Luận án tiến sĩ định lượng actinobacillus actinomycetemcomitans porphyromonas gingivalis bằng realtime pcr và đánh giá hiệu quả của phương pháp điều trị không phẫu thuật bệnh viêm quanh răng

Luận án tiến sĩ phân tích định lượng actinobacillus actinomycetemcomitans porphyromonas gingivalis bằng realtime pcr và đánh, xây dựng cơ sở lý luận, kiểm chứng thực nghiệm, đóng

• Trường học: Đại học Y Hà Nội
• Chuyên ngành: Nha khoa
• Đề tài: Định lượng Actinobacillus Actinomycetemcomitans và Porphyromonas Gingivalis bằng Realtime PCR và đánh giá hiệu quả điều trị viêm quanh răng không phẫu thuật
• Loại tài liệu: nghiên cứu
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1. Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. KHÁI NIỆM VÀ PHÂN LOẠI VIÊM QUANH RĂNG
• 1.1.1. Khái niệm về viêm quanh răng
• 1.1.2. Phân loại viêm quanh răng
• 1.1.2.1. Viêm quanh răng mạn tính
• 1.1.2.2. Viêm quanh răng tiến triển
• 1.2. VI KHUẨN VÀ BỆNH SINH CỦA VIÊM QUANH RĂNG
• 1.2.1. Hệ tạp khuẩn bình thường ở miệng
• 1.2.1.1. Hệ tạp khuẩn ở miệng
• 1.2.1.2. Hệ tạp khuẩn ở mảng bám răng
• 1.2.2. Vi khuẩn trong bệnh viêm quanh răng
• 1.2.2.1. Tỉ lệ các loại vi khuẩn trong viêm quanh răng
• 1.2.3. Bệnh sinh của viêm quanh răng
• 1.2.4. Độc lực của vi khuẩn gây viêm quanh răng

Tóm tắt

I. Giới thiệu về viêm quanh răng và tầm quan trọng của việc định lượng vi khuẩn

Viêm quanh răng (VQR) là một bệnh nhiễm khuẩn phá hủy các mô nâng đỡ răng, gây ra hậu quả nghiêm trọng như mất răng và ảnh hưởng đến sức khỏe toàn thân. Bệnh khởi phát từ mảng bám răng, nơi chứa các vi khuẩn gây bệnh như Actinobacillus Actinomycetemcomitans và Porphyromonas Gingivalis. Việc định lượng vi khuẩn chính xác bằng Realtime PCR là cần thiết để chẩn đoán và điều trị hiệu quả. Phương pháp này giúp xác định số lượng vi khuẩn, từ đó đánh giá hiệu quả của điều trị không phẫu thuật và theo dõi diễn tiến bệnh.

1.1. Tình hình bệnh viêm quanh răng trên thế giới và Việt Nam

Viêm quanh răng là bệnh phổ biến, với tỷ lệ mắc cao ở nhiều quốc gia. Tại Mỹ, 47% dân số trên 30 tuổi mắc bệnh, trong khi ở Ấn Độ, tỷ lệ này tăng theo tuổi. Ở Việt Nam, nghiên cứu của Trần Văn Trường cho thấy 36,5% nam và 27,5% nữ có túi quanh răng. Bệnh gây ra bởi sự mất cân bằng hệ vi khuẩn trong miệng, đặc biệt là sự gia tăng của Porphyromonas Gingivalis và Actinobacillus Actinomycetemcomitans. Việc định lượng chính xác các vi khuẩn này là yêu cầu cấp thiết để điều trị hiệu quả.

1.2. Vai trò của vi khuẩn trong bệnh sinh viêm quanh răng

Vi khuẩn đóng vai trò trung tâm trong bệnh sinh của viêm quanh răng. Sự gia tăng của các vi khuẩn kỵ khí Gram âm như Porphyromonas Gingivalis và Actinobacillus Actinomycetemcomitans là nguyên nhân chính gây bệnh. Các vi khuẩn này sản xuất độc tố và enzyme phá hủy mô nâng đỡ răng. Việc sử dụng Realtime PCR để định lượng vi khuẩn giúp xác định chính xác mức độ nhiễm khuẩn, từ đó lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp.

II. Phương pháp Realtime PCR trong định lượng vi khuẩn

Realtime PCR là kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại, cho phép định lượng chính xác DNA của vi khuẩn trong thời gian ngắn. Phương pháp này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, giúp xác định số lượng Actinobacillus Actinomycetemcomitans và Porphyromonas Gingivalis trong mẫu bệnh phẩm. So với kỹ thuật nuôi cấy truyền thống, Realtime PCR tiết kiệm thời gian và công sức, đồng thời cho kết quả chính xác hơn.

2.1. Ưu điểm của Realtime PCR trong chẩn đoán vi khuẩn

Realtime PCR có nhiều ưu điểm vượt trội so với các phương pháp truyền thống. Kỹ thuật này cho phép phát hiện và định lượng vi khuẩn ngay cả khi số lượng ít, nhờ độ nhạy cao. Ngoài ra, Realtime PCR có thể xác định đồng thời nhiều loại vi khuẩn trong một mẫu bệnh phẩm, giúp tiết kiệm thời gian và chi phí. Đây là công cụ hữu ích trong việc chẩn đoán và theo dõi hiệu quả điều trị viêm quanh răng.

2.2. Ứng dụng Realtime PCR trong nghiên cứu viêm quanh răng

Trong nghiên cứu viêm quanh răng, Realtime PCR được sử dụng để đánh giá sự thay đổi số lượng vi khuẩn trước và sau điều trị. Kết quả từ kỹ thuật này giúp xác định hiệu quả của các phương pháp điều trị không phẫu thuật, đồng thời theo dõi diễn tiến bệnh. Nghiên cứu tại Việt Nam đã ứng dụng Realtime PCR để định lượng Actinobacillus Actinomycetemcomitans và Porphyromonas Gingivalis, mở ra hướng đi mới trong chẩn đoán và điều trị bệnh.

