Đánh Giá Hoạt Tính Sinh Học Của Dịch Chiết Nấm Linh Chi (Ganoderma Lucidum) Tại Huyện A Lưới

Nấm Linh Chi (Ganoderma lucidum), hay còn gọi là Tiên thảo, là một dược liệu quý đã được ghi nhận trong y học cổ truyền và hiện đại. 68 trang.

• Đề tài: Đánh Giá Hoạt Tính Sinh Học Của Dịch Chiết Nấm Linh Chi (Ganoderma Lucidum) Tại Huyện A Lưới

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
• ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Đại cương về nấm
• 1.1.1. Hình dạng đại thể của nấm
• 1.1.2. Cấu tạo của tế bào nấm
• 1.1.3. Hình thức sinh sản
• 1.1.4. Phân bố và nguồn gốc
• 1.2. Tổng quan về nấm Linh chi
• 1.2.1. Giới thiệu về nấm Linh chi
• 1.2.2. Đặc điểm sinh học
• 1.2.3. Thành phần hóa học và các hợp chất có trong nấm Linh chi
• 1.2.4. Các tác dụng quan trọng của nấm Linh chi trong y dược học
• 1.2.5. Các sản phẩm từ nấm Linh chi
• 1.3. Nghiên cứu trong và ngoài nước
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Nguyên vật liệu và thiết bị
• 2.2.1. Nguyên liệu và hóa chất
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Quy trình thu cao chiết nước từ nấm Linh chi
• 2.3.2. Khảo sát hàm lượng một số hợp chất có trong cắn dịch chiết
• 2.3.3. Khảo sát một số hoạt tính sinh học có trong cắn dịch chiết
• 2.4. Phương pháp xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Thu cao chiết nước từ nấm Linh chi
• 3.2. Kết quả khảo sát hàm lượng một số hoạt chất có trong cắn dịch chiết nấm Linh chi
• 3.2.1. Hàm lượng polysaccharide tổng số
• 3.2.2. Hàm lượng saponin tổng số
• 3.2.3. Hàm lượng phenolic tổng số
• 3.3. Đánh giá một số hoạt tính sinh học
• 3.3.1. Khả năng hấp thụ gốc tự do DPPH
• 3.3.2. Làm giảm lực khử của iron (III) chloride
• 3.3.3. Khả năng ức chế sinh trưởng của vi sinh vật
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ

Tóm tắt

I. Khám Phá Tiềm Năng Y Học Của Nấm Linh Chi Huyện A Lưới

Nấm Linh Chi (Ganoderma lucidum), hay còn gọi là Tiên thảo, là một dược liệu quý đã được ghi nhận trong y học cổ truyền và hiện đại. Tại Việt Nam, với điều kiện khí hậu nhiệt đới gió mùa thuận lợi, hệ thực vật và nấm dược liệu vô cùng phong phú. Đặc biệt, huyện A Lưới (Thừa Thiên Huế) là vùng đất có hệ sinh thái đa dạng, nơi Ganoderma lucidum phát triển tự nhiên, mang trong mình những đặc tính sinh học độc đáo. Nghiên cứu của Nguyễn Phước Huyền Trang (2023) đã tập trung vào việc khai thác và đánh giá khoa học loài nấm này, nhằm cung cấp các dữ liệu xác thực về thành phần dược lý và hoạt tính sinh học của dịch chiết nấm linh chi tại địa phương. Công trình này không chỉ mở ra hướng đi mới trong việc tận dụng nguồn dược liệu bản địa mà còn góp phần nâng cao giá trị kinh tế và y tế cho nấm Linh chi Việt Nam. Việc phân tích sâu các hợp chất như polysaccharide, triterpenoid, và hợp chất phenolic từ mẫu nấm A Lưới là bước đi quan trọng để khẳng định tiềm năng y học của nấm linh chi, đặc biệt là trong các ứng dụng chống oxy hóa và kháng khuẩn. Nghiên cứu này đặt nền tảng cho việc phát triển các sản phẩm chăm sóc sức khỏe chất lượng cao, khai thác tối đa nguồn gen quý hiếm của dược liệu A Lưới.

