống lão hóa, làm sáng da, giảm thâm nám và cải thiện tông màu da. Tuy nhiên, cần có thêm các nghiên cứu lâm sàng để đánh giá hiệu quả thực tế của các sản phẩm này trên da người.

V. Kết Luận và Hướng Nghiên Cứu Tiềm Năng Về Cây Dứa

Nghiên cứu về khả năng chống oxy hóa và ức chế enzyme tyrosinase của dứa đã mở ra nhiều tiềm năng ứng dụng trong lĩnh vực sức khỏe và làm đẹp. Tuy nhiên, vẫn còn nhiều câu hỏi cần được giải đáp và nhiều hướng nghiên cứu tiềm năng cần được khám phá. Việc nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học, cơ chế hoạt động và hiệu quả lâm sàng của chiết xuất dứa sẽ giúp khai thác tối đa giá trị của loại trái cây này. Kết quả nghiên cứu đã cho thấy vỏ quả dứa là nguồn giàu hợp chất thứ cấp có hoạt tính kháng oxy hóa và ức chế tyrosinase.

5.1. Đánh Giá Toàn Diện Về Hoạt Tính Sinh Học Của Các Giống Dứa Khác Nhau

Cần có thêm các nghiên cứu để đánh giá toàn diện hoạt tính sinh học của các giống dứa khác nhau, bao gồm khả năng chống oxy hóa, ức chế enzyme tyrosinase và các hoạt tính sinh học khác. Việc so sánh các giống dứa khác nhau sẽ giúp xác định các giống có tiềm năng nhất cho các ứng dụng cụ thể.

5.2. Nghiên Cứu Về Tác Dụng Phối Hợp Của Chiết Xuất Dứa Với Các Chất Khác

Cần có thêm các nghiên cứu để đánh giá tác dụng phối hợp của chiết xuất dứa với các chất khác, như vitamin, khoáng chất và các hợp chất chống oxy hóa khác. Việc kết hợp chiết xuất dứa với các chất khác có thể giúp tăng cường hoạt tính sinh học và mở rộng phạm vi ứng dụng.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Cây dứa (Ananas comosus (L.)) thuộc họ Bromeliaceae là loại cây ăn quả nhiệt đới có giá trị dinh dưỡng và thương mại cao, đứng thứ ba trên thế giới sau chuối và cây có múi. Quá trình trao đổi chất của sinh vật liên tục tạo ra các gốc tự do (ROS, RNS). Khi nồng độ gốc tự do tăng cao sẽ dẫn đến hiện tượng thoái hóa tế bào, đột biến và làm phát sinh các bệnh lý mãn tính nguy hiểm. Bên cạnh đó, tyrosinase là enzyme giữ vai trò then chốt trong con đường sinh tổng hợp sắc tố melanin; sự tăng sinh quá mức của melanin dẫn đến tình trạng nám da, tàn nhang, đốm nâu và có mối liên hệ mật thiết với một số rối loạn thoái hóa thần kinh như bệnh Alzheimer và Parkinson. Mặc dù các hoạt chất ức chế tyrosinase tổng hợp hóa học đã được phát triển nhưng vẫn tiềm ẩn nguy cơ về độc tính và độ an toàn thấp. Do đó, xu hướng sàng lọc và chiết xuất các hợp chất tự nhiên có khả năng kháng oxy hóa và ức chế enzyme tyrosinase đang được quan tâm nghiên cứu.

Trên thế giới, các nghiên cứu về cây dứa chủ yếu tập trung vào thịt quả hoặc khai thác enzyme protease bromelain. Tuy nhiên, chưa có công trình nào đánh giá so sánh một cách tổng thể hoạt tính kháng oxy hóa và ức chế tyrosinase giữa các bộ phận khác nhau (lá, thân, thịt quả, vỏ quả) của cây dứa. Tại Việt Nam, nhiều loài thực vật đã được nghiên cứu về khả năng ức chế tyrosinase như củ cải trắng, hoa hòe, cây huỳnh anh, nấm rơm, mít dai, lá tía tô, vi tảo; tuy nhiên chưa có công trình nào khảo sát đầy đủ hoạt tính này trên các bộ phận của cây dứa, đặc biệt là nguồn phụ phế phẩm vỏ dứa tại vùng Đồng bằng sông Cửu Long.

Luận án tiến sĩ chuyên ngành Công nghệ sinh học (mã ngành: 7420201) của nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Thu Hậu (mã số NCS: 0917003), dưới sự hướng dẫn của PGS. Trần Nhân Dũng và PGS. Huỳnh Văn Bá tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Cần Thơ, thực hiện đề tài: "Khả năng kháng oxy hóa và ức chế enzyme tyrosinase của cây dứa (Ananas comosus)".

Mục tiêu tổng quát của luận án là đánh giá khả năng kháng oxy hóa và ức chế enzyme tyrosinase của cao chiết từ dứa (Ananas comosus (L.)) nhằm khảo sát và xác định nguồn nguyên liệu tự nhiên tiềm năng từ các bộ phận của cây dứa phục vụ cho lĩnh vực y dược và hóa mỹ phẩm.

Nội dung nghiên cứu của luận án được cấu trúc thành 5 nội dung cụ thể:

1. Nội dung 1: Khảo sát chọn vùng nguyên liệu và dung môi chiết xuất cao và định danh loài dứa vùng Tắc Cậu.
2. Nội dung 2: Khảo sát khả năng kháng oxy hóa (hoạt tính khử DPPH, hoạt tính khử ion Fe3+ thành ion Fe2+, hoạt tính khử ion Cu2+ thành ion Cu+) và khả năng ức chế tyrosinase của cao methanol dứa Tắc Cậu.
3. Nội dung 3: Sắc ký tách phân đoạn cao chiết methanol vỏ dứa và khảo sát khả năng kháng oxy hóa và ức chế tyrosinase của cao phân đoạn có hoạt tính cao.
4. Nội dung 4: Khảo sát khả năng ức chế sự sản sinh melanin của cao phân đoạn có hoạt tính cao từ cao chiết methanol F1 vỏ dứa trên dòng tế bào B16F10.
5. Nội dung 5: Khảo sát các hợp chất trong cao phân đoạn F1 methanol vỏ dứa có khả năng kháng oxy hóa và ức chế tyrosinase thông qua phân tích phổ GC-MS.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Các bộ phận gồm lá, thân, thịt quả và vỏ quả của cây dứa (Ananas comosus) thu hái tại vùng Tắc Cậu (thuộc vùng sinh thái Tây Sông Hậu, huyện Châu Thành và Gò Quao) và vùng Hòn Đất (thuộc vùng sinh thái Tứ Giác Long Xuyên), tỉnh Kiên Giang.
• Phạm vi nghiên cứu: Tập trung đánh giá hàm lượng polyphenol tổng, flavonoid tổng, hoạt tính kháng oxy hóa in vitro thông qua 3 phương pháp (khử gốc tự do DPPH, khử ion Fe3+, khử ion Cu2+), hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase in vitro, hiệu quả ức chế sinh tổng hợp melanin trên mô hình dòng tế bào u hắc tố da chuột B16F10, và phân tích thành phần hóa học bằng sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS).
• Thời gian và địa điểm: Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 5/2018 đến tháng 1/2021 tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học (Trường Đại học Cần Thơ) và Trung tâm Quản lý thực hành thí nghiệm (Trường Đại học Kiên Giang).