III. Đánh giá hiệu quả điều trị viêm quanh răng không phẫu thuật

Điều trị không phẫu thuật là phương pháp chính trong kiểm soát viêm quanh răng, bao gồm làm sạch mảng bám, vôi răng và sử dụng kháng sinh. Việc đánh giá hiệu quả điều trị dựa trên sự thay đổi lâm sàng, X-quang và số lượng vi khuẩn. Realtime PCR đóng vai trò quan trọng trong việc theo dõi sự giảm thiểu của Actinobacillus Actinomycetemcomitans và Porphyromonas Gingivalis sau điều trị.

3.1. Kết quả lâm sàng và cận lâm sàng sau điều trị

Sau điều trị không phẫu thuật, các triệu chứng lâm sàng như viêm lợi, chảy máu chân răng giảm đáng kể. X-quang cho thấy sự cải thiện trong mật độ xương ổ răng. Đặc biệt, Realtime PCR ghi nhận sự giảm số lượng Porphyromonas Gingivalis và Actinobacillus Actinomycetemcomitans, chứng tỏ hiệu quả của phương pháp điều trị. Đây là cơ sở để điều chỉnh phác đồ và theo dõi lâu dài.

3.2. Ý nghĩa của việc đánh giá hiệu quả điều trị

Việc đánh giá hiệu quả điều trị không chỉ dựa trên triệu chứng lâm sàng mà còn dựa vào sự thay đổi số lượng vi khuẩn. Realtime PCR cung cấp dữ liệu chính xác về sự giảm thiểu vi khuẩn gây bệnh, giúp bác sĩ đưa ra quyết định điều trị phù hợp. Điều này đặc biệt quan trọng trong việc ngăn ngừa tái phát và kiểm soát lâu dài viêm quanh răng.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Bệnh viêm quanh răng (VQR) là một bệnh nhiễm khuẩn mạn tính phá hủy các mô nâng đỡ của răng bao gồm dây chằng quanh răng, biểu mô bám dính và xương ổ răng. Bệnh tiến triển dai dẳng và có thể dẫn đến các hậu quả nghiêm trọng như răng lung lay hàng loạt, mất chức năng ăn nhai, ảnh hưởng đến thẩm mỹ và sức khỏe toàn thân.

Về mặt dịch tễ học, tỷ lệ mắc bệnh VQR có sự phân bố rộng và khác nhau giữa các khu vực:

• Tại Mỹ, tỷ lệ mắc bệnh là 47% trong tổng số 64,7 triệu dân ở độ tuổi trên 30.
• Tại Ấn Độ, tỷ lệ này tăng dần theo lứa tuổi: đạt 67,7% ở nhóm tuổi 12–15 và 89,6% ở nhóm tuổi 35–44.
• Tại Việt Nam, theo điều tra dịch tễ học của Trần Văn Trường và cộng sự (năm 2000), có 36,5% nam giới và 27,5% nữ giới có túi quanh răng, cho thấy nhu cầu điều trị bệnh lý quanh răng trong cộng đồng rất lớn.

Bệnh nguyên của VQR khởi phát từ mảng bám sinh học vi khuẩn trên bề mặt răng. Trong số hàng trăm loài vi khuẩn tồn tại ở khoang miệng, Actinobacillus actinomycetemcomitans (A. actinomycetemcomitans) và Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis) được xác định là hai tác nhân vi khuẩn chủ yếu tham gia trực tiếp vào cơ chế bệnh sinh.

Khoảng trống nghiên cứu được luận án chỉ ra bao gồm:

• Kỹ thuật nuôi cấy vi khuẩn kỵ khí cổ điển tốn nhiều thời gian, công sức và tỷ lệ mọc thấp do đặc tính kỵ khí tuyệt đối của vi khuẩn.
• Các kỹ thuật sinh học phân tử nhập khẩu có giá thành cao, chưa được chuẩn hóa tại chỗ cho quy trình điều trị lâm sàng thường quy.
• Tại Việt Nam, trước thời điểm nghiên cứu chưa có công trình nào ứng dụng kỹ thuật Realtime PCR để định lượng đồng thời A. actinomycetemcomitans và P. gingivalis, đồng thời kết hợp theo dõi sự thay đổi số lượng, tỷ lệ của hai vi khuẩn này trước và sau điều trị VQR mạn tính dạng toàn thể bằng phương pháp không phẫu thuật.

Luận án xác định 02 mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

1. Nhận xét đặc điểm và mối tương quan giữa lâm sàng, X-quang, số lượng vi khuẩn A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis trong dịch lợi trên bệnh nhân viêm quanh răng mạn tính dạng toàn thể.
2. Đánh giá hiệu quả của phương pháp điều trị không phẫu thuật đối với viêm quanh răng mạn tính dạng toàn thể dựa trên lâm sàng, X-quang và số lượng, tỉ lệ vi khuẩn A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng: 70 bệnh nhân được chẩn đoán VQR mạn tính dạng toàn thể.
• Không gian: Thu thập bệnh phẩm và điều trị lâm sàng tại Khoa Nha chu – Bệnh viện Răng Hàm Mặt TP. Hồ Chí Minh; thực hiện xét nghiệm Realtime PCR tại Trung tâm nghiên cứu Gen – Protein, Trường Đại học Y Hà Nội.
• Thời gian: Từ ngày 01/10/2011 đến ngày 30/10/2014.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án hệ thống hóa các tài liệu khoa học về phân loại bệnh quanh răng, hệ vi khuẩn miệng, cơ chế sinh bệnh học và các phác đồ điều trị:

1. Phân loại bệnh viêm quanh răng

Theo phân loại của Hội nghị quốc tế về bệnh viêm quanh răng tại Mỹ năm 1999 (AAP 1999), thuật ngữ "VQR mạn tính" được sử dụng thay thế cho "VQR ở người trưởng thành", và nhóm "VQR tiến triển" được hợp nhất từ các thể "VQR thanh thiếu niên", "VQR phá hủy tiến triển", "VQR sớm" (EOP) và "VQR tiến triển nhanh" (RPP).

Bệnh VQR mạn tính được phân loại theo phạm vi:

• Dạng khu trú: Tổn thương hiện diện ở $\le 30%$ số răng trên cung hàm.
• Dạng toàn thể: Tổn thương hiện diện ở $> 30%$ số răng trên cung hàm.

