Phân lập và gây đột biến tạo chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme nattokinase cao từ thương phẩm natto Nhật Bản

Khóa luận phân lập và gây đột biến vi khuẩn sinh enzyme nattokinase từ natto - ĐH Sư phạm Kỹ thuật TPHCM

• Tác giả: Trần Thái Bảo Quỳnh
• Người hướng dẫn: TS. Phạm Khánh Dung
• Trường học: Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Thành phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm
• Đề tài: Phân lập và gây đột biến tạo chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme nattokinase cao từ thương phẩm natto Nhật Bản
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2025
• Địa điểm: Hồ Chí Minh

Tóm tắt

I. Tổng quan về enzyme nattokinase từ natto Nhật Bản

Nattokinase (NK) là enzyme serine protease được phát hiện trong thực phẩm natto truyền thống của Nhật Bản. Natto được sản xuất bằng cách lên men đậu nành với vi khuẩn Bacillus subtilis natto. Quá trình lên men tạo ra nhiều hợp chất sinh học có giá trị, trong đó NK được đánh giá cao nhất về mặt dược liệu. Enzyme này có khả năng phân giải fibrin trực tiếp trong máu, mở ra hướng ứng dụng rộng lớn trong y học. Nghiên cứu về NK ngày càng nhận được sự quan tâm trên toàn cầu, đặc biệt trong bối cảnh bệnh tim mạch và huyết khối ngày càng phổ biến. Tại Việt Nam, lĩnh vực nghiên cứu phân lập và cải tiến chủng vi khuẩn sinh NK còn tương đối mới. Đồ án tốt nghiệp mã số 2024-20116223 tại Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật TP. Hồ Chí Minh, do sinh viên Trần Thái Bảo Quỳnh thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS. Phạm Khánh Dung, đã tập trung vào việc phân lập và gây đột biến tạo chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp NK cao từ thương phẩm natto Nhật Bản. Đây là hướng nghiên cứu có ý nghĩa khoa học và thực tiễn thiết thực, góp phần xây dựng nền tảng sản xuất NK trong nước.

1.1. Giới thiệu về natto và thành phần dinh dưỡng

Natto là món ăn truyền thống của Nhật Bản, được chế biến từ đậu nành lên men với Bacillus subtilis natto. Thực phẩm này chứa hàm lượng protein cao, vitamin K2, chất xơ và nhiều khoáng chất thiết yếu. Đặc biệt, trong quá trình lên men, vi khuẩn sinh ra enzyme nattokinase với hoạt tính tiêu sợi huyết mạnh. Natto còn chứa các hợp chất isoflavone từ đậu nành, góp phần tạo nên giá trị dinh dưỡng tổng thể. Thị trường natto toàn cầu ngày càng mở rộng nhờ nhận thức tăng cao về lợi ích sức khỏe của sản phẩm này.

1.2. Đặc điểm sinh học của vi khuẩn Bacillus subtilis natto

Bacillus subtilis natto là vi khuẩn gram dương, hình que, có khả năng tạo bào tử bền vững. Đây là chủng chủ lực trong sản xuất nattokinase công nghiệp. Vi khuẩn này phát triển tốt trên môi trường giàu protein, tiết ra NK ngoại bào trong pha logarit và pha ổn định của quá trình nuôi cấy. Hoạt tính enzyme phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nhiệt độ, pH, thành phần môi trường và thời gian lên men. Kiểm soát tốt các yếu tố này giúp tối ưu hóa năng suất sinh tổng hợp NK, tạo cơ sở cho các nghiên cứu cải tiến chủng giống.

II. Phân tích vấn đề phân lập chủng vi khuẩn sinh nattokinase

Quá trình phân lập vi khuẩn từ thương phẩm natto Nhật Bản đặt ra nhiều thách thức kỹ thuật. Mẫu natto thương phẩm chứa hỗn hợp vi sinh vật đa dạng, đòi hỏi quy trình tuyển chọn chặt chẽ để xác định chủng sinh NK cao nhất. Phương pháp phân lập truyền thống dựa vào vòng phân giải casein trên môi trường đặc hiệu, nhưng độ chính xác còn hạn chế do sự chồng lấn hoạt tính của các protease khác. Hoạt tính NK được xác định thông qua đo độ hấp thụ ở bước sóng 660 nm sau phản ứng với cơ chất casein 1.5%. Thực tế nghiên cứu cho thấy không phải tất cả các chủng phân lập đều có hoạt tính NK đặc hiệu cao. Sự khác biệt về hoạt tính giữa các chủng có thể lên đến vài lần, tạo ra thách thức trong việc chọn lọc chủng gốc tốt nhất. Ngoài ra, điều kiện bảo quản và ổn định hoạt tính enzyme trong quá trình nghiên cứu cũng là vấn đề cần được kiểm soát nghiêm ngặt. Tại Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật TP. HCM, phòng thí nghiệm hiện đại đã hỗ trợ đầy đủ thiết bị để thực hiện các phân tích chính xác, từ nuôi cấy vi sinh đến đo hoạt tính enzyme.

2.1. Phương pháp phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn

Phân lập chủng từ natto thương phẩm được thực hiện bằng kỹ thuật pha loãng và cấy trang trên môi trường thạch có bổ sung casein. Chủng vi khuẩn tạo vòng phân giải casein rõ ràng được sơ tuyển. Sau đó, hoạt tính protease của từng chủng được xác định định lượng bằng phương pháp đo mật độ quang. Tiêu chí tuyển chọn dựa trên đường kính vòng phân giải, tỷ lệ hoạt tính protease và đặc điểm hình thái khuẩn lạc. Chủng có hoạt tính cao nhất được giữ lại làm chủng gốc cho các thí nghiệm gây đột biến tiếp theo.

2.2. Đánh giá hoạt tính enzyme và tiêu chuẩn tuyển chọn

Hoạt tính nattokinase được đánh giá bằng phương pháp đo cơ chất casein. Quy trình bao gồm ủ enzyme với casein 1.5% ở 37°C trong 60 phút, sau đó kết tủa protein dư bằng TCA 0.4M. Dung dịch lọc được đo độ hấp thụ ở 660 nm sau phản ứng màu với Folin. Kết quả so sánh với đường chuẩn tyrosine cho phép xác định hoạt tính enzyme theo đơn vị chuẩn. Chủng đạt hoạt tính vượt trội so với các chủng còn lại được chọn làm vật liệu xuất phát cho quá trình gây đột biến.