1.1. Giới thiệu tổng quan về dược liệu Ganoderma lucidum

Nấm Linh Chi, tên khoa học là Ganoderma lucidum, thuộc họ nấm Lim (Ganodermataceae). Đây là một sinh vật nhân thực, dị dưỡng, không có chất diệp lục. Nấm thường sinh trưởng trên thân gỗ mục tại các khu rừng núi cao, đặc biệt là rừng có nhiều cây lá rộng. Từ lâu, Linh chi đã được xem là một dược liệu thượng hạng trong y học cổ truyền các nước Đông Nam Á. Các tài liệu khoa học hiện đại đã chứng minh trong nấm chứa nhiều hoạt chất quý có tác dụng tích cực đến sức khỏe con người, bao gồm hỗ trợ điều trị bệnh tim, cao huyết áp, bệnh gan, và cả ung thư. Sự quý hiếm và giá trị y học cao đã thúc đẩy nhiều nghiên cứu khoa học nấm linh chi trên toàn thế giới, nhằm khám phá sâu hơn về thành phần và cơ chế tác dụng của loại dược liệu này.

1.2. Giá trị và các thành phần dược lý chính trong nấm

Giá trị của Ganoderma lucidum extract đến từ phức hợp các hoạt chất sinh học bên trong nó. Các nghiên cứu đã xác định ba nhóm hợp chất chính tạo nên tác dụng dược lý của nấm Linh chi. Thứ nhất là polysaccharide, có vai trò quan trọng trong việc điều hòa miễn dịch và chống khối u. Thứ hai là triterpenoid, mang lại vị đắng đặc trưng cho nấm và có các tác dụng kháng viêm, bảo vệ gan, và ức chế tế bào ung thư. Thứ ba là hợp chất phenolic và flavonoid, đây là những chất có hoạt tính chống oxy hóa mạnh mẽ, giúp bảo vệ tế bào khỏi sự tấn công của các gốc tự do. Sự kết hợp của các thành phần dược lý này tạo nên một phổ tác dụng rộng, giải thích vì sao nấm Linh chi được ứng dụng trong điều trị và hỗ trợ nhiều loại bệnh khác nhau.

II. Thách Thức Trong Nghiên Cứu Khoa Học Nấm Linh Chi Vùng

Mặc dù tiềm năng y học của nấm linh chi đã được công nhận rộng rãi, việc nghiên cứu và ứng dụng chúng vẫn đối mặt với nhiều thách thức, đặc biệt là khi xem xét các mẫu nấm từ những vùng địa lý khác nhau. Một trong những vấn đề cốt lõi là sự biến thiên về hàm lượng hoạt chất. Các yếu tố như thổ nhưỡng, khí hậu, và điều kiện sinh trưởng có thể ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng dược liệu, dẫn đến sự khác biệt trong hoạt tính sinh học của dịch chiết nấm linh chi. Điều này đặt ra yêu cầu cấp thiết phải có những nghiên cứu chuyên sâu, mang tính địa phương hóa để đánh giá chính xác giá trị của nấm tại từng vùng. Nghiên cứu về dược liệu A Lưới là một ví dụ điển hình, giải quyết bài toán xác thực hiệu quả của nguồn nấm bản địa. Thách thức không chỉ nằm ở việc định lượng chính xác các hợp chất mà còn ở việc chứng minh các hoạt tính này thông qua các thử nghiệm in-vitro, chẳng hạn như hoạt tính kháng khuẩn hay hoạt tính chống oxy hóa. Việc vượt qua những rào cản này sẽ giúp xây dựng cơ sở dữ liệu khoa học tin cậy, làm tiền đề cho việc chuẩn hóa và phát triển bền vững nguồn dược liệu quý giá này.