Mức độ mất bám dính lâm sàng (CAL):

• Nhẹ: Mất bám dính 1–2 mm.
• Trung bình: Mất bám dính 3–4 mm.
• Nặng: Mất bám dính $\ge 5$ mm.

2. Hệ tạp khuẩn miệng và sự biến đổi vi khuẩn học

Khoang miệng có hơn 700 loài vi sinh vật, trong đó hơn 400 loài được định danh từ túi quanh răng và 300 loài từ các vị trí khác. Quá trình chuyển đổi từ mô lợi lành mạnh sang viêm lợi và VQR gắn liền với sự thay đổi căn bản về tỷ lệ và cấu trúc hệ vi khuẩn:

Nhóm vi khuẩn	Mô lợi lành (%)	Viêm lợi (%)	Viêm quanh răng (%)
Hiếu khí	75	50	10
Kỵ khí	25	50	90
Gram dương (+)	85	56	25
Gram âm (-)	15	44	75

3. Các hướng nghiên cứu vi khuẩn và vị trí của luận án

Tác giả đã điểm lại nhiều nghiên cứu trên thế giới về sự hiện diện và tỷ lệ của các chủng vi khuẩn trong bệnh VQR:

• Riggio (1996): Tỷ lệ phát hiện P. gingivalis và A. actinomycetemcomitans bằng phương pháp nuôi cấy là 11% và 15%, trong khi phát hiện qua PCR đạt 24%.
• Kumar (2003): Khảo sát 39 loài vi khuẩn bằng PCR, xác định tỷ lệ P. gingivalis (36% ở VQR so với 45% ở nhóm chứng), Treponema denticola (62% so với 17%), Filifactor alocis (59% so với 29%), Treponema socranskii (95% so với 59%).
• Salari (2004), Choi (2000), Paul (2005), Botero (2007): So sánh tỷ lệ các vi khuẩn giữa VQR mạn tính và VQR tiến triển.
• Nakano và cộng sự (2008): Tìm thấy P. gingivalis trong 50% mảng bám răng và 10,4% bệnh phẩm van tim, mảng xơ vữa động mạch ở 80 bệnh nhân xơ vữa động mạch.
• Campus và cộng sự (2005): Phát hiện tỷ lệ nhiễm P. gingivalis trong mảng bám dưới lợi ở 71 bệnh nhân VQR mạn tính kèm đái tháo đường týp 2 cao hơn có ý nghĩa so với nhóm 141 bệnh nhân không đái tháo đường.
• Wu Yan-min và cộng sự (2007): Chỉ ra rằng các chủng mang gen độc lực prtC+/fimA+ (P. gingivalis) và lktA+ (A. actinomycetemcomitans) chiếm ưu thế ở bệnh nhân VQR mạn tính dạng toàn thể.

Luận án lựa chọn giải quyết khoảng trống thực tiễn tại Việt Nam: Xây dựng quy trình kỹ thuật Realtime PCR sử dụng mẫu mồi và TaqMan probe đặc hiệu để định lượng tương đối A. actinomycetemcomitans và P. gingivalis, kết hợp đánh giá phác đồ điều trị không phẫu thuật có sử dụng kháng sinh toàn thân phối hợp Metronidazole và Doxycycline.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

1. Cơ sở lý thuyết về độc lực vi khuẩn

Cơ chế bệnh sinh của VQR bao gồm sự tương tác giữa độc lực vi khuẩn và đáp ứng miễn dịch của vật chủ:

• Khả năng bám dính: Thông qua cấu trúc tua (fimbriae) giúp vi khuẩn gắn kết vào biểu mô khe lợi, nguyên bào sợi và chất nền ngoại bào.
• Xâm nhiễm và phá hủy mô trực tiếp: Tiết các enzym phân giải protein (collagenase, gelatinase, protease) và các chất chuyển hóa độc hại (amoniac, acid béo, hợp chất lưu huỳnh bay hơi).
• Cơ chế gián tiếp: Nội độc tố Lipopolysaccharide (LPS) kích thích đại thực bào và bạch cầu đơn nhân tiết cytokine tiền viêm (IL-1, TNF-$\alpha$, prostaglandin) gây tiêu xương ổ răng.
• Trốn thoát miễn dịch: A. actinomycetemcomitans tiết ngoại độc tố Leukotoxin (được mã hóa bởi operon 4 gen lktA, lktB, lktC, lktD) gây chết tế bào bạch cầu đa nhân, đơn nhân và tế bào lympho. P. gingivalis phá hủy kháng thể IgG, IgA và hệ thống bổ thể thông qua các protease.

2. Thiết kế nghiên cứu và đối tượng

• Thiết kế: Nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng, tự đối chứng đánh giá kết quả trước – sau điều trị tại 3 thời điểm:
  • Thời điểm $T_0$: Ngày đầu tiên (trước điều trị).
  • Thời điểm $T_1$: Sau điều trị 2 tuần.
  • Thời điểm $T_2$: Sau điều trị 12 tuần.
• Công thức tính cỡ mẫu: $$N = Z_{1-\alpha/2}^2 \cdot \frac{P(1-P)}{d^2}$$ Với độ tin cậy 95% ($Z_{1-\alpha/2} = 1{,}96$), sai số $d = 0{,}1$, tỷ lệ thành công dự kiến $P = 0{,}8$. Cỡ mẫu tối thiểu tính được là 62 bệnh nhân; thực tế nghiên cứu chọn 70 bệnh nhân (thu thập 210 mẫu dịch khe lợi qua 3 lần lấy mẫu).
• Tiêu chuẩn chọn mẫu: Tuổi $\ge 30$; chẩn đoán VQR mạn tính dạng toàn thể (túi quanh răng $\ge 3$ mm, đang hoạt động có chảy máu khi thăm khám bằng cây đo Miller); còn tối thiểu 20 răng; không mắc bệnh toàn thân mạn tính (tim mạch, đái tháo đường); không dùng kháng sinh/kháng viêm trong 1 tháng trước nghiên cứu; không điều trị quanh răng trong 12 tuần trước đó; không hút thuốc lá; đồng ý tham gia.
• Tiêu chuẩn loại trừ: Có áp xe quanh răng cấp, viêm quanh thân răng số 8, phụ nữ mang thai hoặc cho con bú, bệnh nhân HIV hoặc mắc bệnh tâm thần.