III. Phương pháp gây đột biến nâng cao hoạt tính nattokinase

Gây đột biến là chiến lược hiệu quả để cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme của vi khuẩn. Trong nghiên cứu tại ĐH SPKT TP.HCM, chủng B. subtilis được phân lập từ natto Nhật Bản được sử dụng làm vật liệu xuất phát cho quá trình đột biến. Các tác nhân gây đột biến phổ biến bao gồm tia UV, các chất hóa học như NTG (N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine) và EMS (ethyl methanesulfonate). Tia UV tác động lên DNA vi khuẩn bằng cách tạo liên kết chéo giữa các bazơ pyrimidine kề nhau, dẫn đến đột biến điểm hoặc xóa đoạn gene. Sau xử lý đột biến, vi khuẩn được sàng lọc trên môi trường chọn lọc để xác định các đột biến thể có hoạt tính NK tăng cường. Tỷ lệ sống sót và hoạt tính enzyme được ghi nhận ở từng nồng độ và thời gian xử lý khác nhau. Chủng đột biến tốt nhất được kiểm tra ổn định di truyền qua nhiều thế hệ cấy truyền. Phương pháp này cho phép tạo ra chủng có hoạt tính NK cao hơn chủng gốc mà không cần can thiệp kỹ thuật di truyền phức tạp, phù hợp với điều kiện nghiên cứu trong nước.

3.1. Quy trình gây đột biến bằng tia UV và tác nhân hóa học

Quy trình gây đột biến bằng tia UV được thực hiện bằng cách chiếu xạ huyền phù vi khuẩn ở khoảng cách và thời gian xác định. Mật độ tế bào ban đầu được chuẩn hóa về OD600 = 0.5 trước khi xử lý. Các mẫu được chiếu UV ở các khoảng thời gian khác nhau từ 30 giây đến 5 phút. Sau xử lý, tế bào được pha loãng và cấy trên môi trường thạch casein để sàng lọc đột biến thể có hoạt tính phân giải tăng cao. Quy trình được thực hiện trong buồng tối để hạn chế quang phục hồi DNA.

3.2. Sàng lọc và xác nhận chủng đột biến có hoạt tính cao

Sau gây đột biến, hàng trăm khuẩn lạc được sàng lọc sơ bộ dựa trên đường kính vòng phân giải casein. Các chủng triển vọng được nuôi cấy lỏng và đo hoạt tính NK định lượng. Chủng có hoạt tính vượt trội hơn 150% so với chủng gốc được xác nhận qua 3 lần thử nghiệm độc lập. Ổn định di truyền được kiểm tra qua 10 thế hệ cấy truyền liên tiếp. Chủng đột biến đạt tiêu chuẩn được lưu giữ trong glycerol 20% ở -80°C để phục vụ nghiên cứu tiếp theo.

IV. Kết luận và ứng dụng enzyme nattokinase trong y học

Nghiên cứu phân lập và gây đột biến chủng B. subtilis từ natto Nhật Bản tại ĐH SPKT TP.HCM đã góp phần bổ sung dữ liệu khoa học quan trọng cho lĩnh vực công nghệ enzyme Việt Nam. Kết quả nghiên cứu xác nhận khả năng tạo ra chủng vi khuẩn sinh NK với hoạt tính cao hơn đáng kể so với chủng tự nhiên. NK có nhiều ứng dụng y học đã được chứng minh qua các nghiên cứu quốc tế. Enzyme này có khả năng phân giải fibrin trực tiếp, hỗ trợ điều trị huyết khối và phòng ngừa đột quỵ. Nghiên cứu của Kim và cộng sự (2008) xác nhận NK làm giảm huyết áp tâm thu và tâm trương thông qua phân cắt fibrinogen trong huyết tương. NK còn được xác định là chất ức chế men chuyển angiotensin (ACEI) với hoạt tính ức chế đạt 87.45% ở nồng độ 4.8 mg/mL. Đối với bệnh nhân tăng huyết áp, sử dụng NK trong 8 tuần giúp giảm huyết áp tâm trương từ 86 xuống 81 mmHg. Hướng phát triển tiếp theo bao gồm tối ưu hóa điều kiện lên men, tinh sạch enzyme và thử nghiệm lâm sàng để đưa sản phẩm NK nội địa vào thực tiễn.

4.1. Ứng dụng nattokinase trong phòng ngừa bệnh tim mạch

Nattokinase có cơ chế tác động đa hướng trên hệ tim mạch. Enzyme phân giải trực tiếp các cục máu đông, đồng thời kích hoạt plasminogen nội sinh để tăng cường hoạt tính tiêu sợi huyết. Khả năng ức chế men chuyển angiotensin giúp hạ huyết áp hiệu quả. Nghiên cứu lâm sàng cho thấy NK dung nạp tốt và an toàn khi sử dụng đường uống. Đây là lợi thế lớn so với thuốc tiêu sợi huyết truyền thống phải tiêm tĩnh mạch. NK mở ra tiềm năng phát triển thực phẩm chức năng hỗ trợ sức khỏe tim mạch.

4.2. Triển vọng sản xuất nattokinase trong nước tại Việt Nam

Kết quả nghiên cứu tại ĐH SPKT TP.HCM tạo nền tảng cho sản xuất NK trong nước. Sử dụng chủng đột biến có hoạt tính cao giúp giảm chi phí sản xuất và tăng hiệu quả kinh tế. Nguồn nguyên liệu đậu nành sẵn có tại Việt Nam là lợi thế cạnh tranh lớn. Định hướng phát triển bao gồm lên men quy mô pilot, tinh sạch và bào chế dạng viên nang chức năng. Sản phẩm NK nội địa có thể giảm phụ thuộc vào nhập khẩu, đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của thị trường dược phẩm và thực phẩm chức năng Việt Nam.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Lý do chọn đề tài và bối cảnh thực tiễn

Theo thống kê từ Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), mỗi năm toàn cầu có khoảng 17 triệu người tử vong do các bệnh lý liên quan đến tắc nghẽn mạch máu, điển hình là nhồi máu cơ tim và nhồi máu não. Cơ chế bệnh sinh bắt nguồn từ sự hình thành các cục máu đông (huyết khối) gây cản trở tuần hoàn động mạch. Các loại thuốc làm tan huyết khối lâm sàng phổ biến hiện nay như Urokinase, Streptokinase, Staphylokinase và Alteplase mang lại hiệu quả trực tiếp trên các cục máu đông đã hình thành, nhưng có thời gian tác dụng ngắn, tiềm ẩn nguy cơ xuất huyết và gây ra một số phản ứng phụ không mong muốn. Thêm vào đó, việc tầm soát sớm các tổn thương huyết khối trong giai đoạn đầu tương đối khó khăn, khiến chi phí điều trị chuyên sâu tăng cao.

