CHƯƠNG 1. Lý do chọn đề tài Sự phát triển về mặt kinh tế khiến cho nhu cầu về ăn uống cũng như các vấn đề về sức khoẻ trở thành mối quan tâm hàng đầu của con người. Thời gian gần đây tất cả mọi người ở mọi lứa tuổi, giới tính đều gặp ít nhiều các vấn đề về đường tiêu hoá. Có thể đơn giản là rối loạn tiêu hoá, tiêu chảy, táo bón,… nặng thì có thể là các bệnh nghiêm trọng hơn như viêm, nhiễm trùng, loét dạ dày đại tràng hay thậm chí là ung thư.1: Hiện trạng sức khoẻ ảnh hưởng bởi vi khuẩn Helicobacter pylori (HP) Theo Tổ chức Y Tế Thế Giới (WHO) có đến 50% dân số trên thế giới đang mang trong mình bệnh lý dạ dày do vi khuẩn Helicobacter pylori (HP) gây ra.
Đây là một căn bệnh phổ biến, dễ lây nhiễm và tiềm tàng nhiều mối nguy hại đến sức khoẻ con người. Khoảng 10 – 20% số người nhiễm HP có nguy cơ bị nhiễm trùng dạ dày và 1 – 2% có nguy cơ mắc ung thư dạ dày [39]. Tại Hội nghị khoa học quốc tế chuyên ngành Tiêu hóa - Gan do Bệnh viện Bạch Mai tổ chức, một nghiên cứu đã công bố tỷ lệ nhiễm HP ở Việt Nam có thể lên đến 70% - cao hơn nhiều so với các nước như Mỹ và Canada (khoảng 30%), Việt Nam hiện cũng đang đứng thứ 18 trong số 20 nước có tỷ lệ ung thư dạ dày cao nhất thế giới.2: Hiện trạng đề kháng kháng sinh của vi khuẩn Helicobacter pylori (HP) trên thế giới Hiện nay có nhiều phương pháp chẩn đoán vi khuẩn HP trong dạ dày, bao gồm cả phương pháp xâm lấn và không xâm lấn. Các phương pháp này đều có các nhược điểm như chỉ khẳng định được có vi khuẩn tiết Urease (nội soi, CLOtest, test Carbon đường thở), chỉ xác định được hình thái (mô bệnh học, tế bào học), đòi hỏi kỹ thuật cao (nuôi cấy), phải có một lượng vi khuẩn nhất định (CLOtest), độ nhạy và độ đặc hiệu thấp (xét nghiệm phân hoặc nước tiểu), không phân biệt được thời điểm xâm nhiễm (xét nghiệm huyết thanh).
Trong đó phương pháp PCR có ưu điểm là chính xác, trực tiếp, khẳng định được sự có mặt của vi khuẩn HP nên được sử dụng như một tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán vi khuẩn HP [38]. Phương pháp này có độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao (90 đến 100%) [26, 27]. Việc xác nhận Helicobacter pylori (HP) là nguyên nhân của bệnh loét dạ dày tá tràng đã tạo ra một sự thay đổi lớn [52]. Từ một bệnh được cho là rối loạn tâm thể, viêm dạ dày và loét dạ dày tá tràng được xác định là bệnh nhiễm trùng và chữa được bằng kháng sinh, mặc dù vẫn còn trở ngại là đề kháng kháng sinh ngày càng gia tăng [36, 52].
Hơn nữa, tổ chức nghiên cứu ung thư thế giới đã xếp vi khuẩn HP vào các tác nhân gây ung thư nhóm I từ năm 1994. Tiệt trừ HP có ý nghĩa vô cùng quan trọng trong việc phòng và điều trị các bệnh loét dạ dày tá tràng và ung thư dạ dày [37]. 12 Sự chẩn đoán và điều trị HP trở nên khó khăn do tình hình đề kháng kháng sinh của HP ngày càng gia tăng trên toàn thế giới, đặc biệt là Clarithromycin và Levofloxacin – là kháng sinh chủ lực trong việc chẩn đoán và điều trị HP [53, 54]. Việc chẩn đoán sớm đề kháng kháng sinh có thể giảm nguy cơ thất bại trong điều trị bệnh [79].