3. Phương pháp thu thập dữ liệu lâm sàng và X-quang

• Chỉ số mảng bám (PLI - Silness & Löe, 1964): Đánh giá 4 mặt răng theo thang điểm 0–3.
• Chỉ số lợi (GI - Silness & Löe, 1967): Đánh giá mức độ viêm tại 4 vùng lợi theo thang điểm 0–3.
• Độ sâu túi quanh răng (PPD): Đo bằng cây đo túi William (chia vạch 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10 mm) tại 4 vị trí quanh mỗi răng.
• Độ mất bám dính lâm sàng (CAL): Khoảng cách từ đáy túi đến đường nối men – xê măng.
• Độ lung lay răng: Đánh giá theo thang điểm Miller (độ 0 đến độ 3).
• Phim toàn cảnh kỹ thuật số Panorex: Xác định dạng tiêu xương (tiêu xương ngang, tiêu xương chéo hoặc kết hợp).

4. Quy trình sinh học phân tử Realtime PCR

• Lấy bệnh phẩm: Đặt 5 cây côn giấy số 30 (dài 21 mm) vô trùng vào đáy túi quanh răng sâu nhất có chảy máu trong 10 giây. Bảo quản mẫu tại nhiệt độ $-80^\circ\text{C}$ bằng tủ đông sâu SANYO tại TP.HCM trước khi chuyển ra Hà Nội.
• Tách chiết DNA: Sử dụng bộ kit QIAamp DNA Mini (QIAGEN - USA) theo quy trình chuẩn của nhà sản xuất. Kiểm tra độ tinh khiết DNA qua tỷ số $A_{260}/A_{280}$ (đạt khoảng 1,8–2,0 trên máy NanoDrop 1000) và điện di gel agarose 1%.
• Thiết kế mồi và TaqMan probe: Thực hiện bằng phần mềm Beacon Designer, kiểm tra độ tương đồng qua BLAST trên NCBI:

Đối tượng	Đoạn mồi / Probe	Trình tự Nucleotid ($5' \rightarrow 3'$)
Gen nội chuẩn (16S rDNA)	Mồi xuôi Mồi ngược TaqMan Probe	GTT GTT AAG GGT GCG TAG GGT TTA C CTG CCG CCA CTG AAC TCA A FAM-CCT GAG TCA GCG GTG AAA GGT AAG CG
A. actinomycetemcomitans (Gen lkt)	Mồi xuôi Mồi ngược TaqMan Probe	CAA GTG TGA TTA GGT AGT TGG TGG G CCT TCC TCA TCA CCG AAA GAA FAM-ATC GCT AGC TGG TCT GAG AGG ATG GCC
P. gingivalis (Gen rgpA)	Mồi xuôi Mồi ngược TaqMan Probe	AAA CGA CGA TTA ATA CCA CAT GAG AC ACT CGT ATC GCC CGT TAT TC FAM-AGC TGT AAG ATA GGC ATG CGT CCC ATT AGC

• Thành phần phản ứng ($20,\mu\text{l}$): Nước cất PCR ($11{,}3,\mu\text{l}$), Buffer 10X ($2{,}0,\mu\text{l}$), dNTP 2,5 mM ($2{,}0,\mu\text{l}$), mồi xuôi ($0{,}5,\mu\text{l}$), mồi ngược ($0{,}5,\mu\text{l}$), Probe ($0{,}5,\mu\text{l}$), Taq polymerase 5 U/$\mu$l ($0{,}2,\mu\text{l}$), DNA mẫu 20 ng ($3{,}0,\mu\text{l}$).
• Chu trình nhiệt trên máy Realtime PCR Eppendorf: Biến tính ban đầu $94^\circ\text{C}$ trong 5 phút; chạy 40 chu kỳ gồm biến tính $94^\circ\text{C}$ (30 giây) và bắt cặp/kéo dài $60^\circ\text{C}$ (1 phút).
• Định lượng tương đối: So sánh chu kỳ ngưỡng ($C_t$): $$\text{Tỷ lệ } Aa \text{ (hoặc } Pg\text{)} = \frac{C_t \text{ của 16S rDNA}}{C_t \text{ của } Aa \text{ (hoặc } Pg\text{)}}$$

5. Phác đồ điều trị không phẫu thuật

1. Lấy sạch mảng bám, vôi răng trên và dưới lợi bằng máy siêu âm.
2. Nạo và xử lý mặt chân răng bằng bộ cây nạo Gracey curettes, bơm rửa túi lợi bằng dung dịch Chlorhexidine 0,12%.
3. Điều chỉnh khớp cắn, nẹp răng lung lay, nhổ răng không thể bảo tồn (nếu có chỉ định).
4. Sử dụng kháng sinh toàn thân trong 7 ngày: Metronidazole (1,5 g/ngày chia 3 lần) kết hợp Doxycycline (100 mg/ngày chia 3 lần).
5. Súc miệng bằng dung dịch Kin Gingival Mouthwash chứa Chlorhexidine Digluconate 0,12%. Hướng dẫn chải răng bằng phương pháp Bass cải tiến với kem đánh răng Colgate Total 3 lần/ngày.

6. Xử lý số liệu

Nhập số liệu bằng Excel, xử lý thống kê bằng phần mềm SPSS. Áp dụng kiểm định $t$-test, Wilcoxon bắt cặp để so sánh các chỉ số lâm sàng và vi khuẩn giữa các thời điểm; sử dụng hệ số tương quan Spearman để phân tích mối quan hệ giữa các biến số phi tham số.

---

Nội dung chính theo từng chương

Đặt vấn đề

Trình bày bối cảnh bệnh học, tính chất phá hủy mô nâng đỡ răng của VQR, gánh nặng dịch tễ tại Việt Nam và trên thế giới. Xác định vai trò của vi khuẩn A. actinomycetemcomitans và P. gingivalis, nêu rõ tính cấp thiết của việc áp dụng kỹ thuật Realtime PCR trong chẩn đoán định lượng vi khuẩn và theo dõi điều trị.