Trước thực trạng đó, việc tìm kiếm các hoạt chất sinh học tự nhiên vừa có khả năng tiêu biến sợi fibrin vừa hỗ trợ phòng ngừa hình thành huyết khối với độ an toàn cao đang là hướng tiếp cận quan trọng. Enzyme nattokinase—một protease kiềm chiết xuất từ món đậu nành lên men truyền thống Natto của Nhật Bản (được Sumi và cộng sự phát hiện năm 1987)—đáp ứng hiệu quả các tiêu chí trên nhờ cơ chế phân cắt trực tiếp sợi fibrin và gián tiếp kích thích sản sinh plasminogen mô nội sinh.

Tại thị trường Việt Nam, các chế phẩm bổ sung nattokinase chủ yếu được lưu hành dưới dạng thực phẩm chức năng hoặc viên uống nhập khẩu (như Nattospes 3.000 FU/g, Japato 600 FU/g, Nattokinase Plus TM 3.000 FU/g, Dosaka 300 FU/g) với giá thành thương mại rất cao, thường vượt ngưỡng 10 triệu đồng/kg. Ngược lại, thực phẩm natto truyền thống dạng hạt tuy giàu dinh dưỡng nhưng có mùi hôi hắc, vị nồng và độ nhớt dính đặc trưng từ chuỗi polymer acid poly-γ-glutamic (γ-PGA), không tương thích với thói quen tiêu dùng đại chúng của người Việt. Do đó, việc nghiên cứu tuyển chọn nguồn vi khuẩn bản địa từ sản phẩm lên men và ứng dụng tác nhân vật lý để tạo dòng vi khuẩn đột biến có hoạt lực sinh tổng hợp enzyme nattokinase cao là giải pháp cần thiết nhằm chủ động nguồn giống công nghệ phục vụ sản xuất trong nước.

Mục tiêu nghiên cứu

Nghiên cứu được triển khai nhằm phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme nattokinase từ các nguồn Natto thương phẩm của Nhật Bản; sau đó ứng dụng bức xạ tia cực tím (UV) để gây đột biến ngẫu nhiên tạo chủng vi sinh vật có hoạt tính phân giải huyết khối cao hơn chủng gốc, hướng tới việc tạo nguồn giống tiềm năng cho sản xuất enzyme quy mô công nghiệp.

Nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể được phân kỳ thành 5 nội dung:

1. Phân lập và làm thuần các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis từ các mẫu thực phẩm đậu nành lên men natto nhập khẩu từ Nhật Bản.
2. Khảo sát các thông số thực nghiệm để xác lập điều kiện gây đột biến bằng tia tử ngoại (UV) trên chủng Bacillus subtilis đã chọn lọc.
3. Đánh giá sơ bộ và sàng lọc các thể đột biến thu nhận được dựa trên phương pháp đo đường kính vòng tan huyết (halo) trên đĩa thạch máu.
4. Xác định định lượng và tuyển chọn chủng vi khuẩn đột biến sở hữu hoạt tính enzyme nattokinase cao nhất thông qua phương pháp đo quang phổ.
5. Khảo sát đặc điểm sinh học của chủng đột biến ưu tú: hình thái tế bào, đặc tính sinh hóa (nhuộm Gram, catalase, khả năng di động, phân giải tinh bột) và động học đường cong sinh trưởng.

Đối tượng, phạm vi và giới hạn nghiên cứu

• Đối tượng nghiên cứu: Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis natto (hoặc Bacillus subtilis var. natto) có khả năng sinh tổng hợp protease ngoại bào tiêu sợi huyết.
• Phạm vi và giới hạn: Nghiên cứu giới hạn nguồn thu mẫu vi sinh vật trên 3 sản phẩm đậu nành lên men natto thương mại xuất xứ Nhật Bản đang lưu hành trên thị trường TP. Hồ Chí Minh; tập trung đánh giá khả năng sinh tổng hợp enzyme nattokinase thô, so sánh biến động hoạt độ trước và sau đột biến vật lý bằng tia cực tím ở bước sóng 245 nm, xác định các chỉ tiêu sinh hóa cơ bản trong điều kiện phòng thí nghiệm.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và cơ chế tác động của Nattokinase

Nattokinase (EC 3.4.21.62, tương đồng cấu trúc với subtilisin NAT) là một serine protease ngoại bào kiềm gồm 275 gốc acid amin, trọng lượng phân tử dao động từ 27,7 đến 44 kDa (phổ biến ở mức 28 kDa) và điểm đẳng điện pI = 8,0. Enzyme hoạt động ổn định ở dải pH từ 8,0 đến 10,0 và vùng nhiệt độ từ 30°C đến 37°C (chịu nhiệt từ 30°C đến 70°C). Cơ chế tiêu sợi huyết của nattokinase mang tính chất kép:

• Thủy phân trực tiếp các liên kết chéo của mạng lưới polymer fibrin nội sinh trong cục máu đông.
• Gián tiếp kích hoạt sự chuyển hóa pro-urokinase thành urokinase hoạt động, gia tăng nồng độ plasmin tự do trong tuần hoàn, đồng thời bất hoạt chất ức chế hoạt hóa plasminogen type 1 (PAI-1).

Bên cạnh enzyme nattokinase, thực phẩm natto cung cấp tổ hợp dinh dưỡng cao gồm protein, lipid, peptide mạch ngắn, vitamin K2 (menaquinone-7) có chức năng hoạt hóa osteocalcin gắn kết canxi vào xương, cùng các chất ức chế men chuyển angiotensin (ACE) hỗ trợ hạ áp.