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Tổng quan tài liệu của luận án đã phân tích và tổng hợp có hệ thống các nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến thành phần hóa thực vật, hoạt tính kháng oxy hóa, cơ chế ức chế enzyme tyrosinase và ức chế tạo hắc tố melanin:

Các nghiên cứu quốc tế tiêu biểu:

• Về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của dứa: Ivanova et al. (2019) phân tích nước ép dứa chứa hơn 30 hợp chất hữu cơ và hoạt chất sinh học; Ogawa et al. (2018) xác định 18 hợp chất hữu cơ và 13 hợp chất thứ cấp trong dịch trích nước ép dứa, chủ yếu là các hợp chất phenolic như ferulic acid (FA), p-coumaric acid (pCA), cinnamic acid. Nghiên cứu của Banerjee et al. (2018), Debnath et al. (2019), Han et al. (2019), Insuan et al. (2021), Novaes et al. (2016), Chakraborty et al. (2021) tập trung vào đặc tính chống viêm, chống phù nề và phân giải protein của enzyme bromelain từ thân và quả dứa.
• Về hoạt tính kháng oxy hóa và ức chế tyrosinase từ dứa: Vrianty et al. (2019) ghi nhận cao chiết lõi dứa có giá trị IC50 khử DPPH là 87,46 µg/mL và ức chế tyrosinase với IC50 là 62,27 µg/mL. Jovanović et al. (2018) khảo sát vỏ, lá đỉnh, thân và nước dứa, kết luận cao methanol vỏ và thân có khả năng kháng oxy hóa khử DPPH cao nhất với IC50 đạt 1,745 ± 0,046 mg/mL. Yuris và Siow (2014) khảo sát 3 giống dứa (Joseplune, Morris, Sarawak) tại Malaysia cho thấy methanol là dung môi tối ưu để trích ly polyphenol (TPC) và flavonoid (TFC), trong đó giống Morris có hàm lượng TPC cao nhất và IC50 khử DPPH đạt 25,12 mg/mL. Putri et al. (2018) nghiên cứu vỏ dứa tại Myanmar trong các dung môi n-hexane, dichloromethane, ethyl acetate, methanol và nước, thu được IC50 khử DPPH của cao nước là 266,02 µg/mL và cao n-hexane khử ABTS đạt IC50 46,49 µg/mL. Saptarini et al. (2019) khảo sát lá đỉnh dứa tại Indonesia ghi nhận IC50 khử DPPH là 3621 µg/mL. Haripyaree et al. (2010) đánh giá dịch chiết phenol mô thịt quả dứa tại Manipur (Ấn Độ) trong methanol thu được IC50 khử DPPH là 12,2 µg/mL.
• Về hoạt tính của các hợp chất phenolic và ứng dụng: Taofiq et al. (2017), Wang et al. (2019), Long et al. (2019), Ferone et al. (2019) khẳng định p-coumaric acid, ferulic acid, sinapic acid và succinic acid là các chất ức chế tyrosinase hiệu quả. Arshad et al. (2014) thử nghiệm lâm sàng kem chứa 2% cao methanol quả dứa trên bệnh nhân nám da trong 12 tuần ghi nhận vùng nám giảm và da sáng màu. Wongkom và Jimtaisong (2017) trích ly carboxymethylcellulose từ vỏ dứa kết hợp ferulic acid để chế tạo kem chống nắng. Azizan et al. (2020) nghiên cứu lá và vỏ dứa trong ức chế enzyme α-glucosidase và khử gốc tự do DPPH, NO.

Các nghiên cứu trong nước tiêu biểu:

• Khảo sát hoạt tính ức chế tyrosinase và ức chế tạo melanin trên tế bào B16F10: Nguyễn Hoàng Dũng và ctv. (2016) trên cao methanol rau diếp cá (ức chế 24,8% melanin ở 100 µg/mL, IC50 khử DPPH = 7,71 µg/mL); Nguyễn Trọng Tuân và Mai Văn Hiếu (2017) trên cây bạch đầu ông; Phạm Thế Hải và ctv. (2017) sàng lọc in silico - in vitro 19 hợp chất ức chế tyrosinase (acid 3,4-dimethoxycinnamic ức chế 96,74% ở 500 µM); Lê Quỳnh Loan và ctv. (2018) trên cây hoa hòe (ức chế 34,9% melanin ở 200 µg/mL, IC50 DPPH = 185,2 µg/mL); Lê Quỳnh Loan và ctv. (2019) trên cây ô dược (ức chế 42,58% melanin ở 200 µg/ml trên tế bào B16F10); Nguyễn Khoa Hạ Mai và Nguyễn Thị Thanh Mai (2018) khảo sát 17 mẫu cây thuộc họ Dâu tằm, phân lập được morachalcone A từ gỗ cây mít dai có IC50 ức chế tyrosinase là 0,013 µM; Nguyễn Lương Hiếu Hòa và ctv. (2018) trên cây mật gấu (ức chế 37,15% melanin ở 100 µg/mL); Huỳnh Duy Phúc (2020) trên vi tảo H. pluvialis (IC50 DPPH = 299,40 µg/mL, phân đoạn F4 ức chế tyrosinase có IC50 = 215,67 µg/mL).