Chương 1: Tổng quan tài liệu

• Tổng quan về định nghĩa, cơ chế sinh bệnh học và hệ thống phân loại bệnh quanh răng năm 1999.
• Đặc điểm vi sinh vật học mảng bám răng: Phân tích sự chuyển dịch từ hệ vi khuẩn Gram dương hiếu khí ở mô lành sang phức hợp vi khuẩn kỵ khí Gram âm trong VQR.
• Độc lực học phân tử của A. actinomycetemcomitans (hệ gen lkt) và P. gingivalis (hệ gen rgpA, fimA, prtC).
• Các phương pháp điều trị VQR: Điều trị cơ học không phẫu thuật (lấy vôi răng, nạo chân răng bằng Gracey), phẫu thuật quanh răng, sử dụng kháng sinh tại chỗ (Arestin, Periochip, gel Metronidazole) và kháng sinh toàn thân (Metronidazole, Doxycycline, Amoxicillin).
• Lịch sử và nguyên lý các phương pháp xét nghiệm vi khuẩn: Nuôi cấy kỵ khí, kỹ thuật miễn dịch ELISA, kỹ thuật PCR và Realtime PCR (định lượng tuyệt đối và định lượng tương đối).

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

• Tiêu chuẩn chọn mẫu và loại trừ trên 70 bệnh nhân VQR mạn tính dạng toàn thể tại Bệnh viện Răng Hàm Mặt TP. Hồ Chí Minh.
• Quy trình lấy mẫu dịch lợi bằng côn giấy số 30 và kỹ thuật bảo quản lạnh sâu.
• Quy trình tách chiết DNA bằng bộ kít QIAamp DNA Mini và kỹ thuật Realtime PCR sử dụng mẫu mồi/TaqMan probe huỳnh quang thiết kế trên Beacon Designer.
• Phác đồ can thiệp điều trị không phẫu thuật kết hợp kháng sinh đường toàn thân (Metronidazole phối hợp Doxycycline) và nước súc miệng Chlorhexidine 0,12%.
• Hệ thống các chỉ số đánh giá lâm sàng (PLI, GI, PPD, CAL, độ lung lay răng Miller) và tiêu chuẩn đánh giá kết quả điều trị tại các mốc thời gian $T_0, T_1, T_2$.
• Phân tích thống kê bằng SPSS và các quy định về đạo đức nghiên cứu y sinh học.

Chương 3: Kết quả nghiên cứu

• Đặc điểm nhân khẩu học của đối tượng nghiên cứu ($n=70$):

Nhóm giới tính	Số lượng ($n$)	Tỷ lệ (%)	Độ tuổi trung bình ($\bar{X} \pm \text{SD}$)
Nam	44	62,9	45,14 ± 8,78
Nữ	26	37,1	42,81 ± 8,51
Tổng số	70	100	44,27 ± 8,69

Độ tuổi của nhóm nghiên cứu phân bố chuẩn từ 29 đến 60 tuổi, trong đó độ tuổi có số bệnh nhân mắc nhiều nhất là 44 tuổi ($n=6$).

• Đặc điểm lâm sàng và tổn thương X-quang tại thời điểm ban đầu ($T_0$):

Chỉ số lâm sàng / X-quang ($n=70$)	Giá trị ($\bar{X} \pm \text{SD}$ hoặc %)
Chỉ số mảng bám (PLI)	2,67 ± 0,56
Chỉ số lợi (GI)	2,37 ± 0,93
Độ sâu túi quanh răng (PPD)	5,78 ± 1,35 mm
Mất bám dính lâm sàng (CAL)	5,73 ± 3,15 mm
Độ lung lay của răng	1,96 ± 0,95
Dạng tiêu xương trên Panorex:
+ Tiêu xương ngang	78,6%
+ Tiêu xương chéo	12,9%
+ Tiêu xương ngang kết hợp tiêu xương chéo	8,6%

Tại thời điểm $T_0$, tình trạng bệnh lý của nhóm nghiên cứu ở mức độ nặng: Điểm mảng bám PLI mức 3 chiếm 71,0% (50/70 bệnh nhân), mức 1 chỉ có 3 bệnh nhân; mô lợi sưng đỏ, chảy máu tự phát hoặc chảy máu khi thăm dò; độ sâu túi quanh răng và mất bám dính lâm sàng đều ở mức cao ($>5$ mm).

---

Kết quả và những đóng góp mới

1. Đóng góp về mặt phương pháp và kỹ thuật:

   • Chuẩn hóa và ứng dụng quy trình Realtime PCR sử dụng hệ mồi và đầu dò TaqMan probe đặc hiệu (hướng đến gen lkt của A. actinomycetemcomitans, gen rgpA của P. gingivalis và gen nội chuẩn 16S rDNA) để định lượng tương đối hai loại vi khuẩn gây bệnh trong dịch khe lợi.
   • Xây dựng giải pháp kỹ thuật gửi và bảo quản bệnh phẩm dịch lợi từ phía Nam (Bệnh viện Răng Hàm Mặt TP. Hồ Chí Minh) ra phía Bắc (Đại học Y Hà Nội) phục vụ phân tích sinh học phân tử.

2. Đóng góp về mặt lâm sàng và thực tiễn:

   • Cung cấp các thông số định lượng chuẩn xác về tình trạng lâm sàng (PLI, GI, PPD, CAL, lung lay răng) và hình thái tiêu xương ổ răng ở bệnh nhân VQR mạn tính thể toàn thể.
   • Đánh giá hiệu quả của phác đồ điều trị không phẫu thuật phối hợp đa phương thức: Cơ học (lấy vôi siêu âm, nạo chân răng Gracey) kết hợp hóa dược (Chlorhexidine 0,12% và kháng sinh toàn thân Metronidazole phối hợp Doxycycline trong 7 ngày).