2.1. Sự khác biệt về hoạt chất do yếu tố địa lý và thổ nhưỡng

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng nấm Linh chi được trồng hoặc thu hái ở các vùng địa lý khác nhau có thể cho ra hàm lượng hoạt chất và biological activity khác nhau đáng kể. Ví dụ, hàm lượng saponin trong nấm Linh chi A Lưới (3,77%) cao hơn so với nấm Linh chi Thượng Hoàng (2,31%) được báo cáo trong một nghiên cứu khác. Tương tự, hàm lượng polysaccharide và hợp chất phenolic cũng có sự chênh lệch. Sự khác biệt này là minh chứng rõ ràng cho thấy yếu tố vùng miền, bao gồm khí hậu và thổ nhưỡng, đóng vai trò quyết định đến chất lượng dược liệu. Do đó, không thể áp đặt kết quả nghiên cứu từ một vùng cho tất cả các nguồn nấm khác. Mỗi nguồn dược liệu cần được đánh giá độc lập để xác định chính xác giá trị và tiềm năng ứng dụng.

2.2. Nhu cầu xác thực hoạt tính sinh học của dược liệu A Lưới

Trước sự biến thiên về thành phần hóa học, nhu cầu xác thực hoạt tính sinh học của nấm Linh chi A Lưới trở nên vô cùng quan trọng. Việc chỉ dựa vào kinh nghiệm dân gian hoặc các tài liệu chung là chưa đủ. Cần có các bằng chứng khoa học cụ thể để khẳng định liệu Ganoderma lucidum extract từ vùng này có thực sự sở hữu các đặc tính quý giá như hoạt tính chống oxy hóa, hoạt tính kháng khuẩn, hay hoạt tính kháng viêm hay không. Đề tài của Nguyễn Phước Huyền Trang (2023) đã trực tiếp giải quyết vấn đề này bằng cách tiến hành các thí nghiệm bài bản, từ đó cung cấp những số liệu đầu tiên về hoạt tính của nấm Linh chi A Lưới, góp phần làm sáng tỏ giá trị thực sự của nguồn dược liệu A Lưới.

III. Phương Pháp Chiết Xuất Nấm Linh Chi Và Phân Tích Hóa Học

Để đánh giá chính xác hoạt tính sinh học của dịch chiết nấm linh chi, bước đầu tiên và quan trọng nhất là xây dựng một quy trình chiết xuất và phân tích chuẩn hóa. Nghiên cứu tại A Lưới đã áp dụng các phương pháp chiết xuất nấm linh chi hiện đại, đảm bảo thu được lượng hoạt chất tối ưu và giữ nguyên được đặc tính sinh học của chúng. Việc lựa chọn dung môi chiết xuất là nước cất và kiểm soát nhiệt độ ở 80°C trong 7 giờ cho thấy sự cân nhắc kỹ lưỡng để tối ưu hóa việc hòa tan các hợp chất phân cực như polysaccharide mà không làm phân hủy các thành phần nhạy cảm với nhiệt. Sau quá trình chiết xuất, việc phân tích thành phần hóa học được tiến hành bằng các phương pháp quang phổ uy tín. Những phương pháp này không chỉ cho phép định lượng tổng số các nhóm chất quan trọng như hợp chất phenolic, saponin, và polysaccharide mà còn là cơ sở để so sánh chất lượng dược liệu giữa các mẫu khác nhau. Quy trình khoa học này đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy của các kết quả nghiên cứu, tạo tiền đề vững chắc cho các bước đánh giá hoạt tính sinh học tiếp theo.

3.1. Quy trình thu nhận cao chiết nước từ Ganoderma lucidum

Quy trình được bắt đầu với 38,13 gam mẫu nấm Linh chi tươi thu hái tại huyện A Lưới. Mẫu được xử lý và tiến hành chiết bằng dung môi chiết xuất là nước cất. Quá trình chiết được thực hiện ở nhiệt độ 80°C trong vòng 7 giờ. Sau khi hoàn tất, dịch chiết được cô đặc để loại bỏ dung môi, thu được 3,5 gam cao chiết khô. Hiệu suất chiết này là một thông số quan trọng, phản ánh phần nào hàm lượng các chất tan trong mẫu dược liệu. Cao chiết thu được chính là nguyên liệu chính được sử dụng cho tất cả các bước phân tích thành phần hóa học và thử nghiệm hoạt tính sinh học sau đó. Phương pháp này được lựa chọn vì tính an toàn, hiệu quả và phù hợp với việc tách các hợp chất có hoạt tính mong muốn.