Khoảng trống nghiên cứu được luận án lựa chọn giải quyết: Các công trình trước đây tại Việt Nam chưa khảo sát toàn diện và đồng thời cả bốn bộ phận (lá, thân, thịt quả, vỏ quả) của cây dứa ở các vùng sinh thái đặc trưng thuộc tỉnh Kiên Giang. Đồng thời, chưa có công trình nào thực hiện phân tách sắc ký vỏ dứa để thu nhận phân đoạn có hoạt tính cao, đánh giá năng lực ức chế sản sinh melanin trên mô hình dòng tế bào u hắc tố B16F10 kết hợp phân tích nhận diện thành phần hóa học bằng kỹ thuật GC-MS.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

• Hợp chất thứ cấp thực vật: Hệ thống phân loại hợp chất thứ cấp theo Swain (1977) và Seigler & Price (1976) gồm 4 nhóm chính: Polyphenol (lignan, acid phenolic, tannin, coumarin, flavonoid, stilbene), Terpenoid (carotenoid, sterol, triterpenoid saponin), nhóm chứa nitrogen (alkaloid) và nhóm chứa sulfur (glucosinolate, glutathione). Luận án tập trung vào nhóm polyphenol và flavonoid với cấu trúc mạch vòng chứa các nhóm hydroxyl có khả năng cho proton hoặc electron để khử các gốc oxy hóa.
• Lý thuyết kháng oxy hóa và gốc tự do: Quá trình oxy hóa tế bào tạo ra các gốc tự do ROS (O2 đơn, superoxide anion O2•-, gốc hydroxyl HO•, gốc alkoxyle RO•, gốc peroxyl ROO•, H2O2, lipid hydroperoxide LOOH) và RNS. Các chất kháng oxy hóa tự nhiên hoạt động theo cơ chế bậc 1 (vô hoạt hoặc khử gốc tự do qua các cơ chế chuyển nguyên tử hydro HAT, truyền electron đơn SET-PT, hoặc mất proton tuần tự SPLET) và cơ chế bậc 2 (phân giải peroxide, tạo phức chelate với ion kim loại Fe3+, Cu2+ nhằm ngăn chặn phản ứng Fenton và Haber-Weiss).
• Lý thuyết về enzyme tyrosinase và quá trình sinh hắc tố: Tyrosinase (EC 1.14.18.1) là một enzyme monooxygenase chứa đồng loại III, có trung tâm hoạt động gồm hai ion đồng (CuA và CuB), mỗi ion liên kết với ba gốc histidine (cấu trúc tinh thể PDB ID: 2Y9X). Tyrosinase xúc tác quá trình chuyển L-tyrosine thành L-DOPA và oxy hóa L-DOPA thành dopaquinone trong tế bào hắc tố (melanocyte) để hình thành eumelanin và pheomelanin. Việc ức chế enzyme này giúp kiểm soát sự tăng sinh sắc tố melanin.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

• Thu thập và xử lý mẫu: Mẫu lá đỉnh, thân, thịt quả và vỏ quả của cây dứa được thu hái tại hai vùng sinh thái: Tắc Cậu (vùng Tây Sông Hậu) và Hòn Đất (vùng Tứ Giác Long Xuyên), tỉnh Kiên Giang. Mẫu được đo độ ẩm, xử lý tươi hoặc sấy khô và nghiền thành bột mịn.
• Định danh loài: Đánh giá các chỉ tiêu hình thái thực vật học kết hợp kỹ thuật sinh học phân tử: tách chiết DNA bằng phương pháp đệm CTAB, khuếch đại đoạn gen chỉ thị ITS bằng phản ứng PCR (với thành phần MasterMix chuyên dụng) và giải trình tự gen, sau đó đối chiếu độ tương đồng trên cơ sở dữ liệu NCBI bằng công cụ BLAST.
• Trích ly cao chiết: Sử dụng phương pháp ngâm dầm kết hợp hỗ trợ sóng siêu âm trong các dung môi ethanol (EtOH) và methanol (MeOH) ở các điều kiện tỷ lệ và thời gian xác định để thu cao thô (CT).
• Định lượng hóa thực vật:
  • Hàm lượng polyphenol tổng số (TPC): Định lượng bằng phương pháp đo quang phổ sử dụng thuốc thử Folin-Ciocalteu, tính theo đương lượng gallic acid (mg GAE/g cao chiết).
  • Hàm lượng flavonoid tổng số (TFC): Định lượng bằng phương pháp so màu tạo phức với nhôm clorid (AlCl3), tính theo đương lượng quercetin (mg QE/g cao chiết).
• Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa in vitro:
  • Phương pháp trung hòa gốc tự do DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl).
  • Phương pháp khử ion Fe3+ thành ion Fe2+ (năng lực khử sắt).
  • Phương pháp khử ion Cu2+ thành ion Cu+ (phương pháp CUPRAC).
  • Hoạt tính được biểu thị thông qua giá trị IC50 (nồng độ ức chế hoặc khử 50% gốc tự do/ion kim loại, đơn vị µg/mL).
• Đánh giá hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase in vitro: Sử dụng enzyme tyrosinase từ nấm Agaricus bisporus (120 kDa) và cơ chất L-DOPA trong đệm phosphat; đo mật độ quang học (OD) tại bước sóng hấp thụ đặc trưng để xác định tỷ lệ ức chế và giá trị IC50.
• Phân tách sắc ký: Áp dụng phương pháp sắc ký cột pha tĩnh silica gel trên cao chiết methanol vỏ quả dứa Tắc Cậu, sử dụng hệ dung môi rửa giải có độ phân cực tăng dần để thu nhận các cao phân đoạn (CPĐ: F1, F2, ...).
• Đánh giá trên mô hình tế bào in vivo: Nuôi cấy dòng tế bào u hắc tố chuột B16F10, kiểm tra độc tính tế bào và xác định phần trăm ức chế sản sinh hàm lượng melanin nội bào dưới tác dụng của cao phân đoạn F1 ở các nồng độ thử nghiệm khác nhau.
• Phân tích hóa học bằng GC-MS: Phân tích mẫu cao phân đoạn F1 có hoạt tính mạnh nhất trên hệ thống sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) để nhận diện các hợp chất hóa học dựa trên cơ sở dữ liệu phổ khối chuẩn.
• Xử lý số liệu: Số liệu thí nghiệm được lặp lại 3 lần, tính giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (SD), phân tích ANOVA và xác định hệ số tương quan giữa hàm lượng TPC, TFC với các chỉ số hoạt tính sinh học.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Giới thiệu

Chương 1 thiết lập khung cơ sở cho đề tài, làm rõ tính cấp thiết của việc tìm kiếm các chất kháng oxy hóa và ức chế tyrosinase từ thực vật. Chương này xác định mục tiêu nghiên cứu, 5 nội dung thực nghiệm, đối tượng khảo sát (lá, thân, thịt quả, vỏ quả dứa tại Tắc Cậu và Hòn Đất), phạm vi không gian - thời gian (5/2018 - 1/2021). Đồng thời, chương trình bày ý nghĩa khoa học trong việc bổ sung dẫn liệu hoạt tính sinh học của dứa, ý nghĩa thực tiễn trong việc gia tăng giá trị kinh tế và giảm thiểu ô nhiễm môi trường từ phụ phẩm vỏ dứa, cùng tính mới của luận án.