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế:

  • Luận án tập trung vào 02 loài vi khuẩn đích (A. actinomycetemcomitans và P. gingivalis), chưa bao quát toàn bộ các loài vi khuẩn kỵ khí khác trong mảng bám răng (như phức hợp Tannerella forsythia, Treponema denticola, Prevotella intermedia).
  • Đối tượng nghiên cứu giới hạn ở bệnh nhân VQR mạn tính thể toàn thể độ tuổi $\ge 30$, chưa mở rộng trên nhóm VQR tiến triển/tấn công hoặc bệnh nhân có bệnh lý toàn thân kết hợp.
  • Thời gian theo dõi hiệu quả điều trị trong phạm vi luận án dừng ở mốc 12 tuần ($T_2$).

• Hướng nghiên cứu tiếp:

  • Mở rộng ứng dụng kỹ thuật Realtime PCR định lượng thêm các vi khuẩn gây bệnh khác thuộc phức hợp đỏ và phức hợp cam.
  • Kéo dài thời gian theo dõi lâm sàng và vi khuẩn học sau 6 tháng, 12 tháng và 24 tháng nhằm đánh giá độ ổn định lâu dài và tỷ lệ tái phát sau điều trị không phẫu thuật.

---

Giá trị tham khảo

• Đối với bác sĩ chuyên khoa Răng Hàm Mặt và Nha chu: Cung cấp quy trình điều trị không phẫu thuật chi tiết và phác đồ phối hợp kháng sinh toàn thân (Metronidazole kết hợp Doxycycline) cùng các tiêu chí định lượng theo dõi đáp ứng điều trị.
• Đối với các nhà nghiên cứu và học viên sau đại học: Cung cấp thông tin tham khảo về trình tự đoạn mồi, TaqMan probe, chu trình nhiệt Realtime PCR và phương pháp lấy mẫu dịch khe lợi bằng côn giấy phục vụ các nghiên cứu vi sinh học phân tử trong nha khoa.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Luận án sử dụng những gen đích nào để thiết kế mồi và TaqMan probe trong phản ứng Realtime PCR?

Luận án sử dụng trình tự gen nội chuẩn 16S rDNA của hệ vi khuẩn miệng, gen lkt đặc hiệu cho A. actinomycetemcomitans (từ chủng ATCC 29522) và gen rgpA đặc hiệu cho P. gingivalis (từ chủng ATCC 33277) được trích xuất từ ngân hàng gen GenBank/NCBI.

2. Phác đồ kháng sinh toàn thân được áp dụng trong nghiên cứu gồm những loại thuốc nào và liều lượng ra sao?

Phác đồ sử dụng kháng sinh đường uống trong 7 ngày, gồm: Metronidazole liều 1,5 g/ngày (chia 3 lần) kết hợp với Doxycycline liều 100 mg/ngày (chia 3 lần).

3. Phương pháp định lượng tương đối số lượng vi khuẩn trong dịch lợi được tính toán như thế nào?

Số lượng vi khuẩn được tính toán gián tiếp dựa trên phương pháp so sánh chu kỳ ngưỡng ($C_t$): $$\text{Tỷ lệ vi khuẩn } = \frac{C_t \text{ của gen 16S rDNA}}{C_t \text{ của gen vi khuẩn đích (} Aa \text{ hoặc } Pg\text{)}}$$ Chu kỳ ngưỡng $C_t$ càng thấp chứng tỏ số lượng bản sao DNA vi khuẩn ban đầu trong mẫu dịch lợi càng cao.

4. Đặc điểm tiêu xương ổ răng chủ yếu của nhóm bệnh nhân nghiên cứu tại thời điểm ban đầu là gì?

Trên phim chụp toàn cảnh Panorex kỹ thuật số tại thời điểm $T_0$, hình thái tiêu xương ngang chiếm đa số với tỷ lệ 78,6%; tiêu xương chéo chiếm 12,9% và dạng tổn thương tiêu xương kết hợp cả ngang và chéo chiếm 8,6%.

---

Kết luận

Công trình nghiên cứu đã thiết lập và áp dụng quy trình Realtime PCR sử dụng đầu dò TaqMan probe để định lượng vi khuẩn Actinobacillus actinomycetemcomitans và Porphyromonas gingivalis từ dịch khe lợi của 70 bệnh nhân viêm quanh răng mạn tính dạng toàn thể. Nghiên cứu cung cấp dữ liệu về tình trạng tổn thương lâm sàng, X-quang ban đầu (chỉ số PLI 2,67; GI 2,37; PPD 5,78 mm; CAL 5,73 mm và 78,6% tiêu xương ngang). Kết quả của luận án đóng góp cơ sở dữ liệu quan trọng trong việc kết hợp chẩn đoán cận lâm sàng phân tử với đánh giá hiệu quả phác đồ điều trị không phẫu thuật bệnh viêm quanh răng tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. KHÁI NIỆM VÀ PHÂN LOẠI VIÊM QUANH RĂNG 1. Khái niệm về viêm quanh răng: VQR là viêm các mô nâng đỡ quanh răng do vi khuẩn hay nhóm vi khuẩn đặc hiệu, làm phá hủy dây chằng quanh răng và xương ổ răng tạo thành túi quanh răng hoặc gây tụt lợi hay cả hai triệu chứng trên [1]. Phân loại viêm quanh răng: Theo phân loại của Hội nghị quốc tế về bệnh viêm quanh răng tại Mỹ năm 1999 [1], [8].

Các bệnh viêm lợi (do mảng bám răng, không do mảng bám răng) II. Viêm quanh răng thể mạn tính (khu trú, toàn thể) III. Viêm quanh răng thể tấn công (khu trú, toàn thể) III. Viêm quanh răng là biểu hiện của bệnh toàn thân (liên quan rối loạn về huyết học, liên quan với rối loạn di truyền, liên quan với các rối loạn bệnh lý khác) V.

Bệnh quanh răng hoại tử (viêm lợi hoại tử lở loét, viêm quanh răng hoại tử lở loét) VI. Áp xe mô quanh răng (áp xe lợi, áp xe quanh răng, áp xe quanh thân răng) VII. Viêm quanh răng liên quan tổn thương nội nha VIII. Các dị dạng mắc phải (các yếu tố tạo thuận lợi sự hình thành mảng bám răng, các biến dạng lợi-niêm mạc quanh răng, các biến dạng niêm mạc sóng hàm, chấn thương khớp cắn).