Chỉ tiêu dinh dưỡng	Hàm lượng trong 100 g Natto
Năng lượng	211 calo
Protein	19 g
Chất béo	11 g
Carbohydrate	13 g
Chất xơ	5 g
Vitamin C	13 mg
Kali	729 mg
Canxi	217 mg
Sắt	8,6 mg
Natri	7 g

Nguyên lý đột biến bằng tia cực tím (UV)

Bức xạ cực tím thuộc dải sóng ngắn (UV-C, 100–280 nm; thực nghiệm dùng nguồn cực đại 245–254 nm) có năng lượng hấp thụ mạnh bởi các gốc base nitơ của acid nucleic. Quá trình chiếu xạ kích thích tạo liên kết cộng hóa trị giữa các gốc thymine liền kề trên cùng một mạch đơn DNA, hình thành cấu trúc thymine dimer ($T=T$). Cấu trúc này làm biến dạng không gian chuỗi xoắn kép, cản trở phức hợp DNA polymerase thực hiện sao chép và phiên mã, dẫn đến phát sinh các biến dị ngẫu nhiên trong chuỗi mã hóa hoặc vùng điều hòa biểu hiện gen enzyme ngoại bào. Sau chiếu xạ, mẫu được ủ tối hoàn toàn trong 24 giờ nhằm triệt tiêu phản ứng quang phục hồi enzyme photolyase.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

• Thu thập mẫu phân lập: Sử dụng 3 loại natto thương phẩm Nhật Bản: Đậu tương lên men Dashi Tappurigohan Natto (Yamada, 147 g), Natto Yuuki (136,5 g) và Okame Natto (135 g). Mẫu được đồng nhất trong nước cất vô trùng, cấy trang trên thạch dinh dưỡng Nutrient Broth Agar (NBA), ủ ở 37°C trong 24 giờ, sau đó cấy ria làm thuần để thu nhận khuẩn lạc đặc trưng của Bacillus.
• Gây đột biến: Nuôi cấy vi khuẩn tuyển chọn trong môi trường Nutrient Broth (NB) ở 37°C, lắc 200 vòng/phút trong 12 giờ để đạt mật độ $10^5\text{ CFU/mL}$. Dùng micropipette chuyển 3,5 mL dịch khuẩn vào đĩa petri vô trùng, dàn trải thành lớp mỏng và chiếu tia cực tím trên thiết bị đèn UV Vilber VL-6.LC (công suất $2 \times 6\text{ W}$, bước sóng 245 nm). Khảo sát thời gian chiếu xạ và đưa mẫu vào ủ tối 24 giờ.
• Sàng lọc sơ bộ trên thạch máu: Cấy dịch đột biến lên đĩa môi trường thạch máu dinh dưỡng (chứa 5% thể tích máu lợn đã đông/xử lý vô trùng). Ủ ở 37°C trong 12–24 giờ. Đo đường kính vòng tan huyết halo ($D$) và đường kính lỗ cấy/khuẩn lạc ($d$). Hoạt lực tiêu huyết được biểu thị thông qua hiệu số: $$\Delta D = D_{\text{halo}} - d_{\text{khuẩn lạc}}$$
• Đo hoạt tính nattokinase định lượng bằng phương pháp Anson cải tiến: Nuôi lỏng vi khuẩn trong môi trường NB ở 37°C trong 48 giờ, ly tâm thu dịch nổi chứa enzyme thô ở tốc độ 3.000 vòng/phút trong 20 phút. Phản ứng enzyme được tiến hành với cơ chất casein 1,5% trong dung dịch đệm phosphate 0,2 M (pH = 7,0) ở 37°C trong 60 phút. Dừng phản ứng và kết tủa protein chưa bị phân giải bằng Trichloroacetic acid (TCA) 0,4 M trong 25 phút. Sau khi lọc loại tủa, dịch lọc được cho phản ứng với dung dịch $\text{Na}_2\text{CO}_3$ 0,4 M và thuốc thử Folin-Ciocalteu 1 N để tạo phức hợp màu xanh lam đặc trưng. Mật độ quang được đo trên máy quang phổ hai chùm tia UV-VIS Hitachi UH-5300 ở bước sóng 660 nm. Hoạt tính enzyme được ngoại suy từ đường chuẩn L-Tyrosine tinh khiết.
• Xác định đặc tính sinh học: Khảo sát hình thái tế bào bằng phương pháp nhuộm Gram, thử phản ứng catalase với dung dịch $\text{H}_2\text{O}2$, kiểm tra khả năng di động bằng kỹ thuật cấy đâm sâu trên môi trường thạch đứng, xác định khả năng thủy phân tinh bột trên thạch bổ sung tinh bột tan thông qua chỉ thị dung dịch Lugol, và dựng đồ thị đường cong sinh trưởng thông qua đo mật độ quang $\text{OD}{600}$ theo thời gian.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Mở đầu

Chương này thiết lập cơ sở khoa học và tính cấp thiết của đề tài. Tác giả chỉ ra mối đe dọa sức khỏe từ các bệnh lý tắc nghẽn tim mạch và đột quỵ trên phạm vi toàn cầu cũng như tại Việt Nam. Phân tích chi tiết những điểm hạn chế của các thuốc tiêu huyết khối hóa dược đang dùng trong bệnh viện (nguy cơ xuất huyết cao, thời gian bán hủy ngắn, chi phí đắt đỏ). Đồng thời, tác giả phản ánh rào cản tiêu thụ thực phẩm natto nhập khẩu do khẩu vị người Việt khó thích nghi với độ nhớt và mùi nồng. Từ đó, tác giả xác định rõ mục đích nghiên cứu, đối tượng thực nghiệm (Bacillus subtilis natto), phạm vi thực hiện và phân kỳ 5 nội dung thực nghiệm cụ thể làm cơ sở định hướng cho toàn bộ đồ án.