Chương 2: Tổng quan tài liệu

Chương 2 cung cấp bức tranh tổng quan học thuật toàn diện gồm 9 tiểu mục chính:

• Đặc điểm thực vật học, nguồn gốc từ Paraguay, phân loại chi Ananas, 3 nhóm dứa chính tại Việt Nam (Queen, Cayenne, Spanish) và đặc trưng canh tác dứa tại cù lao Tắc Cậu (mô hình miệt vườn 3 tầng: cau, dừa, dứa) và Hòn Đất.
• Tổng hợp các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước về thành phần hóa sinh, bromelain và các thử nghiệm kháng oxy hóa, ức chế enzyme.
• Phân loại 4 nhóm hợp chất thứ cấp thực vật (polyphenol, terpenoid, alkaloid, hợp chất chứa lưu huỳnh) và vai trò sinh học.
• Lý thuyết gốc tự do ROS, RNS, tác hại sinh học, cơ chế kháng oxy hóa bậc 1 (HAT, SET-PT, SPLET) và bậc 2 của các nhóm polyphenol, flavonoid, vitamin C, vitamin E.
• Cấu trúc không gian, trung tâm hoạt động chứa Cu và cơ chế xúc tác chuyển hóa L-tyrosine và L-DOPA của enzyme tyrosinase.
• Cấu trúc và cơ chế sinh tổng hợp hạt sắc tố melanosome trong tế bào hắc tố melanocyte.
• Cơ sở lý thuyết của các phương pháp định danh hình thái, sinh học phân tử (vùng gen ITS), kỹ thuật trích ly siêu âm, sắc ký cột silica gel, các phản ứng đo quang phổ in vitro, nuôi cấy tế bào B16F10 và nguyên lý phân tích phổ GC-MS.

Chương 3: Phương pháp nghiên cứu

Chương 3 mô tả cụ thể các phương tiện, hóa chất, chủng tế bào B16F10, enzyme tyrosinase (Agaricus bisporus), và quy trình triển khai chi tiết cho 5 nội dung nghiên cứu:

• Bố trí thí nghiệm trích ly và khảo sát chọn nguồn nguyên liệu (so sánh mẫu Hòn Đất và Tắc Cậu trong dung môi ethanol và methanol); quy trình tách chiết DNA bằng CTAB, phản ứng PCR nhân bản đoạn gen ITS và giải trình tự gen.
• Bố trí thí nghiệm định lượng TPC, TFC và quy trình thử nghiệm hoạt tính khử DPPH, khử ion Fe3+, khử ion Cu2+, và ức chế tyrosinase in vitro trên cao methanol của 4 bộ phận dứa Tắc Cậu.
• Quy trình vận hành sắc ký cột silica gel phân tách cao methanol vỏ dứa với các tỷ lệ pha động để thu các phân đoạn F1, F2... và phương pháp đánh giá hoạt tính của từng phân đoạn.
• Quy trình nuôi cấy dòng tế bào u hắc tố B16F10, bố trí thử nghiệm đo lường phần trăm ức chế sản sinh hắc tố melanin dưới tác động của phân đoạn F1.
• Quy trình vận hành và thông số phân tích sắc ký khí ghép khối phổ GC-MS trên phân đoạn F1.
• Phương pháp xử lý dữ liệu và thống kê sinh học.

Chương 4: Kết quả và thảo luận

Chương 4 trình bày toàn bộ các phát hiện thực nghiệm của luận án:

1. Kết quả chọn nguồn nguyên liệu, dung môi và định danh phân tử:
   • Cao chiết dứa vùng sinh thái Tắc Cậu thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa vượt trội hơn so với vùng Hòn Đất.
   • Dung môi trích ly methanol cho hiệu suất trích ly và hoạt tính sinh học cao hơn dung môi ethanol.
   • Kết quả phân tích trình tự vùng gen ITS đối chiếu trên ngân hàng gen NCBI (BLAST) khẳng định mẫu nghiên cứu thuộc chi Ananas, loài Ananas comosus (L.).
2. Hàm lượng TPC, TFC và hoạt tính sinh học của các cao thô methanol dứa Tắc Cậu:
   • Hàm lượng polyphenol tổng số (TPC) đạt giá trị cao nhất ở mẫu cao chiết lá-methanol.
   • Hàm lượng flavonoid tổng số (TFC) đạt giá trị cao nhất ở mẫu cao chiết vỏ quả-methanol.
   • Hoạt tính khử gốc tự do DPPH: Cao lá-methanol có khả năng khử mạnh nhất với giá trị IC50 đạt 31,27 ± 3,91 µg/mL.
   • Hoạt tính khử ion kim loại: Cao vỏ quả-methanol thể hiện hoạt tính khử ion Fe3+ và khử ion Cu2+ mạnh nhất, với giá trị IC50 lần lượt là 97,72 ± 0,42 µg/mL và 220,95 ± 8,20 µg/mL.
   • Hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase in vitro: Cao vỏ quả-methanol thể hiện khả năng ức chế mạnh nhất trong 4 bộ phận khảo sát, do đó vỏ dứa Tắc Cậu được lựa chọn làm nguyên liệu phân tách sắc ký.
3. Kết quả phân tách sắc ký và khảo sát hoạt tính cao phân đoạn vỏ dứa:
   • Quá trình sắc ký cột silica gel cao chiết methanol vỏ dứa thu nhận các phân đoạn khác nhau, trong đó phân đoạn ký hiệu F1 thể hiện hoạt tính sinh học cao nhất.
   • Hoạt tính kháng oxy hóa của phân đoạn F1: IC50 khử DPPH đạt 14,52 ± 0,44 µg/mL; IC50 khử Cu2+ đạt 18,78 ± 2,55 µg/mL.
   • Hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase in vitro của phân đoạn F1: đạt giá trị IC50 là 84,98 ± 5,06 µg/mL.
4. Hiệu quả ức chế sản sinh melanin trên dòng tế bào u hắc tố B16F10:
   • Thử nghiệm trên dòng tế bào B16F10 cho thấy phân đoạn F1 ở nồng độ 25 µg/mL có khả năng ức chế 50,79% sự hình thành sắc tố melanin so với nhóm đối chứng mà không gây độc tế bào.
5. Kết quả phân tích thành phần hóa học bằng GC-MS:
   • Phổ GC-MS của phân đoạn F1 vỏ dứa ghi nhận sự hiện diện của các hợp chất phenolic và acid hữu cơ có hoạt tính sinh học gồm: succinic acid, ferulic acid, p-coumaric acid, cinnamic acid và 2-ethylhexyl benzoate.