3.2. Định lượng các hợp chất phenolic polysaccharide saponin

Việc định lượng các nhóm hoạt chất chính được thực hiện bằng các phương pháp chuẩn. Hàm lượng polysaccharide tổng số được xác định bằng phương pháp phenol-sulfuric acid. Hàm lượng saponin tổng số, một dạng của triterpenoid, được khảo sát bằng phương pháp vanillin-sulfuric acid, sử dụng oleanolic acid làm chất chuẩn. Cuối cùng, hàm lượng hợp chất phenolic tổng số được đo bằng thuốc thử Folin–Ciocalteu, với đường chuẩn là acid gallic. Các phương pháp này đều dựa trên nguyên tắc đo màu quang phổ, cho kết quả nhanh chóng và có độ chính xác cao, là công cụ không thể thiếu trong các nghiên cứu khoa học nấm linh chi hiện đại.

IV. Bí Quyết Đánh Giá Hoạt Tính Chống Oxy Hóa Và Kháng Khuẩn

Sau khi xác định thành phần hóa học, bước tiếp theo là kiểm chứng hoạt tính sinh học của dịch chiết. Đây là giai đoạn quyết định để khẳng định giá trị y học của dược liệu. Nghiên cứu đã tập trung vào hai hoạt tính quan trọng nhất: hoạt tính chống oxy hóa và hoạt tính kháng khuẩn. Để đánh giá khả năng chống oxy hóa, hai phương pháp phổ biến đã được sử dụng là thử nghiệm bắt gốc tự do DPPH và thử nghiệm đo năng lực khử sắt (reducing power assay). Các phương pháp này cung cấp cái nhìn toàn diện về khả năng của dịch chiết trong việc vô hiệu hóa các gốc tự do gây hại. Đối với hoạt tính kháng khuẩn, phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch được áp dụng để kiểm tra khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn Escherichia coli DH5α, một chủng vi khuẩn phổ biến. Việc lựa chọn các phương pháp đánh giá chuẩn xác và phù hợp là bí quyết để có được những kết quả đáng tin cậy, phản ánh đúng biological activity của Ganoderma lucidum extract, từ đó cung cấp bằng chứng khoa học vững chắc cho các ứng dụng tiềm năng.

4.1. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa qua phương pháp DPPH

Antioxidant activity là một trong những đặc tính được quan tâm nhất của nấm Linh chi. Phương pháp DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) được sử dụng để đánh giá khả năng dập tắt gốc tự do của dịch chiết. DPPH là một gốc tự do bền, có màu tím đậm. Khi phản ứng với một chất chống oxy hóa, nó sẽ bị khử và mất màu. Sự thay đổi màu sắc này, được đo bằng máy quang phổ ở bước sóng 517 nm, tỷ lệ thuận với khả năng chống oxy hóa của mẫu thử. Trong nghiên cứu này, dịch chiết nấm Linh chi A Lưới đã cho thấy khả năng làm giảm màu của dung dịch DPPH, chứng tỏ sự hiện diện của các hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa mạnh mẽ, điển hình là các hợp chất phenolic đã được định lượng trước đó.