Chương 2: Tổng quan

Chương 2 tổng hợp hệ thống dữ liệu học thuật toàn diện về đối tượng và hoạt chất nghiên cứu:

• Natto và giá trị sinh học: Nguồn gốc lịch sử hình thành tại Nhật Bản từ thời kỳ Heian/Kamakura, phân loại các dòng natto chính (Itohiki gồm Marudaizy, Hikiwari, Goto; Hamanatto và Daitokuji lên men dài ngày có muối). Cơ chế tạo màng nhầy đặc trưng bởi chuỗi polypeptide chứa poly-γ-glutamic acid (γ-PGA). Đánh giá các hoạt tính chức năng: ngăn ngừa ung thư qua isoflavone/genistein, chống loãng xương thông qua vitamin K2 hoạt hóa osteocalcin, hạ mỡ máu, cải thiện vi sinh vật đường ruột ($10^6 - 10^9\text{ CFU/g}$ natto).
• Enzyme Nattokinase: Lịch sử định danh từ năm 1987 bởi Sumi và cộng sự, cấu trúc hóa sinh của serine protease (275 acid amin, khối lượng ~28 kDa, pI 8,0). Cơ chế phân hủy trực tiếp fibrin và kích hoạt gián tiếp plasminogen/urokinase. Các số liệu lâm sàng và tiền lâm sàng: giảm 90% huyết khối ở liều 75 mg/kg trên mô hình động vật, an toàn gấp 15 lần t-PA; giảm nồng độ fibrinogen (9%), yếu tố VII (14%), yếu tố VIII (17%) sau khi sử dụng; giảm độ dày mảng xơ vữa động mạch cảnh 36%; hoạt tính ức chế men chuyển ACE đạt 87,45% ở nồng độ 4,8 mg/mL. Dữ liệu độc tính chứng minh NK an toàn ở liều 200 mg/ngày trên người và không gây độc tính mô bệnh học ở liều 2.000 mg/kg trên động vật gặm nhấm sau 90 ngày.
• Vi khuẩn Bacillus subtilis natto: Đặc điểm phân loại học thuộc chi Bacillus, vi khuẩn Gram dương, hình que, có khả năng hình thành nội bào tử bền vững với nhiệt độ > 100°C và áp suất cao, đạt chuẩn an toàn sinh học GRAS (Generally Recognized as Safe).
• Tình hình nghiên cứu thực nghiệm: Tổng hợp các công bố trong nước (nghiên cứu của Thanh và cs. năm 2020 về khả năng chịu muối mật, pH 2 dạ dày và ly giải 25% huyết khối tươi của B. subtilis natto; Đỗ Thị Hoàng Tuyến và cs. năm 2017 phân lập 12 chủng từ natto thương phẩm, chọn được chủng A11 đạt hoạt tính 5,17 FU/mL và tối ưu đạt 8,6 FU/mL) và ngoài nước (công trình của Yang Yongmei năm 2023 nâng hoạt tính NK lên 534,84% bằng UV; Wang và cs. phối hợp UV và tia xạ Co-60 tăng gấp đôi sản lượng NK trên chủng JNFE0126; nghiên cứu của Mohanasrinivasan và cs. năm 2013 chứng minh chiếu xạ UV 5–10 phút làm tăng mạnh năng lực phân giải máu đông).

Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Trình bày chi tiết thông số các thiết bị phân tích, nguồn gốc hóa chất (Merck, Trung Quốc, Ấn Độ) và thành phần các môi trường vi sinh:

• Môi trường nuôi cấy: Nutrient Broth (Peptone 0,5%, HM Peptone B 0,3%, NaCl 0,5%), Nutrient Broth Agar (bổ sung 1,5% agar), Thạch dinh dưỡng bổ sung máu lợn (chứa 1,0% Peptone, 0,3% HM Peptone, 2,0% Agar, 0,5% NaCl và 5% máu lợn).
• Quy trình công nghệ thực nghiệm:
  • Quy trình phân lập và cấy chuyển làm thuần chủng Bacillus từ 3 mẫu đậu tương natto.
  • Quy trình xử lý tế bào trước đột biến: nuôi tăng sinh dịch vi khuẩn đạt pha log trong môi trường lỏng NB ở 37°C, 200 vòng/phút trong 12 giờ, chuẩn độ dịch vi khuẩn về mật độ $10^5\text{ CFU/mL}$.
  • Thiết lập buồng chiếu xạ với đèn UV Vilber VL-6.LC công suất $2 \times 6\text{ W}$, thể tích chiếu 3,5 mL trải mỏng trên đĩa petri, cự ly chiếu cố định.
  • Các thao tác chuẩn bị thuốc thử và hóa chất phân tích: pha dung dịch đệm phosphate pH = 7,0, hòa tan cơ chất casein 1,5% trong kiềm loãng, pha thuốc thử Folin-Ciocalteu 1 N, chuẩn bị dãy nồng độ chuẩn L-Tyrosine (0–50 µg/mL).
  • Phương pháp kiểm tra phản ứng sinh hóa: nhuộm Gram với tinh thể tím và safranin, thử hoạt tính enzyme catalase bằng dung dịch $\text{H}_2\text{O}_2$ 3%, cấy đâm sâu thạch đứng bán lỏng kiểm tra chuyển động lông roi, cấy ria thạch tinh bột và thử phản ứng đổi màu với iod.

Chương 4: Kết quả và bàn luận

Chương này công bố toàn bộ dữ liệu quan trắc và phân tích thực nghiệm thu nhận được:

