Giới Thiệu Kỹ Thuật PCR và Real-Time PCR

Tài liệu nghiên cứu Thiet bi va ktcnsh 2 real time pcr nk 06, tổng hợp lý thuyết và thực hành, cung cấp kiến thức chuyên sâu về ., phục vụ nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

• Trường học: Trường Đại Học
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Hướng Dẫn Chi Tiết Về Kỹ Thuật PCR và Real-Time PCR
• Loại tài liệu: bài viết
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• 1. GIỚI THIỆU KỸ THUẬT PCR VÀ REAL-TIME PCR
• 2. PCR LÀ GÌ?
• 2.1. PCR DNA và cơ chế tự nhân đôi trong tế bào
• 2.2. Primer DNA polymerase và các thành phần cần thiết trong test tube
• 2.3. Phản ứng PCR diễn ra như thế nào?
• 2.4. Quy trình thực hiện xét nghiệm PCR
• 2.5. Ưu điểm của kỹ thuật PCR
• 3. REAL TIME PCR LÀ GÌ?
• 3.1. Khái niệm Real Time PCR
• 3.2. Thực chất và hệ thống Real Time PCR
• 3.3. Cách thức có tín hiệu Real Time phản ứng PCR đang diễn ra
• 3.4. Phạm nhuộm chọn sợi đôi DNA
• 3.5. Giải pháp Probe phát huỳnh quang
• 3.5.1. Probe phát huỳnh quang 3 dạng chính
• 3.5.2. Molecular Beacons
• 3.5.3. FRET Probes
• 3.5.4. Probe dựa trên phân cắt - TaqMan
• 3.5.5. Probe gắn với primer: Ampliflour
• 3.6. So sánh các loại probe và primers
• 3.7. Quy trình thực hiện Real Time PCR
• 3.8. Giải pháp Real Time PCR
• 3.8.1. Theo dõi phản ứng PCR đang xảy ra
• 3.8.2. Định lượng nồng độ DNA mẫu trước phản ứng
• 3.8.3. Dùng Melt Curve để xác định đặc tính sản phẩm khuếch đại
• 3.8.4. Phân tích end-point, xác định dương tính hoặc âm tính
• 4. MỘT SỐ SO SÁNH KHÁC
• 5. THỜI ĐIỂM TOÁT NHẤT ĐỂ CÓ KẾT QUẢ ĐỊNH LƯỢNG
• 5.1. Chu kỳ ngưỡng (Threshold Cycle, Ct)
• 5.2. Đầu là thời điểm toát nhất để có kết quả định lượng

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Kỹ Thuật PCR và Real Time PCR

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) và Real-Time PCR là hai phương pháp quan trọng trong sinh học phân tử. PCR được phát minh bởi Kary Mullis vào năm 1985, cho phép nhân bản DNA một cách nhanh chóng và hiệu quả. Real-Time PCR, hay còn gọi là qPCR, là phiên bản nâng cao của PCR, cho phép theo dõi quá trình nhân bản DNA trong thời gian thực. Cả hai kỹ thuật này đều có ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu gen, chẩn đoán bệnh và phát hiện vi sinh vật.

1.1. Nguyên Lý Cơ Bản Của Kỹ Thuật PCR

PCR hoạt động dựa trên nguyên lý tái tạo DNA thông qua ba bước chính: biến tính, bắt cặp và kéo dài. Trong bước biến tính, DNA được làm nóng để tách rời các chuỗi. Sau đó, ở nhiệt độ thấp hơn, các primer sẽ gắn vào các đoạn DNA mục tiêu. Cuối cùng, enzyme Taq polymerase sẽ kéo dài các chuỗi DNA mới.

1.2. Sự Khác Biệt Giữa PCR và Real Time PCR

PCR truyền thống chỉ cho phép phát hiện sản phẩm khuếch đại sau khi quá trình hoàn tất, trong khi Real-Time PCR cho phép theo dõi sản phẩm trong suốt quá trình. Điều này giúp xác định số lượng DNA ban đầu một cách chính xác hơn và nhanh chóng.

II. Quy Trình Thực Hiện Kỹ Thuật PCR

Quy trình thực hiện PCR bao gồm nhiều bước quan trọng từ chuẩn bị mẫu đến phân tích kết quả. Đầu tiên, mẫu DNA cần được chiết xuất và tinh sạch. Sau đó, các thành phần như dNTPs, primers, Taq polymerase và buffer sẽ được chuẩn bị trong một ống nghiệm. Quá trình PCR sẽ diễn ra trong máy nhiệt cycler với các chu kỳ nhiệt khác nhau.

2.1. Chuẩn Bị Mẫu DNA Cho PCR

Mẫu DNA cần được chiết xuất từ tế bào hoặc mô. Các phương pháp chiết xuất phổ biến bao gồm sử dụng kit thương mại hoặc phương pháp phenol-chloroform. Sau khi chiết xuất, DNA cần được kiểm tra độ tinh khiết và nồng độ trước khi tiến hành PCR.