Mẫu thử nghiệm	TPC / TFC cao nhất	IC50 khử DPPH (µg/mL)	IC50 khử Fe3+ (µg/mL)	IC50 khử Cu2+ (µg/mL)	IC50 ức chế Tyrosinase in vitro (µg/mL)	Ức chế Melanin trên tế bào B16F10
Cao lá - MeOH	TPC cao nhất	31,27 ± 3,91	-	-	-	-
Cao vỏ - MeOH	TFC cao nhất	-	97,72 ± 0,42	220,95 ± 8,20	Cao nhất (trong 4 cao thô)	-
Phân đoạn F1 vỏ dứa	-	14,52 ± 0,44	-	18,78 ± 2,55	84,98 ± 5,06	50,79% (ở 25 µg/mL)

Chương 5: Kết luận và đề xuất

Chương 5 tóm kết toàn bộ kết quả nghiên cứu: định danh chính xác loài dứa Tắc Cậu là Ananas comosus (L.), xác định lá và vỏ dứa là các bộ phận có hoạt tính kháng oxy hóa và ức chế tyrosinase vượt trội; khẳng định phân đoạn F1 từ vỏ dứa có hiệu lực cao trong ức chế enzyme tyrosinase in vitro và ức chế 50,79% melanin trên tế bào B16F10; nhận diện 5 hợp chất chính qua phổ GC-MS. Chương này đưa ra các đề xuất về việc tiếp tục tinh chế các đơn chất tinh khiết từ phân đoạn F1 và nghiên cứu ứng dụng thử nghiệm trong các công thức dược mỹ phẩm.

Kết quả và những đóng góp mới

Các đóng góp về mặt lý luận và khoa học:

• Bổ sung dẫn liệu khoa học có hệ thống về đặc điểm di truyền phân tử (trình tự vùng gen ITS), hàm lượng hợp chất thứ cấp (polyphenol tổng số, flavonoid tổng số) của cây dứa (Ananas comosus (L.)) tại hai vùng sinh thái Kiên Giang (Tắc Cậu và Hòn Đất).
• Cung cấp dữ liệu thực nghiệm so sánh toàn diện về năng lực kháng oxy hóa qua 3 cơ chế (khử DPPH, khử Fe3+, khử Cu2+) và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase in vitro giữa các bộ phận lá, thân, thịt quả và vỏ quả.
• Chứng minh mối quan hệ giữa các hợp chất phenolic, flavonoid với hoạt tính kháng oxy hóa và ức chế enzyme tạo sắc tố của cây dứa.

Các đóng góp về mặt thực tiễn và ứng dụng:

• Xác định vỏ dứa – nguồn phụ phẩm chiếm tỷ trọng lớn trong công nghiệp chế biến và tiêu thụ quả tươi – là nguồn nguyên liệu giàu hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học cao.
• Phân lập thành công phân đoạn F1 từ cao methanol vỏ dứa có khả năng ức chế 50,79% sự sản sinh sắc tố melanin trên dòng tế bào u hắc tố da B16F10 ở nồng độ 25 µg/mL.
• Nhận diện các cấu phần hóa học trong phân đoạn F1 bằng GC-MS gồm succinic acid, ferulic acid, p-coumaric acid, cinnamic acid, 2-ethylhexyl benzoate.
• Mở ra hướng ứng dụng nguồn phụ phẩm vỏ quả dứa trong ngành y dược và hóa mỹ phẩm (phát triển các sản phẩm hỗ trợ điều trị và chăm sóc da liên quan đến tăng sắc tố như sạm nám, tàn nhang, bảo vệ tế bào trước tác nhân oxy hóa), đồng thời góp phần giảm thiểu ô nhiễm môi trường và nâng cao chuỗi giá trị cho ngành canh tác dứa tại Đồng bằng sông Cửu Long.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất:

• Luận án đề xuất tiếp tục nghiên cứu quy trình công nghệ chiết tách và tinh chế các hợp chất có hoạt tính sinh học từ vỏ dứa ở quy mô lớn hơn để ứng dụng làm nguyên liệu cho ngành dược - mỹ phẩm.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu:

• Phạm vi thu mẫu nguyên liệu mới tập trung tại hai vùng sinh thái Tắc Cậu và Hòn Đất thuộc tỉnh Kiên Giang trong giai đoạn từ tháng 5/2018 đến tháng 1/2021.
• Quá trình phân tách hóa học ở phân đoạn F1 mới dừng lại ở mức phân tích nhận diện thành phần qua sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS), chưa thực hiện phân lập tinh khiết từng đơn chất và xác định cấu trúc bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR).
• Thử nghiệm sinh học ức chế hình thành sắc tố melanin mới tiến hành trên mô hình in vitro và in vivo tế bào u hắc tố chuột B16F10, chưa thực hiện khảo sát trên mô hình động vật sống hoàn chỉnh hoặc thử nghiệm lâm sàng trên người.