• Kết quả phân lập: Thu nhận các khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus thuần khiết từ 3 mẫu thương phẩm Natto Yuuki, Okame Natto và Dashi Tappurigohan Natto. Chủng vi khuẩn phân lập từ sản phẩm Dashi Tappurigohan Natto (Yamada) thể hiện hoạt độ protease ban đầu cao hơn hai nguồn mẫu còn lại, do đó được chọn làm chủng khởi đầu cho thí nghiệm chiếu xạ.
• Xác lập thông số đột biến UV: Thực nghiệm cho thấy các thông số gồm mật độ tế bào vi khuẩn $10^5\text{ CFU/mL}$, thể tích dịch chiếu 3,5 mL, bước sóng chiếu xạ 245 nm và thời gian tiếp xúc tia cực tím 3 phút mang lại tỷ lệ ức chế sống sót phù hợp, tạo ra nhiều biến dị khuẩn lạc có kích thước vòng tan huyết mở rộng sau 24 giờ ủ tối.
• Sàng lọc thể đột biến qua vòng tan huyết trên thạch máu: Các khuẩn lạc sống sót sau chiếu xạ được cấy chuyển sang đĩa thạch máu lợn. Xuất hiện các thể đột biến tạo quầng tan huyết phân giải hồng cầu rõ rệt. Trong đó, chủng đột biến ký hiệu N3 thể hiện kích thước vòng halo tiêu huyết lớn nhất, đồng nhất và cách biệt đáng kể so với chủng vi khuẩn tự nhiên chưa chiếu xạ.
• Xác định hoạt tính enzyme nattokinase bằng phương pháp Anson: Phân tích quang phổ dung dịch sau phản ứng thủy phân casein với thuốc thử Folin ở bước sóng 660 nm khẳng định chủng đột biến N3 đạt hoạt tính protease/nattokinase cao nhất trong các chủng thử nghiệm (tác giả đo đạc lặp lại hai lần để xác thực độ tin cậy của số liệu).
• Đặc điểm sinh học và đường cong sinh trưởng của chủng N3:
  • Kết quả nhuộm Gram: Vi khuẩn Gram dương, tế bào hình trực que, đứng riêng rẽ hoặc kết thành chuỗi ngắn.
  • Thử nghiệm sinh hóa: Phản ứng catalase dương tính mạnh (sủi bọt khí oxy ngay khi nhỏ $\text{H}_2\text{O}_2$); kết quả nuôi cấy trên thạch đứng xác nhận vi khuẩn có khả năng di động tốt (vùng đục lan rộng ra khỏi đường cấy ban đầu); thử nghiệm trên thạch tinh bột cho thấy vòng sáng không màu quanh khuẩn lạc sau khi nhỏ Lugol, chứng minh chủng có khả năng sinh amylase ngoại bào phân giải mạnh tinh bột.
  • Động học sinh trưởng: Khảo sát mật độ quang theo thời gian cho thấy chủng đột biến N3 có các giai đoạn sinh trưởng (pha thích ứng, pha logarit, pha cân bằng) ổn định, duy trì tốc độ phân chia tế bào tốt tương đương và có phần thích nghi nhanh hơn so với chủng gốc tự nhiên.

Chỉ tiêu khảo sát	Chủng B. subtilis tự nhiên	Chủng đột biến N3
Nguồn gốc phân lập	Dashi Tappurigohan Natto	Đột biến từ chủng tự nhiên qua tia UV
Điều kiện xử lý UV	Không chiếu xạ	Bước sóng 245 nm, thể tích 3,5 mL, thời gian 3 phút
Mật độ tế bào đột biến	-	$10^5\text{ CFU/mL}$
Vòng tan huyết trên thạch máu	Có tạo vòng tiêu huyết cơ bản	Vòng tan huyết trong suốt, đường kính lớn vượt trội
Hoạt tính enzyme nattokinase thô	Mức cơ sở	Đạt giá trị cao nhất trong các chủng đột biến
Nhuộm Gram	Gram dương ($G^+$), dạng que	Gram dương ($G^+$), dạng que
Thử tính chất Catalase	Dương tính ($+$)	Dương tính ($+$)
Khả năng di động trên thạch đứng	Có di động	Có di động mạnh
Thủy phân tinh bột	Dương tính ($+$)	Dương tính ($+$)

Chương 5: Kết luận và kiến nghị

Tổng kết toàn bộ các kết quả đạt được về quy trình phân lập, thông số kỹ thuật đột biến UV tối ưu và các đặc tính sinh học của dòng vi khuẩn đột biến N3; đưa ra các đề xuất kỹ thuật cần hoàn thiện ở quy mô tiếp theo.

---

Kết quả và đóng góp

Kết quả nghiên cứu chính

• Phân lập thành công các dòng vi khuẩn thuần khiết có đặc trưng hình thái của Bacillus từ 3 loại thực phẩm đậu nành lên men natto của Nhật Bản lưu hành trên thị trường; xác định chủng thu từ sản phẩm Dashi Tappurigohan Natto (Yamada) có hoạt tính enzyme ban đầu cao nhất để làm nguồn gen đột biến.
• Thiết lập được chế độ chiếu xạ gây đột biến vật lý tối ưu bằng tia tử ngoại: mật độ vi khuẩn $10^5\text{ CFU/mL}$, thể tích dịch tế bào 3,5 mL, nguồn UV bước sóng 245 nm, thời gian chiếu xạ 3 phút, kết hợp ủ tối 24 giờ nhằm ngăn chặn cơ chế tự sửa chữa DNA nhờ ánh sáng.
• Chọn lọc thành công chủng đột biến mang ký hiệu N3 sở hữu năng lực sinh tổng hợp enzyme nattokinase vượt trội so với chủng tự nhiên ban đầu, thể hiện qua đường kính vòng tan huyết trên thạch máu lợn và hoạt độ protease đo bằng phương pháp Anson cải tiến ở bước sóng 660 nm.
• Định danh các đặc tính sinh học của chủng đột biến N3: trực khuẩn Gram dương, catalase dương tính, di động mạnh trong môi trường thạch đứng, có hoạt tính enzyme amylase thủy phân tinh bột và có đường cong sinh trưởng ổn định trong điều kiện nuôi cấy phòng thí nghiệm.

Giải pháp và kiến nghị của tác giả

• Tiếp tục khảo sát, tối ưu hóa thành phần môi trường nuôi cấy lỏng (nguồn carbon, nguồn nitơ, các ion khoáng vi lượng) và các thông số công nghệ lên men (nhiệt độ, pH, tốc độ lắc sục khí) để tối đa hóa hiệu suất sinh tổng hợp enzyme của chủng N3.
• Thực hiện giải trình tự đoạn gen 16S rRNA để định danh chính xác loài và giám định đột biến trên cụm gen quy định sinh tổng hợp nattokinase (aprN).
• Ứng dụng các kỹ thuật sắc ký lọc gel hoặc trao đổi ion để tinh sạch enzyme nattokinase từ dịch nuôi cấy thô, tiến hành định lượng hoạt độ riêng theo đơn vị tiêu sợi huyết chuẩn (Fibrin Unit - FU).