2.2. Các Thành Phần Cần Thiết Trong PCR

Các thành phần chính trong phản ứng PCR bao gồm: Taq polymerase, dNTPs, primers, buffer và mẫu DNA. Taq polymerase là enzyme chịu trách nhiệm cho quá trình tổng hợp DNA, trong khi dNTPs là các nucleotide cần thiết cho việc xây dựng chuỗi DNA mới.

III. Ứng Dụng Của Kỹ Thuật PCR Trong Nghiên Cứu

Kỹ thuật PCR và Real-Time PCR có nhiều ứng dụng trong nghiên cứu sinh học, y học và công nghiệp thực phẩm. Chúng được sử dụng để phát hiện và định lượng gene, phân tích biến thể di truyền, và phát hiện vi sinh vật gây bệnh. Đặc biệt, Real-Time PCR đã trở thành công cụ quan trọng trong chẩn đoán bệnh truyền nhiễm.

3.1. Phát Hiện Gene và Biến Thể Di Truyền

PCR cho phép phát hiện và phân tích các gene cụ thể, giúp nghiên cứu các bệnh di truyền và các biến thể di truyền như SNP. Real-Time PCR cung cấp thông tin định lượng chính xác về mức độ biểu hiện của gene.

3.2. Ứng Dụng Trong Chẩn Đoán Bệnh

Real-Time PCR được sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán các bệnh truyền nhiễm như HIV, viêm gan B và C. Phương pháp này cho phép phát hiện nhanh chóng và chính xác sự hiện diện của virus trong mẫu bệnh phẩm.

IV. Thách Thức Trong Kỹ Thuật PCR

Mặc dù PCR và Real-Time PCR mang lại nhiều lợi ích, nhưng cũng tồn tại một số thách thức. Việc kiểm soát độ chính xác và độ nhạy của phản ứng là rất quan trọng. Ngoài ra, sự hiện diện của các chất ức chế trong mẫu có thể ảnh hưởng đến kết quả.

4.1. Các Vấn Đề Thường Gặp Trong PCR

Một số vấn đề thường gặp trong PCR bao gồm sự không đặc hiệu của primers, sự ức chế của các chất trong mẫu và sự biến đổi của enzyme. Những yếu tố này có thể dẫn đến kết quả không chính xác hoặc không đáng tin cậy.

4.2. Giải Pháp Để Tăng Độ Chính Xác

Để cải thiện độ chính xác của PCR, cần tối ưu hóa các điều kiện phản ứng như nồng độ primers, nhiệt độ và thời gian chu kỳ. Sử dụng các enzyme có độ nhạy cao và các kit thương mại chất lượng cũng là một giải pháp hiệu quả.

V. Kết Luận Về Kỹ Thuật PCR và Real Time PCR

Kỹ thuật PCR và Real-Time PCR đã cách mạng hóa nghiên cứu sinh học phân tử và y học. Chúng không chỉ giúp phát hiện nhanh chóng các bệnh truyền nhiễm mà còn hỗ trợ trong nghiên cứu di truyền và phát triển thuốc. Tương lai của kỹ thuật này hứa hẹn sẽ còn nhiều tiến bộ hơn nữa.

5.1. Tương Lai Của Kỹ Thuật PCR

Với sự phát triển của công nghệ, kỹ thuật PCR sẽ ngày càng được cải tiến, cho phép phát hiện nhanh hơn và chính xác hơn. Các nghiên cứu mới sẽ mở ra nhiều ứng dụng mới trong y học và sinh học.

5.2. Tầm Quan Trọng Của PCR Trong Nghiên Cứu

PCR và Real-Time PCR đóng vai trò quan trọng trong việc hiểu biết về gen và các bệnh lý liên quan. Chúng giúp các nhà nghiên cứu có cái nhìn sâu sắc hơn về cơ chế bệnh và phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả.

Nội dung chính

Giáo Trình Kỹ Thuật PCR Và Real-Time PCR

Tổng quan về giáo trình

Giáo trình "Hướng Dẫn Chi Tiết Về Kỹ Thuật PCR và Real-Time PCR" là tài liệu học thuật chuyên sâu thuộc lĩnh vực Sinh học phân tử và Công nghệ sinh học ứng dụng. Tài liệu được thiết kế nhằm phục vụ cho các học phần thực nghiệm phân tích acid nucleic ở bậc đào tạo đại học và sau đại học. Về mặt vị trí trong chương trình đào tạo, giáo trình đóng vai trò cầu nối giữa các nguyên lý di truyền học phân tử cơ bản và các quy trình công nghệ xét nghiệm sinh học hiện đại.