4.2. Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn với vi khuẩn E. coli DH5α

Để khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, nghiên cứu đã sử dụng phương pháp đục lỗ thạch. Môi trường nuôi cấy được cấy trải đều chủng vi khuẩn thử nghiệm là Escherichia coli DH5α. Các lỗ nhỏ được tạo trên bề mặt thạch và dịch chiết nấm Linh chi ở các nồng độ khác nhau (30, 40, 50 mg/mL) được cho vào. Sau thời gian ủ ở 37°C trong 24 giờ, đường kính của vòng vô khuẩn (vùng không có vi khuẩn phát triển) xung quanh các lỗ được đo lường. Sự xuất hiện của vòng vô khuẩn chứng tỏ dịch chiết có khả năng ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn. Kết quả này bước đầu cho thấy Ganoderma lucidum extract từ A Lưới có tiềm năng trong việc chống lại các tác nhân gây bệnh, mở ra hướng nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính kháng nấm và các phổ kháng khuẩn khác.

V. Kết Quả Bất Ngờ Về Hoạt Tính Sinh Học Của Dịch Chiết

Kết quả từ nghiên cứu đã mang lại những phát hiện đáng chú ý, khẳng định giá trị vượt trội của nấm Linh chi thu hái tại huyện A Lưới. Phân tích định lượng cho thấy hàm lượng các thành phần dược lý quan trọng trong mẫu nấm này ở mức rất cao. Cụ thể, hàm lượng polysaccharide tổng số đạt 22,61%, saponin tổng số là 3,77%, và hàm lượng hợp chất phenolic tổng số lên tới 187,4 mg GA/g dịch chiết. Những con số này không chỉ tương đương mà thậm chí còn cao hơn so với nhiều báo cáo về nấm Linh chi và các dược liệu nổi tiếng khác như nhân sâm hay đẳng sâm. Sự dồi dào của các hoạt chất này là cơ sở khoa học giải thích cho hoạt tính sinh học của dịch chiết nấm linh chi A Lưới. Các thử nghiệm hoạt tính đã cung cấp bằng chứng thực nghiệm rõ ràng. Dịch chiết cho thấy hoạt tính chống oxy hóa mạnh mẽ thông qua khả năng khử gốc tự do DPPH và năng lực khử sắt. Đồng thời, nó cũng thể hiện hoạt tính kháng khuẩn, ức chế sự phát triển của vi khuẩn E. coli. Những kết quả này là một sự khẳng định mạnh mẽ về tiềm năng y học của nấm linh chi bản địa.

5.1. Hàm lượng cao các thành phần dược lý trong mẫu nghiên cứu

Kết quả phân tích cho thấy hàm lượng polysaccharide trong nấm Linh chi A Lưới (22,61%) cao hơn đáng kể so với nấm Linh chi Thượng Hoàng (10,70%) và củ đẳng sâm (21,59%). Tương tự, hàm lượng saponin (3,77%) cũng vượt trội so với sâm Trung Quốc (1,99%) và sâm Nhật Bản (2,22%). Đặc biệt, hàm lượng hợp chất phenolic (187,4 mg GA/g) cao gần gấp 10 lần so với nhân sâm (19,56 mg GA/g). Sự khác biệt này chứng tỏ mẫu nấm thu hái tại A Lưới có chất lượng dược liệu rất cao, là nguồn cung cấp dồi dào các hoạt chất có lợi cho sức khỏe. Đây là một cơ sở dữ liệu khoa học quan trọng cho việc phát triển và thương mại hóa sản phẩm từ nguồn dược liệu này.

5.2. Bằng chứng về khả năng chống gốc tự do và ức chế vi sinh vật

Các kết quả thử nghiệm biological activity đã xác nhận mối tương quan giữa thành phần hóa học và tác dụng sinh học. Hàm lượng phenolic cao là nguyên nhân chính dẫn đến antioxidant activity mạnh mẽ, thể hiện qua khả năng bắt giữ gốc tự do DPPH hiệu quả. Biểu đồ trong nghiên cứu cho thấy phần trăm hấp thụ gốc DPPH tăng lên theo nồng độ dịch chiết, chứng tỏ một mối quan hệ liều lượng-đáp ứng rõ ràng. Bên cạnh đó, khả năng tạo vòng vô khuẩn khi thử nghiệm với E. coli đã cung cấp bằng chứng ban đầu về hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết. Những phát hiện này không chỉ mang ý nghĩa học thuật mà còn mở ra tiềm năng ứng dụng thực tiễn trong ngành dược phẩm và thực phẩm chức năng.