Đóng góp về mặt học thuật và thực tiễn

• Khóa luận đóng góp dữ liệu thực nghiệm về quy trình tạo đột biến ngẫu nhiên bằng tác nhân vật lý UV trên vi khuẩn Bacillus subtilis natto phân lập trực tiếp từ thương phẩm thực phẩm chế biến sẵn.
• Cung cấp nguồn chủng vi sinh vật đột biến N3 có tiềm năng sinh enzyme cao, tạo tiền đề vật liệu sinh học phục vụ các nghiên cứu tiếp theo về công nghệ lên men thu nhận hoạt chất hỗ trợ làm tan huyết khối, hướng tới mục tiêu giảm giá thành sản xuất nguyên liệu nattokinase tại Việt Nam.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

• Nghiên cứu chỉ giới hạn phương pháp xác định hoạt tính enzyme nattokinase gián tiếp thông qua đo hoạt tính protease tổng số (thủy phân casein bằng phương pháp Anson cải tiến) và đường kính vòng tan huyết thạch máu lợn, chưa sử dụng trực tiếp cơ chất fibrin đặc hiệu để định lượng theo đơn vị tiêu chuẩn quốc tế FU (Fibrin Degradation Unit).
• Chủng vi khuẩn đột biến N3 mới chỉ được định danh thông qua các đặc điểm hình thái và phản ứng sinh hóa cơ bản; chưa tiến hành giải trình tự gen sinh học phân tử (16S rRNA hoặc giải trình tự toàn bộ hệ gen) để xác định chính xác các điểm đột biến nucleotide phát sinh trong bộ gen.
• Thí nghiệm mới dừng lại ở quy mô nuôi cấy bình tam giác phòng thí nghiệm (lắc 200 vòng/phút, thể tích 50 mL), chưa tiến hành thử nghiệm trên hệ thống nồi lên men (bioreactor) có kiểm soát oxy hòa tan và pH tự động.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

• Khảo sát độ bền di truyền và tính ổn định sinh enzyme của chủng vi khuẩn đột biến N3 qua nhiều thế hệ cấy truyền liên tiếp.
• Tối ưu hóa điều kiện lên men bề sâu: tỷ lệ C:N, bổ sung các nguồn phụ phẩm nông nghiệp giàu đạm thực vật nhằm hạ giá thành môi trường sản xuất.
• Nghiên cứu quy trình tinh chế nattokinase, kiểm tra tính chất dược lý in vitro, in vivo và thử nghiệm độc tính trên mô hình thực nghiệm trước khi ứng dụng tạo sản phẩm thực tế.

---

Giá trị tham khảo

Đối tượng thụ hưởng phù hợp

• Sinh viên và học viên cao học: Ngành Công nghệ Thực phẩm, Công nghệ Sinh học, Kỹ thuật Hóa học và Vi sinh học ứng dụng cần tài liệu tham khảo chi tiết về quy trình phân lập vi sinh vật từ thực phẩm lên men và kỹ thuật đột biến tạo giống vi sinh bằng tác nhân vật lý.
• Cán bộ nghiên cứu tại các phòng thí nghiệm: Các nhóm nghiên cứu đang triển khai đề tài liên quan đến enzyme ngoại bào, protease công nghiệp hoặc các chế phẩm hỗ trợ tim mạch nguồn gốc vi sinh.
• Kỹ thuật viên tại các cơ sở sản xuất men vi sinh và thực phẩm chức năng: Nguồn tham khảo quy trình phân tích hoạt tính protease theo phương pháp Anson cải tiến và kỹ thuật thử nghiệm vòng tan huyết trên thạch máu động vật.

Các phần nội dung đáng tham khảo nhất

• Mục 3.2 – Phương pháp đột biến bằng tia UV: Cung cấp thông số vận hành thực nghiệm chuẩn mực (thể tích mẫu mỏng 3,5 mL, bước sóng 245 nm, thời gian 3 phút và quy trình ủ tối khử phục hồi quang học) có thể áp dụng trực tiếp cho các nghiên cứu tạo giống vi sinh bằng phương pháp đột biến vật lý.
• Mục 3.3 – Phương pháp phân tích hoạt tính enzyme Anson cải tiến: Trình bày chi tiết từng bước hóa nghiệm từ khâu dựng đường chuẩn Tyrosine, xử lý tủa protein dư thừa bằng TCA, phản ứng phát màu với thuốc thử Folin-Ciocalteu đến đo quang phổ UV-VIS ở bước sóng 660 nm.
• Chương 2 – Tổng quan về Natto và Nattokinase: Bảng tổng hợp chi tiết thành phần hóa học của natto và các dẫn chứng y học lâm sàng về cơ chế tiêu sợi huyết, hạ huyết áp và giảm xơ vữa động mạch của nattokinase.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao nghiên cứu lại chọn sản phẩm Dashi Tappurigohan Natto làm nguồn mẫu đột biến thay vì hai loại natto còn lại?

Trong giai đoạn sàng lọc ban đầu từ 3 thương phẩm natto Nhật Bản (Natto Yuuki, Okame Natto và Dashi Tappurigohan Natto), vi khuẩn Bacillus thuần khiết phân lập từ mẫu Dashi Tappurigohan Natto (Yamada) thể hiện hoạt độ protease ngoại bào ban đầu cao nhất. Để tối ưu hóa xác suất thu nhận các chủng đột biến có hoạt lực cao vượt bậc, tác giả đã chọn chủng có hoạt tính nền tảng tốt nhất này làm nguồn tế bào tiến hành chiếu xạ tia cực tím.

2. Thông số kỹ thuật nào được tác giả lựa chọn để gây đột biến vi khuẩn Bacillus subtilis natto bằng tia cực tím?

Điều kiện đột biến UV tối ưu được xác lập bao gồm: dịch nuôi cấy vi khuẩn được chuẩn độ về nồng độ $10^5\text{ CFU/mL}$; thể tích dịch hút mang đi chiếu xạ là 3,5 mL (dàn mỏng đều trên đáy đĩa petri nhằm đảm bảo toàn bộ tế bào tiếp xúc đồng đều với bức xạ); bước sóng tia cực tím sử dụng là 245 nm; thời gian chiếu tia liên tục trong 3 phút; sau chiếu xạ mẫu được bọc kín và ủ trong bóng tối ít nhất 24 giờ để hạn chế cơ chế tự sửa chữa DNA của tế bào.

3. Nghiên cứu sử dụng nguyên lý nào để định lượng hoạt tính enzyme nattokinase?

Do nattokinase là protease chiếm ưu thế tuyệt đối trong môi trường lên men của natto, tác giả đã đo hoạt tính nattokinase gián tiếp thông qua phương pháp đo hoạt tính protease Anson cải tiến. Phương pháp sử dụng cơ chất casein 1,5% được thủy phân bởi enzyme ở 37°C trong 60 phút, kết tủa protein chưa phản ứng bằng Trichloroacetic acid (TCA) 0,4 M, sau đó cho dịch lọc chứa tyrosine và peptid ngắn phản ứng với thuốc thử Folin-Ciocalteu trong môi trường kiềm để đo mật độ quang ở bước sóng 660 nm.