Mục tiêu học tập (learning outcomes) của tài liệu tập trung vào việc trang bị cho người học:

• Hiểu rõ cơ chế tự nhân đôi của DNA trong ống nghiệm dựa trên nền tảng enzym Taq polymerase.
• Nắm vững các thông số nhiệt động học của chu trình luân nhiệt ($94^\circ\text{C}$, $55-65^\circ\text{C}$, $72^\circ\text{C}$).
• Phân biệt bản chất hóa học và cơ chế phát quang giữa phẩm nhuộm chèn sợi đôi (Intercalating dyes) và các hệ thống đầu dò huỳnh quang đặc hiệu (Fluorescent probes).
• Làm chủ phương pháp định lượng acid nucleic ban đầu thông qua chu kỳ ngưỡng ($C_t$), phân tích đường cong nóng chảy (Melt Curve) và phân tích điểm cuối (End-point analysis).

Cấu trúc tài liệu tiếp cận theo logic thực nghiệm: khởi đầu từ lịch sử và thành phần hóa chất cơ bản của phản ứng PCR kinh điển, tiến tới cấu tạo tích hợp của hệ thống Real-Time PCR, chi tiết hóa cơ chế quang học của từng loại probe và kết thúc bằng giải thuật toán học trong phân tích dữ liệu định lượng. Điểm đặc sắc của giáo trình nằm ở việc kết hợp trực quan giữa lý thuyết phản ứng phân tử, các dữ liệu thống kê ứng dụng thực tế và sơ đồ chuyển đổi năng lượng huỳnh quang cộng hưởng (FRET).

---

Nội dung kiến thức cốt lõi

Các chương/chủ đề chính

1. Khái niệm và lịch sử phát minh kỹ thuật PCR: Trình bày định nghĩa phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction - PCR) như một phản ứng nhân bản chuỗi DNA quan tâm trong ống nghiệm (in vitro). Ghi nhận dấu mốc lịch sử phát minh thử nghiệm PCR của Kary Mullis vào năm 1985 và giải thưởng Nobel Hóa học được trao cho ông vào năm 1993. Phân tích sự tương đồng giữa cơ chế nhân đôi DNA trong tế bào và cơ chế phản ứng trong ống nghiệm với sự tham gia của mồi (primer) và DNA polymerase.

2. Thành phần hóa chất và chu trình luân nhiệt chuẩn: Mô tả chi tiết 5 thành phần thiết yếu trong ống phản ứng (test tube): Taq polymerase chịu nhiệt, hỗn hợp deoxynucleotide triphosphates (dNTPs), đoạn mồi xuôi và ngược (primers), DNA khuôn mẫu (template) và dung dịch đệm (buffer). Thiết lập chu trình nhiệt chuẩn gồm 3 bước lặp lại từ 30 đến 40 chu kỳ:

   • Biến tính (Denaturation) tại $94^\circ\text{C}$ (15 giây - 1 phút).
   • Bắt cặp (Annealing) tại $55-65^\circ\text{C}$ (15 giây - 1 phút).
   • Kéo dài (Extension) tại $72^\circ\text{C}$ (30 giây - 3 phút).

3. Quy trình thực hiện và phát hiện sản phẩm PCR truyền thống: Chuẩn hóa các bước xét nghiệm: chuẩn bị và ly trích DNA/RNA bằng ly tâm và nhiệt; thực hiện phản ứng trong máy luân nhiệt; phát hiện sản phẩm khuếch đại thông qua điện di gel agarose/chụp ảnh huỳnh quang hoặc kỹ thuật PCR-ELISA. Nêu rõ các ưu điểm cốt lõi của kỹ thuật: độ đặc hiệu cao, độ nhạy cao và thời gian thực hiện nhanh.

4. Nguyên lý và cấu tạo hệ thống Real-Time PCR: Định nghĩa kỹ thuật Real-Time PCR là phản ứng theo dõi trực tiếp quá trình nhân bản DNA theo từng chu kỳ nhiệt. Giới thiệu mô hình tích hợp phần cứng gồm 3 khối: Máy luân nhiệt (Thermal Cycler), Máy quang phổ huỳnh quang (Spectrofluorometer) và Máy tính phân tích dữ liệu (như hệ thống iCycler iQ).

5. Cơ chế phát tín hiệu huỳnh quang trong Real-Time PCR:

   • Phẩm nhuộm chèn sợi đôi: So sánh Ethidium bromide (tăng quang 25 lần khi gắn vào dsDNA) và SYBR Green I (bước sóng kích thích 490 nm, phát quang 530 nm, tăng quang 200 lần khi gắn vào dsDNA). Phân tích nhược điểm gắn không đặc hiệu vào các chuỗi không mong muốn hoặc primer-dimer.
   • Hệ thống probe huỳnh quang đặc hiệu: Phân loại 3 dạng chính:
     • Probe tách rời: Molecular Beacons (cấu trúc vòng mang trình tự bổ sung và nhánh kẹp mang Fluorophore - Quencher theo cơ chế FRET/Dark Quenchers), FRET Probes (hai đầu dò Donor - Receptor cách nhau 1-5 base).
     • Probe phân cắt: TaqMan Probe dựa trên hoạt tính 5'-3' exonuclease của Taq polymerase làm giải phóng Reporter (R) khỏi Quencher (Q) trong giai đoạn kéo dài mạch.
     • Probe gắn trực tiếp với primer: Amplifluor, Scorpion, LUX fluorogenic primers.