Hướng nghiên cứu tiếp theo:

• Tiếp tục phân lập, tinh chế sâu và xác định cấu trúc hóa học chi tiết của từng hợp chất đơn lẻ từ phân đoạn F1 vỏ dứa.
• Mở rộng nghiên cứu cơ chế tác động ở mức độ biểu hiện gen và protein liên quan đến con đường sinh tổng hợp melanin trong tế bào.
• Đánh giá độc tính bán trường diễn, độ an toàn và hiệu quả ức chế sắc tố trên các mô hình động vật thí nghiệm in vivo tiến tới thử nghiệm ứng dụng trong các chế phẩm thực tế.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo hữu ích cho các nhóm đối tượng:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học, sinh viên và giảng viên thuộc các chuyên ngành Công nghệ sinh học, Hóa sinh học, Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Dược học và Nông nghiệp: có thể tham khảo phương pháp luận nghiên cứu kết hợp giữa hóa thực vật, khảo sát hoạt tính enzyme in vitro và thử nghiệm sinh học trên mô hình dòng tế bào động vật.
• Các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp sản xuất trong lĩnh vực dược phẩm, mỹ phẩm: có thể khai thác các dẫn liệu thực nghiệm về nồng độ IC50, tỷ lệ ức chế melanin và thành phần hóa học của cao chiết vỏ dứa để định hướng nghiên cứu công thức sản phẩm làm sáng da, chống lão hóa và phòng ngừa rối loạn sắc tố.
• Các nhà quản lý nông nghiệp và chế biến thực phẩm: tham khảo cơ sở khoa học để xây dựng các giải pháp tận thu, gia tăng giá trị kinh tế từ nguồn phụ phế phẩm nông nghiệp sau thu hoạch và chế biến dứa.

Các phần nội dung đáng tham khảo nhất trong văn bản:

• Quy trình trích ly hỗ trợ sóng siêu âm và các phương pháp đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa đa cơ chế (DPPH, Fe3+, Cu2+) tại Chương 3.
• Phương pháp thử nghiệm ức chế enzyme tyrosinase in vitro và thử nghiệm ức chế melanin trên dòng tế bào B16F10 tại Chương 3 và Chương 4.
• Dữ liệu so sánh hoạt tính giữa các bộ phận cây dứa và bảng phân tích thành phần GC-MS phân đoạn F1 tại Chương 4.

Câu hỏi thường gặp

1. Mẫu dứa nghiên cứu được định danh chính xác là loài gì và thu thập tại những địa bàn nào?

Dựa trên phân tích các đặc điểm hình thái kết hợp giải trình tự đoạn gen chỉ thị ITS và đối chiếu dữ liệu BLAST trên NCBI, mẫu dứa nghiên cứu được định danh chính xác thuộc chi Ananas, loài Ananas comosus (L.). Mẫu được thu thập tại hai vùng sinh thái của tỉnh Kiên Giang: vùng Tắc Cậu (vùng sinh thái Tây Sông Hậu, thuộc huyện Châu Thành và Gò Quao) và vùng Hòn Đất (vùng sinh thái Tứ Giác Long Xuyên).

2. Bộ phận nào của cây dứa có hàm lượng polyphenol và flavonoid tổng cao nhất, và hoạt tính kháng oxy hóa thể hiện như thế nào?

Kết quả định lượng cho thấy hàm lượng polyphenol tổng số (TPC) đạt cao nhất trong mẫu cao chiết lá-methanol, trong khi hàm lượng flavonoid tổng số (TFC) đạt cao nhất trong mẫu cao chiết vỏ quả-methanol. Về hoạt tính kháng oxy hóa:

• Khả năng trung hòa gốc tự do DPPH mạnh nhất thuộc về cao lá-methanol với giá trị IC50 = 31,27 ± 3,91 µg/mL.
• Khả năng khử ion Fe3+ và Cu2+ mạnh nhất thuộc về cao vỏ quả-methanol với giá trị IC50 lần lượt là 97,72 ± 0,42 µg/mL và 220,95 ± 8,20 µg/mL.

3. Vì sao vỏ dứa Tắc Cậu được chọn để thực hiện phân tách sắc ký cột?

Trong khảo sát sàng lọc hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase in vitro trên các mẫu cao thô methanol từ 4 bộ phận (lá, thân, thịt quả, vỏ quả), cao chiết vỏ quả-methanol dứa Tắc Cậu thể hiện hoạt tính ức chế enzyme mạnh nhất, đồng thời có hàm lượng flavonoid tổng cao nhất và hoạt tính khử ion kim loại mạnh nhất, do đó được lựa chọn để tiến hành phân tách sắc ký cột silica gel.

4. Cao phân đoạn F1 từ vỏ dứa thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa, ức chế tyrosinase và ức chế melanin như thế nào?

Phân đoạn F1 thu được từ sắc ký cột silica gel cao methanol vỏ dứa thể hiện hoạt tính sinh học vượt trội:

• Hoạt tính khử gốc tự do DPPH đạt IC50 = 14,52 ± 0,44 µg/mL.
• Hoạt tính khử ion Cu2+ đạt IC50 = 18,78 ± 2,55 µg/mL.
• Hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase in vitro đạt IC50 = 84,98 ± 5,06 µg/mL.
• Trên mô hình dòng tế bào u hắc tố B16F10, phân đoạn F1 ở nồng độ 25 µg/mL ức chế 50,79% sự sản sinh sắc tố melanin so với đối chứng mà không gây độc tế bào.

5. Kỹ thuật phân tích GC-MS đã phát hiện những hợp chất hóa học nào trong phân đoạn F1 vỏ dứa?

Kết quả phân tích sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) trên mẫu cao phân đoạn F1 vỏ dứa đã nhận diện được các hợp chất hữu cơ và phenolic có hoạt tính sinh học gồm: succinic acid, ferulic acid, p-coumaric acid, cinnamic acid và 2-ethylhexyl benzoate.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Nguyễn Thị Thu Hậu đã thực hiện thành công việc định danh loài Ananas comosus (L.) vùng Tắc Cậu và đánh giá toàn diện hàm lượng polyphenol, flavonoid, hoạt tính kháng oxy hóa cùng khả năng ức chế enzyme tyrosinase của các bộ phận lá, thân, thịt quả và vỏ quả cây dứa. Nghiên cứu đã chứng minh cao methanol vỏ dứa và phân đoạn F1 sở hữu hoạt tính kháng oxy hóa mạnh, ức chế hiệu quả enzyme tyrosinase in vitro và làm giảm 50,79% lượng melanin trên dòng tế bào B16F10 ở nồng độ 25 µg/mL. Phân tích GC-MS đã xác định sự hiện diện của các acid phenolic và hợp chất hoạt tính quan trọng như succinic acid, ferulic acid, p-coumaric acid, cinnamic acid trong phân đoạn F1. Kết quả công trình khẳng định tiềm năng ứng dụng giá trị của phụ phẩm vỏ quả dứa trong lĩnh vực y dược và hóa mỹ phẩm, đồng thời đóng góp cơ sở khoa học cho việc tận dụng phế phụ phẩm nông nghiệp tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Dứa (Ananas comosus (L.) thuộc họ bromeliaceae có nguồn gốc từ Paraguay là loại trái cây có giá trị dinh dưỡng cao đứng thứ ba trên thế giới chỉ đứng sau chuối và cây có múi (cam quýt) (Vrianty et al. Thịt qủa dứa có các hợp chất có hoạt tính sinh học cao như: mangan, vitamin A, B, (B1, B6, folates), C và các loại acid hữu cơ đặc biệt là malic acid, citric acid, folic acid, βcarotene, enzyme bromelain (Ramsden & Riley, 2014). Trong cơ thể của sinh vật (kể cả con người) luôn sản sinh ra các gốc tự do, các gốc tự do này dễ phản ứng với các gốc khác gần kề dẫn đến sự sản sinh các gốc tự do mới là nguyên nhân dẫn tới sự phá huỷ các bào quan và cấu trúc bên trong tế bào (đột biến). Đột biến là nguyên nhân dẫn đến sự thoái hóa tế bào làm xuất hiện các bệnh hiểm nghèo (Ghasemzadeh, 2012; Vrianty et al.