VI. Tương Lai Và Ứng Dụng Tiềm Năng Y Học Của Nấm Linh Chi

Những kết quả thu được từ nghiên cứu hoạt tính sinh học của dịch chiết nấm linh chi A Lưới mở ra một chương mới đầy hứa hẹn. Việc xác định được hàm lượng hoạt chất cao cùng các hoạt tính sinh học đáng chú ý đã cung cấp một nền tảng khoa học vững chắc để khai thác và phát triển bền vững nguồn dược liệu quý giá này. Trong tương lai, Ganoderma lucidum extract từ A Lưới có thể được nghiên cứu sâu hơn để phát triển thành các sản phẩm hỗ trợ điều trị, thực phẩm chức năng, và dược mỹ phẩm. Tiềm năng ứng dụng là rất lớn, từ việc tăng cường hệ miễn dịch, bảo vệ gan, hỗ trợ điều trị ung thư, đến việc chống lão hóa và kháng viêm. Để hiện thực hóa tiềm năng y học của nấm linh chi, các nghiên cứu khoa học nấm linh chi tiếp theo cần tập trung vào việc phân lập và xác định cấu trúc của từng hoạt chất cụ thể. Đồng thời, cần tiến hành thêm các nghiên cứu về độc tính tế bào để đảm bảo an toàn và các thử nghiệm trên mô hình động vật để đánh giá hiệu quả một cách toàn diện hơn.

6.1. Hướng phát triển các sản phẩm dược liệu từ nấm A Lưới

Dựa trên các bằng chứng về hoạt tính chống oxy hóa và hoạt tính kháng khuẩn, nấm Linh chi A Lưới có thể được phát triển thành nhiều dòng sản phẩm. Các sản phẩm dạng trà, viên nang, hoặc cao lỏng có thể được tiêu chuẩn hóa dựa trên hàm lượng polysaccharide hoặc hợp chất phenolic để hỗ trợ tăng cường sức đề kháng và chống lão hóa. Ngoài ra, các hoạt chất có hoạt tính kháng viêm và kháng khuẩn có thể được chiết xuất tinh khiết để ứng dụng trong các sản phẩm chăm sóc da, hỗ trợ điều trị mụn và các bệnh viêm da. Việc xây dựng một quy trình nuôi trồng và thu hái bền vững tại A Lưới sẽ là yếu tố then chốt để đảm bảo nguồn cung ổn định và chất lượng cho ngành công nghiệp dược phẩm.

6.2. Khuyến nghị cho các nghiên cứu khoa học nấm linh chi tiếp theo

Để khai thác triệt để giá trị của nấm Linh chi A Lưới, các nghiên cứu trong tương lai nên được mở rộng. Thứ nhất, cần thực hiện các nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính kháng nấm, hoạt tính kháng viêm, và khả năng ức chế các dòng tế bào ung thư đặc hiệu. Thứ hai, việc sử dụng các kỹ thuật sắc ký hiện đại để phân lập và nhận dạng các hợp chất triterpenoid và flavonoid riêng lẻ sẽ giúp xác định chính xác hoạt chất nào đóng vai trò chính cho từng tác dụng sinh học. Cuối cùng, các nghiên cứu về độc tính tế bào và thử nghiệm lâm sàng là cần thiết trước khi đưa sản phẩm ra thị trường, nhằm đảm bảo an toàn và hiệu quả tối đa cho người tiêu dùng.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa với độ ẩm cao và lượng mưa dồi dào, tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của hệ thực vật và nấm học đa dạng, bao gồm nhiều loại nấm ăn và nấm dược liệu quý hiếm. Trong số đó, nấm Linh chi (Ganoderma lucidum), thuộc họ nấm Lim (Ganodermataceae), là một dược liệu cổ truyền quý giá được biết đến với nhiều tên gọi như Tiên thảo, Nấm trường thảo hay Vạn niên nhung. Loài nấm này phân bố chủ yếu ở các vùng rừng núi cao, đặc biệt là các khu rừng cây lá rộng tại các nước Đông Nam Á.