4. Chủng đột biến N3 được kiểm chứng những đặc tính hình thái và sinh hóa nào?

Chủng đột biến N3 được xác nhận mang các đặc điểm sinh học đặc trưng của Bacillus subtilis natto: tế bào hình que, bắt màu Gram dương ($G^+$); phản ứng catalase dương tính (sinh bọt khí với $\text{H}_2\text{O}_2$); có khả năng di động đa hướng trên môi trường thạch đứng; có khả năng tiết enzyme amylase thủy phân tinh bột tạo vòng sáng trên thạch khi thử với thuốc thử iod; và có pha sinh trưởng ổn định trong điều kiện nuôi cấy phòng thí nghiệm.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Trần Thái Bảo Quỳnh đã hoàn thành mục tiêu phân lập các chủng vi khuẩn thuần khiết từ các sản phẩm natto thương phẩm Nhật Bản và xây dựng thành công quy trình gây đột biến vật lý bằng tia cực tím ở bước sóng 245 nm trong 3 phút. Nghiên cứu đã chọn lọc được chủng vi khuẩn đột biến ưu tú ký hiệu N3 có khả năng sinh tổng hợp enzyme nattokinase cao vượt trội so với chủng tự nhiên ban đầu thông qua kiểm chứng đường kính vòng tan huyết thạch máu và đo hoạt tính protease bằng phương pháp Anson cải tiến. Các đặc tính hình thái, sinh hóa và động học sinh trưởng ổn định của chủng N3 cung cấp nguồn vật liệu sinh học tiềm năng cho các nghiên cứu tối ưu hóa công nghệ lên men và tinh chế enzyme tiêu sợi huyết nattokinase quy mô lớn tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Mở đầu Chương 2: Tổng quan Chương 3: Vật liệu và phương pháp Chương 4: Kết quả và bàn luận Chương 5: Kết luận và đề nghị 3 CHƯƠNG 2. Tổng quan về natto 2. Giới thiệu về natto Natto từ lâu được biết đến là món ăn dân dã được người dân Nhật Bản sử dùng hàng ngày, và được xem như món ăn cho sức khỏe. Natto là một sản phẩm đậu nành nguyên hạt nấu chín được lên men bằng vi khuẩn Bacillus subtilis var natto.

Có những sản phẩm tương tự ở thị trường Indonesia và Thái Lan, nhưng không có ở Trung Quốc (Lester A. Natto là thực phẩm đậu nành lên men có hoạt tính tiêu sợi huyết rất cao được phát hiện bởi Sumi và cộng sự vào năm 1982 ở Nhật Bản (Sumi, 1987). Natto là một loại thực phẩm có mùi, vị và độ nhớt đặc trưng (Shih và cộng sự, 2010). Natto có kết cấu dính nhầy đặc trưng là do các sợi γ-polyglutamic acid do B.

subtilis tạo ra trong quá trình lên men và quá trình ủ lạnh ở nhiệt độ thấp, rocchi và cộng sự, 2024, với cấu trúc mềm hơn và mùi đặc trưng của nó. Quá trình lên men giúp phân giải protein, loại bỏ các chất vị không mong muốn và góp phần làm tăng giá trị dinh dưỡng của natto, tùy thuộc vào quá trình xử lý natto đa dạng. Natto gồm có ba loại: Itohiki, Hamanatto, Daitokuji. Itohiki natto được cấy vi khuẩn và nuôi trong vòng 24 giờ mà không cần cho thêm muối trong suốt quá trình nuôi cấy.

Itohiki natto ở dạng nguyên hạt và có kết cấu nhớt, dính. Đây cũng là loại natto phổ biến và thông dụng nhất của người Nhật Bản. Itohiki natto gồm ba loại: Marudaizy natto, Hikiwari natto và Goto natto. Mỗi loại đều có kết cấu và hương vị khác nhau, phù hợp với mọi đối tượng người tiêu dùng.

Natto Hamanatto hoặc Daitokuji được nuôi cấy từ 4 đến 6 tháng bằng cách thêm nấm mốc vào và bổ sung muối vào quá trình nuôi cấy. Natto đại diện cho món ăn điển hình và chủ yếu trong cách nấu nướng và ăn kiêng của người Nhật, thường được phục vụ như bữa sáng với cơm. Kể từ khi được con người sử dụng ở các thành phố phía tây bắc Nhật Bản, trong khoảng thời gian từ năm 794 sau Công nguyên đến năm 1192 cho đến thời điểm này, natto là một liệu pháp chữa trị chứng mệt mỏi, bệnh beriberi, bệnh huyết khối và bệnh lỵ. Các quốc gia khác sử dụng natto để điều trị huyết áp cao, nhiễm virus O-157, xơ vữa động mạch và loãng xương.1: Sản phẩm natto 2.

Thành phần dinh dưỡng Bảng 2.1: Thành phần dinh dưỡng có trong 100 g natto (Afzaal và cộng sự, 2022) Thành phần dinh dưỡng Giá trị dinh dưỡng Năng lượng 211 calo Protein 19 g Chất béo 11 g Carbohydrat 13 g Chất xơ 5g Vitamin C 13 mg Kali 729 mg Canxi 217 mg Sắt 8,6 mg Natri 7g Ngoài ra, natto cũng chứa một lượng nhỏ vitamin B6 folate và axit pantothenic, cũng như chất chống oxy hóa và các hợp chất thực vật có lợi khác. Natto là một loại thực phẩm truyền thống của Nhật Bản, nổi bật nhờ giá trị dinh dưỡng cao, chủ yếu nhờ vào quá trình lên men đậu nành. Quá trình lên men này không chỉ chuyển hóa đậu nành thành một nguồn protein dễ hấp thu, mà còn tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của các vi khuẩn có lợi, hay còn gọi là probiotics. Các vi khuẩn này đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì sức khỏe đường ruột, giúp cải thiện khả năng tiêu hóa và tăng cường khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng từ thức ăn.