6. Động học phản ứng, Chu kỳ ngưỡng ($C_t$) và Ứng dụng phân tích: So sánh lý thuyết khuếch đại lũy thừa ($2^n$ qua các chu kỳ) với thực tế suy giảm hiệu suất (do enzyme suy giảm hoạt tính, cạn kiệt mồi và dNTP, sự phân tán tín hiệu ở pha bình nguyên). Thiết lập khái niệm Chu kỳ ngưỡng ($C_t$ - Threshold Cycle) tại pha logarit. Mô tả phương pháp xây dựng đường chuẩn qua dãy pha loãng bậc 10 ($10^7 - 10^1$ copies) để định lượng nồng độ ban đầu, sử dụng đường cong nóng chảy (Melt Curve) để kiểm tra độ đặc hiệu và phân tích điểm cuối (End-point analysis).

          [Tín hiệu huỳnh quang (RFU)]
                     |
                     |                           /--- Pha bình nguyên (Plateau)
                     |                          /
                     |                /--------/ 
                     |               /   (Pha Logarit)
     Threshold (Ct) -|- - - - - - - * 
                     |             /
       Baseline -----|------------/ 
                     +---------------------------------- [Số chu kỳ nhiệt (Cycle)]

Kiến thức nền tảng được xây dựng

Giáo trình củng cố nền tảng hóa sinh về cấu trúc xoắn kép DNA, liên kết hydro bổ sung giữa các base nitơ và động học phản ứng enzyme polymerase chịu nhiệt. Đồng thời, tài liệu cung cấp kiến thức quang lý học về hiện tượng truyền năng lượng huỳnh quang cộng hưởng (Förster Resonance Energy Transfer - FRET), sự tương tác giữa chất phát quang (Reporter/Fluorophore) và chất hấp thụ năng lượng (Quencher), từ đó làm sáng tỏ cơ chế triệt tiêu và phát xạ photon trong các cấu trúc probe phân tử.

Kỹ năng phát triển

• Kỹ năng kỹ thuật: Thiết lập thông số chu trình nhiệt; pha chế hỗn hợp phản ứng (Master Mix); lựa chọn chất chỉ thị phù hợp (SYBR Green hoặc Probe đặc hiệu).
• Kỹ năng phân tích: Đọc hiểu và phân tích đồ thị khuếch đại thời gian thực; xác định giá trị $C_t$ tại pha logarit; đánh giá độ tinh sạch và đặc hiệu của sản phẩm qua phổ phân tích nhiệt độ nóng chảy (Melt Curve).
• Kỹ năng ứng dụng: Xử lý kết quả định lượng mẫu chưa biết thông qua đường chuẩn (Standard curve); phát hiện các dạng đột biến đơn nucleotide (SNP) và phân biệt allele.

---

Phương pháp giảng dạy và học tập

Giáo trình áp dụng phương pháp tiếp cận sư phạm trực quan hóa và đối chiếu thực nghiệm. Các khái niệm phân tử trừu tượng được mô hình hóa thành chuỗi các bước biến đổi cấu trúc, có đối chiếu trực tiếp giữa sơ đồ phản ứng lý thuyết và diễn biến quang học ghi nhận bởi cảm biến máy tính.

Tài liệu tích hợp hệ thống học liệu đa phương tiện thông qua các liên kết mô phỏng định dạng flash/video:

• SYBR.swf: Minh họa cơ chế chèn của phân tử nhuộm vào rãnh xoắn kép DNA trong quá trình tổng hợp mạch mới.
• Beacon.swf: Trực quan hóa sự biến đổi cấu trúc từ dạng kẹp tóc (hairpin) sang dạng duỗi thẳng khi lai với mạch đích, làm tách rời Fluorophore khỏi Quencher.
• Fret.swf: Thể hiện sự chuyển dịch năng lượng giữa Donor và Receptor khi bắt cặp liền kề nhau trên mạch khuôn.
• Taqman.swf: Mô phỏng quá trình enzyme Taq polymerase di chuyển dọc mạch khuôn, thực hiện phản ứng thay mạch, phân cắt đầu dò TaqMan và giải phóng tín hiệu huỳnh quang lũy tích.