Phát hiện đề kháng bằng kiểu hình cần phải nuôi cấy vi khuẩn. Việc nuôi cấy HP khó thực hiện vì vi khuẩn phát triển chậm và yêu cầu điều kiện môi trường nghiêm ngặt [70]. Hơn nữa, cơ chế đề kháng kháng sinh của vi khuẩn chủ yếu là do các đột biến gen nên các phương pháp xác định kiểu gen là phương pháp thích hợp nhất [56]. Xác định kiểu gen đề kháng kháng sinh chủ yếu bằng các phương pháp sinh học phân tử.
Có nhiều phương pháp sinh học phân tử phát hiện đề kháng kháng sinh của HP, trong đó phương pháp PCR là một điển hình và đã được áp dụng trong nhiều nghiên cứu trên thế giới. Tại Việt Nam, phương pháp PCR mới được áp dụng và có kết quả bước đầu khả quan [5]. Áp dụng một phương pháp phân tử mới như PCR để phát hiện đề kháng Clarithromycin và Levofloxacin nhằm phục vụ cho nghiên cứu và điều trị là một nhu cầu cần thiết và qua đó đánh giá tình hình đề kháng Clarithromycin và Levofloxacin góp phần cho việc chọn lựa phác đồ phù hợp trong điều trị HP. Xuất phát từ các vấn đề trên, nhóm chúng tôi tiến hành đề tài “Thiết kế mồi dùng chẩn đoán kháng Clarithromycin và Levofloxacin ở vi khuẩn Helicobacter pylori”.
Mục tiêu nghiên cứu - Xác định tỷ lệ đề kháng của Clarithromycin và Levofloxacin ở vi khuẩn Helicobacter pylori. - Thiết kế mồi trên cơ sở PCR dùng để chẩn đoán kháng Clarithromycin và Levofloxacin ở vi khuẩn Helicobacter pylori. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu: vi khuẩn Helicobacter pylori (HP). - Phạm vi nghiên cứu: đề tài được thực hiện tại phòng tin học trường Đại học Văn Lang.
Nội dung nghiên cứu - Xác định kháng thể Clarithromycin và Levofloxacin ở vi khuẩn Helicobacter pylori. - Thiết kế đoạn mồi kháng Clarithromycin và Levofloxacin ở vi khuẩn Helicobacter 13 pylori. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 1. Ý nghĩa khoa học Nghiên cứu dùng phương pháp PCR đánh giá được tỷ lệ đề kháng với Clarithromycin và Levofloxacin của vi khuẩn Helicobacter pylori ngày càng được quan tâm và phổ biến.
Kỹ thuật thiết kế mồi phù hợp và khả thi sẽ góp phần đưa ra các chẩn đoán nhanh và có những phác đồ điều trị hợp lý. Ý nghĩa thực tiễn Việc thiết kế mồi dùng để chẩn đoán kháng Clarithromycin và Levofloxacin ở vi khuẩn Helicobacter pylori giúp bác sĩ chỉ định phác đồ chứa kháng sinh phù hợp, nâng cao hiệu quả tiệt trừ. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 2. Giới thiệu Helicobacter pylori (HP) là trực khuẩn gram âm có hình xoắn.
Dưới kính hiển vi điện tử, vi khuẩn có kích thước dài 2 – 4 µm, đường kính 0,5 – 1 µm, với 2 – 6 tiêm mao ở một đầu [42]. Hình dạng xoắn và các tiêm mao giúp cho vi khuẩn di chuyển trong lớp nhầy [19, 42]. Vi khuẩn sống ở lớp nhầy trên bề mặt niêm mạc dạ dày, một số ít bám trên bề mặt niêm mạc [19]. Helicobacter pylori tăng trưởng ở nhiệt độ 34 – 400C, tốt nhất là 370C; nó chịu được môi trường pH từ 5,5 – 8,0, tốt nhất là môi trường trung tính [42].1: Hình dạng vi khuẩn Helicobacter pylori (HP) 14 - Các đường lây truyền của vi khuẩn Helicobacter pylori (HP) Người là vật chủ quan trọng nhất với HP [73].
Các cơ chế lây truyền của HP gồm lây từ người sang người [23, 31], thông qua nguồn nước bị nhiễm hoặc dịch tiết ở miệng [31] và lây do chăm sóc y tế [23]. Lây truyền HP từ người sang người thông qua các đường: dạ dày – miệng, miệng – miệng, phân – miệng [23, 42]. + Đường truyền dạ dày – miệng: Đây là đường lây truyền quan trọng bởi vì việc nôn trớ các chất tiết trong dạ dày ra ngoài môi trường là phương tiện để lây nhiễm hay gặp ở trẻ em [2]. 62% mẫu dịch dạ dày nuôi cấy thấy HP trong dịch vị dạ dày sau khi lấy 2 giờ, 42% sau 6 giờ và 10% sau 24 giờ [32].