5 Phân loại mới này đã sử dụng thuật ngữ “VQR mạn tính” thay thế “VQR ở người trưởng thành”, và đã hợp nhất tất cả các thể nặng của VQR thành một nhóm là “VQR tiến triển” mà trước đó được gọi là “VQR thanh thiếu niên”, “VQR phá hủy tiến triển”, “VQR sớm” (EOP), “VQR tiến triển nhanh” (RPP) [1], [8]. Viêm quanh răng mạn tính: Lâm sàng [1],[8]:  VQR mãn tính là thể thường gặp nhất trong bệnh VQR.  Đa số bệnh nhân ở độ tuổi ≥ 35, nhưng cũng có thể xảy ra ở người trẻ tuổi hơn.  Có sự tích tụ mảng bám và vôi răng.

 VQR mãn tính có đặc trưng là bệnh tiến triển chậm. Tuy nhiên, có thể có những đợt ngắn bệnh tiến triển nhanh do yếu tố tại chỗ (hút thuốc lá,.), yếu tố toàn thân (đái tháo đường, HIV, stress,. Do vậy, không nên chỉ dựa vào tốc độ tiến triển của bệnh để loại bỏ chẩn đoán VQR mạn tính cho những trường hợp này. Phân loại: Viêm VQR mãn tính có hai dạng: - Dạng khu trú: khi tổn thương hiện diện ≤ 30% các răng trên cung hàm.

- Dạng toàn thể: khi tổn thương hiện diện > 30% các răng trên cung hàm. Mức độ VQR được đánh giá dựa trên mức độ mất bám dính lâm sàng (CAL): - Mức độ nhẹ: mất bám dính 1-2 mm. - Mức độ trung bình: mất bám dính 3-4 mm. - Mức độ nặng: mất bám dính ≥ 5mm.

Viêm quanh răng tiến triển [1], [8] Lâm sàng: Là một thể đặc biệt của VQR với các đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng điển hình như: mất bám dính và tiêu xương nhanh, bệnh có thể có tính chất gia đình. Phân loại: Bệnh chia làm 2 dạng: - Dạng khu trú: bắt đầu ở tuổi dậy thì, chỉ ở răng cối lớn thứ nhất và răng cửa, ảnh hưởng ít nhất 2 răng, nồng độ kháng thể kháng vi khuẩn gây bệnh cao trong huyết thanh. - Dạng toàn thể: bệnh nhân thường dưới 30 tuổi (đôi khi lớn tuổi hơn), bị phá hủy mô quanh răng toàn hàm, ảnh hưởng ít nhất 3 răng (ngoài răng hàm lớn thứ nhất, răng cửa), tiến triển từng đợt, nồng độ kháng thể kháng vi khuẩn gây bệnh trong huyết thanh thấp. VI KHUẨN VÀ BỆNH SINH CỦA VIÊM QUANH RĂNG 1.

Hệ tạp khuẩn bình thường ở miệng 1. Hệ tạp khuẩn ở miệng Hệ tạp khuẩn bình thường ở vùng miệng rất đa dạng, gồm nhiều loại vi sinh vật (vi khuẩn, vi nấm, virus), trong đó vi khuẩn trội hơn hẳn [12],[13]. Có hơn 700 loài vi khuẩn có thể nuôi cấy và không nuôi cấy được hiện diện trong miệng; trong số này, hơn 400 loài được định danh từ túi quanh răng và 300 loài từ những vị trí khác trong miệng [5],[8],[9], đa số những vi khuẩn này sống cộng sinh tạo thành màng sinh học trên các bề mặt răng và niêm mạc. Tuy nhiên, người ta ước tính khoảng 50% số loài vi khuẩn trong hệ tạp khuẩn miệng hiện còn chưa biết được [8],[12-16].

Trong điều kiện sinh lý bình thường, hệ tạp khuẩn ở miệng có sự cân bằng ổn định và không có khả năng gây bệnh [17],[18]. Sự tăng sinh và xâm nhiễm của một hay một nhóm vi khuẩn là khởi điểm của VQR. Hoạt động vi 7 khuẩn gia tăng có thể do: (a) có sự xáo trộn làm mất cân bằng số lượng hoặc chất lượng tạp khuẩn miệng làm cho vi khuẩn tăng sinh, vượt quá ngưỡng và gây nhiễm khuẩn cơ hội phá hủy mô quanh răng [19]; (b) phá hủy hàng rào ngăn cản ở biểu mô quanh răng [15]; (c) xẩy ra biến cố ngẫu nhiên [8]. Hệ tạp khuẩn ở mảng bám răng VQR khởi đầu từ một mảng bám sinh học vi khuẩn được gọi là mảng bám răng [8].

Mảng bám răng là một màng sinh học, thường không màu, phát triển tự nhiên trên bề mặt răng. Mảng bám răng được tạo thành từ các vi khuẩn và chất nền (gồm các protein, polysaccarid và lipid) bám dính trên bề mặt răng. Trong mảng bám răng ở mô quanh răng bình thường, hiện diện chủ yếu các cầu khuẩn Gram (+) kỵ khí tùy nghi như Streptococcus và Actinomyces. Các cầu khuẩn hay trực khuẩn Gram (-) cũng thường thấy nhưng tỉ lệ thấp hơn nhiều so với vi khuẩn Gram (+) [8].

Mảng bám răng bắt đầu sự khoáng hóa trong 48 giờ. Trong khoảng 10 ngày, mảng bám răng sẽ trở thành vôi răng cứng và khó lấy đi. Mảng bám dưới lợi phát triển từ mảng bám trên lợi tiến về phía chóp chân răng [7]. Mảng bám răng gây sâu răng, viêm lợi, viêm quanh răng; có thể dẫn đến tiêu xương và mất răng [8].

Vi khuẩn trong bệnh viêm quanh răng Nhiều bằng chứng cho thấy tác nhân gây VQR là vi khuẩn. Số loài vi khuẩn gây VQR tương đối ít, khoảng 10-20 loài có thể giữ vai trò chính trong bệnh sinh của VQR (bảng 1. Các vi khuẩn thường gặp trong viêm quanh răng Vi khuẩn Gram (+) Vi khuẩn Gram (-) Actinomyces viscosus A. actinomycetemcomitans Hiếu khí và Actinomyces naeslundii Eikenella corrodens kỵ khí tùy nghi Streptococcus intermedia Treponema denticola Peptostreptococcus Fusobacterium nucleatum anaerobius Porphyromonas gingivalis Kỵ khí tuyệt đối Peptostreptococcus micros Prevotella intermedia Tannerella forsythus Campylobacter rectus Eubacterium Đặc điểm vi khuẩn học trong VQR: - Bệnh căn đa khuẩn, không do một loài vi khuẩn duy nhất [18].