+-----------------------------------------------------------------------------------+
|               QUY TRÌNH THỰC HIỆN XÉT NGHIỆM TRÊN HỆ THỐNG REAL-TIME PCR          |
+-----------------------------------------------------------------------------------+
|  [Bước 1] Chuẩn bị mẫu và ly trích DNA/RNA (Xử lý mẫu, ly tâm, đun nóng)        |
|                                       ↓                                           |
|  [Bước 2] Thiết lập phản ứng PCR trong máy luân nhiệt tích hợp quang phổ           |
|                                       ↓                                           |
|  [Bước 3] Cài đặt chương trình chu kỳ nhiệt và thu nhận tín hiệu huỳnh quang      |
|                                       ↓                                           |
|  [Bước 4] Xử lý số liệu, xuất đường chuẩn và phân tích báo cáo (iCycler iQ)       |
+-----------------------------------------------------------------------------------+

Phương pháp đánh giá năng lực người học dựa trên:

1. Khả năng giải thích sai lệch giữa mô hình tăng trưởng lý thuyết ($x \cdot 2^n$) và đường cong thực nghiệm ở pha bình nguyên.
2. Khả năng tính toán nồng độ bản sao DNA ban đầu dựa trên phương trình hồi quy của đường chuẩn pha loãng nồng độ từ $10^7$ đến $10^1$ copies.
3. Khả năng biện giải kết quả xét nghiệm định tính dựa trên phân tích điểm cuối (End-point analysis).

---

Điểm nổi bật và cập nhật

Giáo trình đưa vào dữ liệu thống kê từ cuộc khảo sát thực tế năm 2003 (nguồn khảo sát chuyên ngành qua mạng với 400 chuyên gia và kỹ thuật viên tham gia), cung cấp cái nhìn định lượng về mức độ phổ biến của các công nghệ huỳnh quang:

Hạng mục công nghệ	Tỷ lệ sử dụng thực tế (%)
Phân loại theo tác nhân phát tín hiệu:
- Chỉ sử dụng Fluorescent probes hoặc primers	36%
- Sử dụng kết hợp cả SYBR Green và Probes	33%
- Chỉ sử dụng SYBR Green	31%
Phân loại chi tiết các dạng Probe:
- TaqMan probes	78%
- Molecular Beacons	19%
- FRET probes	15%
- LUX fluorogenic primers	9%
- MGB Eclipse probes	9%
- Scorpion probes	3%
- Các hệ thống probe khác	2%

(Lưu ý: Tỷ lệ chi tiết các loại probe có tổng lớn hơn 100% do người tham gia khảo sát có thể sử dụng đồng thời nhiều kỹ thuật khác nhau).

Tài liệu làm rõ bước chuyển đổi công nghệ từ phương pháp phát hiện sau khuếch đại truyền thống (End-point detection qua điện di gel agarose tốn thời gian, dễ nhiễm chéo) sang phương pháp giám sát động học thời gian thực khép kín trong cùng một ống nghiệm. Các ứng dụng thực tiễn được phân định thành 4 nhóm chuyên đề:

• Nghiên cứu biểu hiện gene (Gene expression analysis).
• Định lượng tải lượng mầm bệnh (Mức độ nhiễm virus, vi khuẩn).
• Phát hiện sinh vật biến đổi gen (GMO detection).
• Phân biệt biến thể di truyền (Allelic discrimination / Single Nucleotide Polymorphism - SNP).

---

Đối tượng sử dụng giáo trình

Giáo trình được biên soạn phục vụ các nhóm đối tượng cụ thể trong hệ thống đào tạo và nghiên cứu:

• Sinh viên đại học: Sinh viên năm thứ 3 và năm thứ 4 chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Sinh học, Hóa sinh, Xét nghiệm Y học, Thú y và Nông nghiệp Công nghệ cao.
• Học viên sau đại học: Học viên cao học và nghiên cứu sinh thực hiện các đề tài nghiên cứu liên quan đến sinh học phân tử, chẩn đoán bệnh truyền nhiễm và di truyền phân tử.
• Yêu cầu tiên quyết: Người học cần hoàn thành các học phần Sinh học đại cương, Di truyền học đại cương, Hóa sinh học và Kỹ thuật phòng thí nghiệm cơ bản.
• Giảng viên và cán bộ nghiên cứu: Sử dụng làm đề cương bài giảng lý thuyết chuyên đề hoặc làm tài liệu hướng dẫn chuẩn hóa quy trình thao tác (SOP) tại các phòng thí nghiệm xét nghiệm sinh học phân tử.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Giáo trình này phù hợp với ai?

Giáo trình phù hợp với sinh viên năm 3, năm 4, học viên sau đại học khối ngành Khoa học Sự sống, Y sinh, Công nghệ Sinh học cũng như các kiểm nghiệm viên, kỹ thuật viên tại các phòng xét nghiệm phân tử.

2. Cần kiến thức nền nào để học?

Người học cần nắm vững kiến thức về cấu trúc DNA/RNA, cơ chế nhân đôi acid nucleic, hoạt tính của enzym phiên mã/sao chép và các thao tác vô trùng cơ bản trong phòng thí nghiệm hóa sinh.

3. Điểm khác biệt với giáo trình khác?