Thói quen vệ sinh kém cùng với chất nôn có chứa vi khuẩn là phương tiện để lây truyền [2, 32, 56]. + Đường truyền miệng – miệng: Vi khuẩn từ dạ dày theo chất nôn hay chất trào ngược lên khoang miệng. Miệng trở thành ổ chứa vi khuẩn, nước bọt có thể là nguồn truyền vi khuẩn HP. Nghiên cứu tại Anh năm 2002 tìm thấy 68% trẻ nhiễm HP có HP ở cao răng [2, 11, 17, 44].
+ Đường truyền phân – miệng: Một số nghiên cứu dùng phương pháp PCR để phát hiện HP trong phân [43]. Nghiên cứu của Laporte 2004, trong vụ dịch viêm dạ dày do HP ở những cộng đồng người trẻ tuổi bằng phương pháp ELISA phát hiện kháng nguyên trong mẫu phân đã chứng minh được đường lây truyền HP qua đường phân miệng [42]. Các nghiên cứu khác bằng phương pháp PCR đã chứng minh được đường lây truyền của HP qua đường phân miệng đặc biệt trong điều kiện vệ sinh kém [2]. - Đặc điểm vi sinh vật của vi khuẩn Helicobacter pylori Helicobacter pylori là vi khuẩn vi ái khí, mọc chậm và cần môi trường nuôi cấy phức tạp trong phòng xét nghiệm.
Môi trường chọn lọc thường là Helicobacter - agar hoặc thạch máu ngựa hoặc cừu. Vi trường tối ưu cho sự phát triển của HP là hỗn hợp khí O2:CO2:N2 với tỷ lệ 5:10:85%, tương ứng. Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp nhất là 35 – 37oC [21, 45, 48]. Nuôi cấy HP cần có môi trường chọn lọc và kháng sinh thích hợp (gồm: Vancomycine, Trimethoprim, Cefsulodin, Amphotericin B) để ức chế nấm và tạp khuẩn [21].
Mẫu mô niêm mạc dạ dày dùng để nuôi cấy HP không được để quá 2 giờ ở nhiệt độ phòng [45]. Khi nuôi cấy có vi khuẩn mọc trên môi trường đặc, các khuẩn lạc 15 nhỏ như đầu đinh ghim, đường kính khoảng 1 mm, trơn láng, hơi mờ [21, 48] thường sẽ xuất hiện từ ngày thứ 2 đến ngày thứ 5 trên bề mặt đĩa thạch [21]. - Đặc điểm các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn Helicobacter pylori Các yếu tố liên quan sinh cư và gây bệnh của HP bao gồm vai trò của tiêm mao, enzyme urease, yếu tố bám dính và các yếu tố độc lực của vi khuẩn [60]. + Vai trò các tiêm mao Cấu trúc cơ bản của các tiêm mao này gồm có vỏ ngoài liên tục với màng tế bào vi khuẩn.
Bên trong là một lỗ dài được cấu tạo bởi nhiều thành phần. Các tiêm mao giúp HP di chuyển xuyên qua lớp nhầy đến bề mặt niêm mạc, nơi có pH trung tính để sinh sống và xâm nhập vào tế bào biểu mô vật chủ để gây bệnh [14, 60]. Phương thức xâm nhập là di chuyển và hóa hướng động hướng về các tế bào niêm mạc dạ dày [64]. + Kháng acid.
Một trong những tính năng nổi bật của HP là có thể xâm nhập môi trường axit dạ dày dù không phải là một vi khuẩn ưa axit. Độ pH của niêm mạc dạ dày thay đổi trong khoảng 4 – 6,5, nhưng đôi khi cũng có thể thay đổi đột ngột, do đó đòi hỏi HP phải có các cơ chế để tự bảo vệ. Xét theo khía cạnh này, ban đầu HP di chuyển nhanh về phía lớp chất nhầy dạ dày bằng hóa hướng động sử dụng urê và chênh lệch bicarbonate có trong môi trường dạ dày.