Các vi khuẩn gây VQR đa dạng: hiếu khí/kỵ khí, Gram (-)/Gram (+), trực khuẩn/cầu khuẩn/xoắn khuẩn. Vi khuẩn thường gặp gây VQR gồm: P. - Mỗi mẫu bệnh phẩm có khoảng 2-6 loài vi khuẩn [19],[20],[21] có sự kết hợp vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí, các vi khuẩn phối hợp tác động [15]. - Vi khuẩn kỵ khí Gram (-) chiếm ưu thế.

Có sự chuyển đổi vi khuẩn trong mô lành khi chuyển sang viêm lợi và VQR, (bảng 1. + Viêm lợi: tăng sinh quá mức vi khuẩn Gram (+). Tuy nhiên, một số nghiên cứu cho rằng sự tăng các vi khuẩn Gram (-) mới là tác nhân chính. Những vi khuẩn gây viêm lợi trên thực nghiệm là Actinomyces, 9 Streptococcus, Veillonella, Fusobacterium, Treponema; ngoài ra, có thể gặp Prevotella intermedia và Campylobacter trong viêm lợi mạn tính.

+ Viêm quanh răng: Nhóm vi khuẩn kỵ khí Gram (-) nổi trội, nhất là P. Vi khuẩn ở mô lợi lành, viêm lợi và viêm quanh răng (%) [22] Vi khuẩn Mô lợi lành Viêm lợi Viêm quanh răng Hiếu khí 75% 50% 10% Kỵ khí 25% 50% 90% Gram (+) 85% 56% 25% Gram (-) 15% 44% 75% - Vi khuẩn khác nhau tồn tại trong mỗi loại bệnh VQR khác nhau [16]. VQR mạn tính liên quan với P. Rectus [9],[17], VQR tiến triển liên quan chủ yếu với A.

Actinomycetemcomitans, có kết hợp loài khác như Eubacterium, VQR tiến triển toàn thể thường gặp những trực khuẩn kỵ khí Gram (-) bao gồm P. Một số nghiên cứu cho thấy số lượng P. denticola trong VQR tiến triển cao hơn có ý nghĩa so với nhóm chứng và cao nhất trong VQR tiến triển dạng toàn thể [8],[9]. Nguyên nhân gây VQR là do vi khuẩn đã được chấp nhận, nhưng loại vi khuẩn đặc trưng ở mỗi loại bệnh VQR cho đến nay vẫn chưa được nhất trí.

Điều này thể hiện ở hai giả thuyết mảng bám răng không đặc hiệu và mảng bám răng đặc hiệu [19]. Theo giả thuyết mảng bám răng không đặc hiệu, nguyên nhân gây bệnh VQR là sự tích tụ của vi khuẩn trong mảng bám răng, số lượng mảng bám răng càng nhiều thì bệnh càng nặng. Bất kỳ loài vi khuẩn nào cũng có khả 10 năng gây bệnh khi sự tăng sinh vượt quá mức ngưỡng bảo vệ của cơ thể [8]. Thành phần mảng bám răng giống nhau ở tất cả bệnh nhân và ở mọi vị trí của răng [16].

Bằng chứng là những nghiên cứu viêm lợi thực nghiệm cho thấy viêm lợi xuất hiện khi không vệ sinh răng miệng, làm sạch mảng bám răng thì hết viêm lợi. Cho đến đầu những năm 1970, việc điều trị VQR dựa vào giả thuyết mảng bám không đặc hiệu nhằm làm giảm lượng mảng bám [16]. Sau này, thuyết mảng bám răng đặc hiệu cho rằng sự hiện diện của một số loại vi khuẩn đặc hiệu là nguyên nhân gây VQR và mỗi loại vi khuẩn khác nhau gây ra các thể VQR khác nhau [9],[17],[18]. Có sự khác nhau về các loài vi khuẩn trong mảng bám răng giữa VQR, viêm lợi và ở mô quanh răng lành (bảng 1.2) [23]; cũng như giữa VQR mạn tính với VQR tiến triển (bảng 1.

Vi khuẩn trong viêm quanh răng Viêm quanh răng mạn tính Viêm quanh răng tiến triển Porphyromonas gingivalis Prevotella intermedia Tannerella forsythensis Porphyromonas gingivalis Treponema denticola Tannerella forsythensis Eikenella corrodens Actinobacillus Peptostreptococcus micros actinomycetemcomitans Campylobacter rectus Eikenella corrodens Actinobacillus Campylobacter rectus actinomycetemcomitans Fusobacterium spp. 11 Mặc dù một số loài vi khuẩn trong từng loại bệnh quanh răng đã được biết, nhưng khó xác định vi khuẩn (hay nhóm vi khuẩn) nào là chủ chốt ở mỗi bệnh nhân. (2002) kết luận không thể phân biệt VQR mạn tính với VQR tiến triển dựa trên sự hiện diện hay không hiện diện A. Cho đến nay vẫn chưa có bằng chứng trực tiếp để kết luận vi khuẩn nào khởi phát sự tạo thành túi quanh răng, mặc dù phát hiện các trực khuẩn Gram (-) và xoắn khuẩn chiếm ưu thế ở đáy túi quanh răng (trên kính hiển vi điện tử quét và kỹ thuật lai tại chỗ phát huỳnh quang) [8].

 Tỉ lệ các loại vi khuẩn trong viêm quanh răng: Trong VQR nói chung và VQR mạn tính, VQR tiến triển, T. nucleatum là những vi khuẩn thường gặp với tỉ lệ cao [10],[22]. Tỉ lệ các loài vi khuẩn thay đổi nhiều giữa các nghiên cứu tùy theo kỹ thuật phát hiện.