Các hợp chất kháng oxy hoá là những hợp chất làm chậm hoặc ngăn chặn được sự phát triển của các gốc tự do bảo vệ tế bào và cơ thể. Hệ thống kháng oxy hóa xảy ra trong cơ thể con người có thể làm sạch các gốc tự do, giữ cân bằng giữa quá trình oxy hóa và kháng oxy hóa. Đồng thời, những bất lợi của sự thoái hóa tế bào có thể được ngăn ngừa bằng cách bổ sung các chất kháng oxy hóa từ thực phẩm và dược liệu (Ghasemzadeh, 2012; Ha & Thu, 2009; Vrianty et al. Tyrosinase là enzyme chính trong con đường sinh tổng hợp melanin, là phức hợp các hạt sắc tố trong da, tóc, niêm mạc võng mạc, melanin bao quanh sợ trục thần kinh.

Nám da là hiện tượng gia tăng hàm lượng của melanin để bảo vệ da, giúp da chống lại tia cực tím (Bonesi et al. Kong et al., 2000; Pires et al. Vì thế, cấu trúc của tyrosinase và các chất ức chế tyrosinase được nghiên cứu với mục tiêu sàng lọc và tuyển chọn nguồn nguyên liệu trong ngành dược liệu và mỹ phẩm (Lai et al., 2018; Yuan et al. Những hoạt chất ức chế tyrosinase được tổng hợp bằng phương pháp hóa học chưa thật sự an toàn và hiệu quả.

Chính vì thế, vấn đề tìm kiếm các hợp chất ức chế tyrosinase từ thiên nhiên được nghiên cứu ở phạm vi sinh hóa để bước đầu chọn lọc nguyên liệu để ứng dụng vào lĩnh vực y học, công nghiệp thực phẩm, xử lý môi trường và mỹ phẩm (Lai et al., 2018; Yuan et al. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về khả năng kháng oxy hóa của cao chiết trích ly từ thịt quả, lá, vỏ quả dứa nhưng vẫn chưa có đánh giá tổng thể so sánh về khả năng kháng oxy hóa về cao chiết được trích ly từ nguyên liệu là lá, Chuyên ngành Công nghệ sinh học 1 Viện NC&PT Công nghệ sinh hoc Luận án Trường Đại học Cần Thơ thân, thịt quả và vỏ dứa. Đồng thời, có rất ít nghiên cứu về khả năng ức chế hoạt động tyrosinase của các loại cao chiết từ dứa. Nhiều năm gần đây những nghiên cứu về ức chế tyrosinase từ các hợp chất thiên nhiên được nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu.

Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu về khả năng ức chế tyrosinase của một số cao chiết củ cải trắng, cây huỳnh anh, vi tảo, nấm rơm, mít dai, hoa hòe, lá tía tô (Hưng, 2014; L. Loan et al., 2018; Mai & Mai, 2018; Phú, 2019; Trúc et al., 2020),… nhưng chưa có nghiên cứu về ức chế tyrosinase của cao chiết cây dứa. Ngoài ra, hàm lượng các hợp chất thiên nhiên, hoạt tính kháng oxy hóa và ức chế tyrosinase phụ thuộc nhiều vào các hợp chất khác nhau có trong tế bào từng loại cây, từng vùng sinh thái (đối với cây cùng loài), từng độ tuổi của cây (đối với cây cùng loài và cùng vùng sinh thái) thậm chí trên cùng một cây ở các bộ phận khác nhau thì hàm lượng và hoạt tính sinh học cũng không giống nhau. Mục tiêu của luận án là nghiên cứu về “Khả năng kháng oxy hóa và ức chế enzyme tyrosinase của cây dứa (Ananas comosus (L.2 Mục tiêu luận án Đánh giá khả năng kháng oxy hóa và ức chế enzyme tyrosinase của cao chiết từ dứa (Ananas comosus (L.) với mục tiêu khảo sát nguồn nguyên liệu tiềm năng từ cây dứa.3 Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Khảo sát chọn vùng nguyên liệu và dung môi chiết xuất cao và định danh loài dứa vùng Tắc Cậu.

Nội dung 2: Khảo sát khả năng kháng oxy hóa (hoạt tính khử DPPH, hoạt tính khử ion Fe3+ thành ion Fe2+, hoạt tính khử ion Cu2+ thành ion Cu+) và khả năng ức chế tyrosinase của cao methanol dứa Tắc Cậu. Nội dung 3: Sắc ký tách phân đoạn cao chiết methanol vỏ dứa và khảo sát khả năng kháng oxy hóa và ức chế tyrosinase của cao phân đoạn có hoạt tính cao. Nội dung 4: Khảo sát khả năng ức chế sự sản sinh melanin của cao phân đoạn có hoạt tính cao từ cao chiết methanol F1 vỏ dứa trên dòng tế bào B16F10. Nội dung 5: Khảo sát các hợp chất trong cao phân đoạn F1 methanol vỏ dứa có khả năng kháng oxy hóa và ức chế tyrosinase thông qua phân tích phổ GC-MS.