Giáo trình đi sâu vào việc giải phẫu cơ chế vật lý - hóa học của các loại probe huỳnh quang (TaqMan, Molecular Beacons, FRET, Amplifluor), phân tích chi tiết sự khác biệt động học giữa pha logarit và pha bình nguyên, đồng thời cung cấp số liệu khảo sát thực tế về tần suất ứng dụng của từng kỹ thuật trong nghiên cứu.

4. Làm sao để tự học hiệu quả?

Người học nên kết hợp đọc tài liệu lý thuyết với việc theo dõi các sơ đồ cơ chế quang học, phân tích dữ liệu thực tế từ hệ thống máy luân nhiệt (như phần mềm iCycler iQ) và tập trung giải bài tập thiết lập đường chuẩn $C_t$ từ dãy pha loãng plasmid $10^7 - 10^1$ bản sao.

5. Có tài liệu bổ trợ nào kèm theo?

Tài liệu đi kèm các video mô phỏng động học phản ứng phân tử (SYBR.swf, Beacon.swf, Fret.swf, Taqman.swf), bảng dữ liệu thống kê khảo sát công nghệ phân tử và các biểu đồ mẫu phân tích đường cong phân giải nhiệt độ (Melt Curve).

---

Kết luận

Giáo trình cung cấp một hệ thống lý thuyết và phương pháp luận hoàn chỉnh về công nghệ khuếch đại acid nucleic, chuyển tiếp từ kỹ thuật PCR truyền thống của Kary Mullis sang công nghệ Real-Time PCR hiện đại. Bằng việc phân tích cấu trúc thiết bị, động học chu kỳ ngưỡng ($C_t$) và cơ chế quang học của các probe đặc hiệu, tài liệu xác lập nền tảng kỹ thuật phục vụ cho công tác định lượng phân tử, nghiên cứu biểu hiện gene, kiểm soát mầm bệnh và nhận diện sinh vật biến đổi gen.

Trích đoạn nội dung tài liệu

PCR VAØ REAL-TIME PCR NOÄI DUNG Giôùi thieäu kyõ thuaät PCR vaø Real-Time PCR Thieát bò PCR vaø Real-Time PCR Caùc öùng duïng cuûa Real-Time PCR Nghieân cöùu bieåu hieän gene Nghieân cöùu möùc ñoä nhieãm virus, vi khuaån Phaùt hieän GMO ( sinh vaät bieán ñoåi gene) Phaân bieät allelic/SNP PCR LAØ GÌ ? PCR (Polymerase Chain Reaction) laø phaûn öùng nhaân baûn trình töï DNA quan taâm trong test tube. Mullis ñaõ phaùt minh ra thöû nghieäm PCR vaøo naêm 1985 Vaø chæ 8 naêm sau, K. Mullis ñaõ ñöôïc giaûi Nobel hoaù hoïc nhôø phaùt minh PCR DNA VAØ CÔ CHEÁ TÖÏ NHAÂN ÑOÂI TRONG TEÁ BAØO PRIMER DNA POLYMERASE VAÄY, CAÀN COÙ NHÖÕNG GÌ TRONG TEST TUBE? Taq polymerase dNTP Primer ( moài ) DNA maãu Buffer PHAÛN ÖÙNG PCR DIEÃN RA NHÖ THEÁ NAØO ? Nguyeân taéc PCR ADN ñích 4 1 1 Bieán tính (94o C) 2 2 Baét caëp (55-65o C) 3 3 Keùo daøi (72o C) n QUI TRÌNH THÖÏC HIEÄN XEÙT NGHIEÄM PCR Chuaån bò maãu, ly Ly taâm vaø ñun noùng trích DNA/RNA Thöïc hieän phaûn öùng Choïn chöông trình chu kyø nhieät PCR trong maùy luaân nhieät Ñieän di, quan saùt vaø chuïp aûnh Phaùt hieän saûn phaåm khueách ñaïi PCR kinh điển phát hiện sản phẩm khuếch đại qua điện di 30X-40X 94oC/15s-1min 55-65oC/15s-1min 72oC/30s-3min PCR-ELISA phát hiện sản phẩm khuếch đại bằng ELISA 30X-40X 94oC/15s-1min 55-65oC/15s-1min 72oC/30s-3min ÖU ÑIEÅM CUÛA KYÕ THUAÄT PCR Ñaëc hieäu Nhạy Nhanh REAL TIME PCR LAØ GÌ ? Real Time PCR laø phaûn öùng PCR maø quaù trình nhaân baûn DNA ñang dieãn ra theo töøng chu kyø nhieät ñöôïc theo doõi tröïc tieáp. REAL TIME PCR LAØ GÌ ? Thöïc chaát, heä thoáng Real Time PCR goàm maùy luaân nhieät (PCR) ñöôïc noái vôùi maùy quang phoå huyønh quang vaø maùy vi tính.

Quang phoå huyønh quang Maùy vi tính Maùy luaân nhieät REAL TIME PCR LAØ GÌ ? Real Time PCR goàm 2 quaù trình dieãn ra ñoàng thôøi: nhaân baûn DNA baèng phaûn öùng PCR vaø ño ñoä phaùt huyønh quang tyû leä thuaän vôùi soá löôïng ñoaïn DNA taïo thaønh. BAÈNG CAÙCH NAØO ÑEÅ COÙ TÍN HIEÄU REAL TIME PHAÛN ÖÙNG PCR ÑANG DIEÃN RA ? Phaåm nhuoäm khi cheøn vaøo sôïi ñoâi DNA seõ phaùt huyønh quang maïnh hôn khi ôû traïng thaùi töï do:  Ethidium bromide – saùng gaáp 25 laàn  SYBR green – saùng gaáp 200 laàn Probe ñaëc hieäu coù gaén chaát phaùt huyønh quang chæ phaùt saùng khi coù baét caëp vôùi trình töï ñích: Beacon, Taqman…. PHAÅM NHUOÄM CHEØN SÔÏI ÑOÂI DNA 3’ 5’ 5’ 3’ Master Mix d.NTPs & Maãu Primers Taq DNA Polymerase Phaåm nhuoäm Tube Phaûn ÖÙng BD Bieán Tính l Taq BD Baét Caëp 3’ 5’ Noái Daøi 5’ 3’ 3’ BD BD Taq 5’ 5’ BD BD BD 3’ Taq l l l 3’ Taq 5’ BD BD BD BD BD 3’ Taq l l .\bioraddownload\Video\SYBR.swf Laëp laïi SYBR GREEN 1 kích thích Phat quang 490nm 530nm kích thích 490nm Phat quang 530nm Soá löôïng DNA gia taêng Khoâng coù DNA SYBR GREEN 1, tuy nhieân … DNA caàn tìm DNA khoâng caàn tìm Caùc phaåm nhuoäm cheøn sôïi ñoâi DNA khoâng cho keát quaû ñaëc hieäu GÆAI PHAÙP PROBE PHAÙT HUYØNH QUANG Ñaëc hieäu Phaùt saùng khi gaén boå sung vôùi DNA ñích Khoâng phaùt saùng khi töï do. PROBE PHAÙT HUØYNH QUANG 3 daïng chính Probe coù theå taùch rôøi: Molecular Beacons, FRET, Probe phaân caét: TaqMan Probe gaén tröïc tieáp vôùi primer: Ampliflour, Scorpion MOLECULAR BEACONS • Voøng mang trình töï boå sung vôùi DNA ñích.

• Nhaùnh ñoâi mang fluorophore (F- chaát phaùt huyønh quang) ôû moät ñaàu, vaø quencher (Q- chaát haáp thu) ôû ñaàu kia. • Khi probe töï do toàn taïi döôùi caáu truùc naøy thì tín hieäu huyønh quang töø F seõ bò Q haáp thu = KHOÂNG PHAÙT HUYØNH QUANG. Fluorophore & Quencher FRET: Fluorescence (Förster) Resonance Energy Transfer F Q Dark Quenchers : X F Q MOLECULAR BEACONS .\bioraddownload\Video\Beacon.swf FRET Probes l D R Baét Caëp 5’ 5’ 1-5 bases 3’ Phaùt hieän D R Taq Noái daøi 5’ 5’ 3’ Taq 5’ 5’ 3’ .\bioraddownload\Video\Fret.swf PROBE DÖÏA TREÂN PHAÂN CAÉT - TAQMAN  Tín hieäu huyønh quang ñöôïc phaùt ra khi probe gaén vaøo baûn maãu DNA ñoaïn giöõa caëp primer bò phaân caét trong giai ñoaïn noái daøi maïch do DNA polymerase l R Q R Ño huyønh quang trong giai ñoaïn noái daøi  Luõy tích ñoä maïnh tín hieäu huyønh quang  Thí nghieäm phoå bieán nhaát trong caùc taøi lieäu veà Real-Time PCR  Tuy nhieân, caàn phaûi ñaûm baûo: - Chaát phaùt huyønh quang ñöôïc choïn laøm Reporter R phaûi coù phoå phaùt saùng taùch bieät vôùi Quencher. Q - Reporter phaùt saùng trong khoaûng kích thích Quencher - Quencher phaûi naèm gaàn Reporter ñeå haáp thu hieäu quaû.