Chuyên ngành Công nghệ sinh học 2 Viện NC&PT Công nghệ sinh hoc Luận án Trường Đại học Cần Thơ 1.4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 1.1 Đối tượng nghiên cứu Đề tài nghiên cứu trên đối tượng cây dứa (lá, thân, thịt quả và vỏ quả) thu hái tại Tắc Cậu (vùng sinh thái Tây Sông Hậu) của tỉnh Kiên Giang.2 Phạm vi nghiên cứu Đề tài tập trung nghiên cứu về khả năng kháng oxy hóa (được tiến hành bằng 3 phương pháp khử DPPH, khử ion Fe3+, khử ion Cu2+) và khả năng ức chế hoạt tính của enzyme tyrosinase của cao chiết từ lá, thân, thịt quả và vỏ cây dứa. Các nghiên cứu được thực hiện từ tháng 5/2018 đến tháng 1/2021 tại Viên nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ và Trung tâm Quản lý thực hành thí nghiệm, Trường Đại học Kiên Giang.5 Ý nghĩa của nghiên cứu 1.1 Ý nghĩa khoa học Luận án cung cấp thông tin khoa học hữu ích về khả năng kháng oxy hóa và ức chế tyrosinase của cao chiết từ cây dứa với mục tiêu sử dụng nguyên liệu từ cây dứa cung cấp trong các ngành y dược học và hóa mỹ phẩm.2 Ý nghĩa thực tiễn Kết quả nghiên cứu cho thấy tiềm năng sử dụng phụ phế phẩm trong công nghiệp chế biến dứa, điều chế cao chiết từ vỏ dứa sử dụng nguồn nguyên liệu trong y dược học giúp giảm thiểu ô nhiễm môi trường đồng thời sẽ làm tăng giá trị sản phẩm của dứa trong ngành nông nghiệp canh tác dứa.6 Tính mới của luận án Luận án đã xác định lá, thân, thịt quả và vỏ dứa có hoạt tính kháng oxy hóa và ức chế hoạt động của tyrosinase. Cao chiết methanol vỏ dứa có hoạt tính kháng oxy hóa và ức chế hoạt động của enzyme tyrosinase cao. Kết quả nghiên cứu của luận án cung cấp thông tin cho ngành y dược và hóa mỹ phẩm.

Kết quả ức chế sự sản sinh melanin trên dòng tế bào hắc tố B16F10 của cao phân đoạn F1 tách từ cao methanol vỏ dứa mở ra hướng ứng dụng mới của phụ phế phẩm quả dứa trong y dược học (phòng và trị các bệnh có liên quan đến việc hình thành hắc tố melanin như Alzheimer, Parkinson, tàn nhang, nám da và những bệnh liên quan đến dòng tế bào u hắc tố). Chuyên ngành Công nghệ sinh học 3 Viện NC&PT Công nghệ sinh hoc Luận án Trường Đại học Cần Thơ Hình 1.1: Sơ đồ tóm tắt các nội dung nghiên cứu luận án Chuyên ngành Công nghệ sinh học 4 Viện NC&PT Công nghệ sinh hoc Luận án Trường Đại học Cần Thơ CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan về cây dứa (Ananas comosus) 2.1 Nguồn gốc Dứa còn có tên khác như: thơm, khóm hay trái huyền nương. Dứa có tên khoa học (Ananas comosus (L.) thuộc họ Bromeliaceae chi Ananas, trong chi này có 6 loài, trong đó loài Ananas comosus là có giá trị kinh tế cao nhất. Dứa là một loại quả nhiệt đới có nguồn gốc từ Paraguay và được trồng phổ biến ở miền Nam Brasil, miền Bắc Argentina và rất nhiều nơi khác trên thế giới (Ogawa et al.

Dứa có tên tiếng anh gọi là Pineapple. Các nhà thám hiểm Tây Ban Nha thấy hình dáng ngoài của quả dứa giống chóp quả Thông nên đặt tên là “Pine”. Người Anh thêm chữ “apple” để nói rõ hơn về tính ngọt dịu của quả dứa (Li et al., 2014; Ogawa et al. Dứa là loại trái cây trồng phổ biến ở rất nhiều nước trên thế giới, là loại trái cây ưa chuộng đứng thứ ba trên thế giới, sau chuối và cây có múi (Ivanova et al., 2019; Ogawa et al.

Ở Việt Nam, dứa được trồng nhiều ở Phú Thọ, Ninh Bình, Lâm Đồng, Long An, Hậu Giang, Kiên Giang, Cần Thơ.2 Phân Loại Giới: Thực vật (Plantae) Ngành: Thực vật có hoa (Angiospermae) Lớp: Một lá mầm (Monocots) Nhánh: Thài lài (Commelinids) Bộ: Hòa thảo (Poales) Họ: Dứa (Bromeliaceae) Phân họ: Bromelioideae Chi: Dứa (Ananas) Loài: A.1: Cây dứa Ananas comosus Tên khoa học: Ananas comosus (L. Tên tiếng việt: dứa Dứa thuộc họ Bromeliaceae, có khoảng 2.794 loài, trong đó có 56 loài có ngưỡng thích nghi rộng về không gian sống như từ dạng sống trên mặt đất đến dạng thân leo, từ dạng ưa bóng râm đến nơi có nhiều ánh sáng, từ vùng khí hậu Chuyên ngành Công nghệ sinh học 5 Viện NC&PT Công nghệ sinh hoc Luận án Trường Đại học Cần Thơ nhiệt đới nóng ẩm, đến vùng cận nhiệt đới có khí hậu lạnh và khô (Dey & Chaudhuri, 2016; Ivanova et al. Ở Việt Nam dứa có ba nhóm phổ biến: Nhóm Queen Dứa thuộc nhóm Queen được trồng phổ biến ở Đồng Bằng Sông Cửu Long vì nó thích nghi với các điều kiện khí hậu đất đai có pH thấp, thuộc vùng phèn và chống chịu hạn tốt. Lá đầy gai và ngắn hơn nhóm Cayenne.

Trọng lượng trái trung bình 1 - 1,2 kg, khi chín cả vỏ và thịt quả có màu vàng, các giống tiêu biểu gồm: Golden Queen, Egyptian, Abachi, Balck Riplay, Green Riplay, Ruby, Singapore, Canning và Pernambuco (Hải, 2017). Nhóm Cayenne Giống tiêu biểu là Smooth Cayenne (Cayenne Lissa). Nhóm này có năng suất cao. Lá gần như không gai, chỉ có một ít gai ở chóp lá.

Quả to trung bình 2 - 2,5 kg, dạng hình trụ, mắc dẹp và cạn, thích hợp làm nguyên liệu cho chế biến và xuất khẩu. Vỏ trái khi chín có màu vàng nhạt đến vàng. Tuy nhiên, giống này chỉ phát triển tốt trên đất có pH trung tính và có sự đầu tư thâm canh cao (Hải, 2017).