3’ 5’ 5’ 3’ dNTPs Primers Master Mix DNA Polymerase beàn nhieät & Maãu R Q Probe Tube Phaûn ÖÙng Taq Bieán Tính l Q R Baét Caëp Q R 5’ 3’ Noái Daøi R 1. Thay maïch Q Taq 5’ 3’ R Q 2. Phaân caét Taq 5’ 5’ 3’ R Taq 3. Hoaøn taát toång hôïp 5’ 5’ 3’ R Taq 4.\bioraddownload\Video\Taqman.swf PROBE GAÉN VÔÙI PRIMER: AMPLIFLUOR Baét caëp/Noái daøi 1 3’ R Q 5’ 3’ Q R Noái daøi 2 3’ 5’ l R Q 3’ 5’ 5’ 3’ Phaùt hieän Fluorescent probes hoac primers SYBR Green 36% 31% Both SYBR Green & fluorescent probes hoac primers 33% Source: www.net 2003 survey, 400 participants Fluorescent Probes 78% TaqMan probes 19% Molecular Beacons 15% FRET probes LUX fluorogenic 9% primers 9% MGB Eclipse probes 3% khac 2% Scorpion probes 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% Source: www.net 2003 survey, 400 participants QUI TRÌNH THÖÏC HIEÄN REAL TIME PCR Chuaån bò maãu, ly trích Ly taâm vaø ñun noùng DNA/RNA Thöïc hieän phaûn öùng Choïn chöông trình real-time PCR PCR vaø phaân tích, baùo caùo keát quaû treân heä thoáng real time PCR iCycler iQ GIAÛI PHAÙP REAL TIME PCR 1 Theo doõi phaûn öùng PCR ñang xaûy ra Ten-fold dilution series of plasmid DNA: 107 - 101 copies GIAÛI PHAÙP REAL TIME PCR 2 Ñònh löôïng noàng ñoä DNA maãu tröôùc phaûn öùng baèng caùch so saùnh Ct maãu vôùi Ct cuûa caùc chuaån ñaõ bieát tröôùc noàng ñoä BAÉT ÑAÀU BAÈNG MOÄT TÍNH TOAÙN LYÙ THUYEÁT .x copies taïo x copies ôû chu kyø ñaàu tieân .2x copies taïo 2x copies ôû chu kyø thöù hai .4x copies taïo 4x copies ôû chu kyø thöù ba taïo 16,777,216x copies ôû chu kyø thöù 25 taïo 536,870,912x copies ôû chu kyø thöù 30 THÖÏC TEÁ KHOÂNG ÑUÙNG NHÖ VAÄY ! Hieäu quaû phaûn öùng khoâng bao giôø 100% Enzyme meät moûi Primer giaûm khaû naêng gaén leân trình töï ñích 96 maãu laäp laïi cuûa cuøng moät noàng ñoä DNA xaùc ñònh cho tín hieäu huyønh quang cuoái cuøng raát khaùc nhau So saùnh keát quaû ñieän di treân gel saûn phaåm sau PCR cuûa cuøng moät noàng ñoä DNA ñích ban ñaàu MOÄT SO SAÙNH KHAÙC SOÁ CHU KYØ SOÁ SOÁLÖÔÏ LÖÔÏNN GGDNA DNABAN BANÑAÀ ÑAÀUU ÑAÂU LAØ THÔØI ÑIEÅM TOÁT NHAÁT ÑEÅ COÙ KEÁT QUAÛ ÑÒNH LÖÔÏNG ? ÔÛ phase log, 96 gieáng cuûa cuøng moät noàng ñoä DNA xaùc ñònh cho tín hieäu hoaøn toaøn gioáng nhau, chæ khaùc nhau ñaùng keå ôû phase bình nguyeân.

Vaán ñeà laø chuùng ta khoâng bieát khi naøo thì phase log keát thuùc ÑAÂU LAØ THÔØI ÑIEÅM TOÁT NHAÁT ÑEÅ COÙ KEÁT QUAÛ ÑÒNH LÖÔÏNG Chu Kyø Ngöôõng (Threshold Cycle), Ct ! [DNA] Base line Ct Ct Ct Cycle #  Chu Kyø Ngöôõng Threshold Cycle (CT) Nôi maø tín hieäu huyønh quang cao hôn tín hieäu neàn moät caùch thaáy roõ  Chu kyø ngöôõng töông quan chaët cheõ vôùi soá löôïng DNA ñích ban ñaàu Relative Fluorescence Units (RFU) Ít DNA ban ñaàu Nhieàu DNA ban ñaàu CT Soá Chu Kyø ÑAÂU LAØ THÔØI ÑIEÅM TOÁT NHAÁT ÑEÅ COÙ KEÁT QUAÛ ÑÒNH LÖÔÏNG Soá löôïng baûn DNA ñích ban ñaàu caøng nhieàu thì thôøi ñieåm (Ct) phaùt hieän tín hieäu saûn phaåm khueách ñaïi caøng sôùm. ÑÒNH LÖÔÏNG NOÀNG ÑOÄ DNA MAÃU SOÁ LÖÔÏNG DNA BAN ÑAÀU LAØ BAO NHIEÂU ? SOÁ LÖÔÏNG DNA BAN ÑAÀU CUÛA MAÃU CAÀN XAÙC ÑÒNH GIAÛI PHAÙP REAL TIME PCR 3 Duøng Melt Curve ñeå xaùc ñònh ñaëc tính cuûa saûn phaåm khueách ñaïi TAÊNG NHIEÄT ÑOÄ GIAÛI PHAÙP REAL TIME PCR 4 Phaân tích end-point, xaùc ñònh döông tính hoaëc aâm tính.