Các nghiên cứu sinh hóa và dược lý hiện đại đã chỉ ra rằng thể quả nấm Linh chi tích tụ nhiều nhóm hoạt chất thứ cấp có giá trị sinh học cao, hỗ trợ điều trị và phòng ngừa nhiều bệnh lý mãn tính như bệnh tim mạch, cao huyết áp, viêm gan, tiểu đường và ung thư. Tuy nhiên, hàm lượng hoạt chất sinh học và hiệu lực tác dụng của dược liệu phụ thuộc chặt chẽ vào nguồn gốc địa lý, điều kiện khí hậu, thổ nhưỡng cũng như dạng tồn tại (mọc tự nhiên hoặc nhân tạo). Mẫu nấm Linh chi sinh trưởng tự nhiên tại huyện A Lưới, tỉnh Thừa Thiên Huế – một khu vực vùng cao có đặc thù sinh thái riêng biệt – chưa được định lượng và đánh giá hoạt tính sinh học một cách có hệ thống. Do đó, việc nghiên cứu các thành phần hoạt chất cơ bản và khảo sát hoạt tính sinh học của nguồn nấm Linh chi tại địa phương này mang ý nghĩa thực tiễn quan trọng, nhằm bổ sung cơ sở dữ liệu khoa học cho nguồn dược liệu Việt Nam.

Nhiệm vụ nghiên cứu của khóa luận được cụ thể hóa thành ba mục tiêu chính:

1. Xây dựng quy trình thực nghiệm thu nhận cắn dịch chiết nước từ thể quả nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) thu hái tại huyện A Lưới, tỉnh Thừa Thiên Huế.
2. Khảo sát và định lượng hàm lượng một số nhóm hoạt chất cơ bản trong cắn dịch chiết (bao gồm polysaccharide tổng số, saponin tổng số, phenolic tổng số) và đối sánh với các công bố khoa học trên các đối tượng dược liệu khác.
3. Đánh giá bước đầu một số hoạt tính sinh học in vitro của dịch chiết nước nấm Linh chi, bao gồm hoạt tính chống oxy hóa (khả năng dập tắt gốc tự do DPPH, khả năng làm giảm lực khử ion sắt) và khả năng ức chế sinh trưởng vi sinh vật (Escherichia coli DH5α).

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Thể quả nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) thu hái tự nhiên tại địa bàn huyện A Lưới, tỉnh Thừa Thiên Huế.
• Phạm vi không gian: Thực nghiệm chiết xuất, định lượng quang phổ và thử nghiệm hoạt tính sinh học được thực hiện tại Trung tâm Sinh học Phân tử và Trung tâm Hóa học Tiên tiến thuộc Trường Y Dược, Đại học Duy Tân, thành phố Đà Nẵng.
• Phạm vi thời gian: Đề tài được hoàn thành và nghiệm thu trong năm 2023.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận được xây dựng dựa trên cơ sở lý thuyết sinh học nấm, hóa học hợp chất thiên nhiên và các mô hình thử nghiệm hoạt tính sinh học tiêu chuẩn:

1. Cơ sở lý thuyết và hóa học hợp chất tự nhiên

• Cấu trúc sinh học nấm: Thể quả và hệ sợi nấm là sinh vật nhân thực dị dưỡng. Vách tế bào nấm có cấu tạo đa lớp chứa khoảng 90% polysaccharide (chitin, glucan, mannan) liên kết với 10% protein và glycoprotein; màng tế bào cấu tạo từ lớp kép phospholipid và sterol (ergosterol, zymosterol).
• Các nhóm hoạt chất chính trong nấm Linh chi:
  • Polysaccharide (GLP): Hợp chất cao phân tử cấu tạo từ các mắt xích đường đơn (hexose, hexosamine), có vai trò điều hòa miễn dịch và chống oxy hóa.
  • Triterpenoid và Saponin: Nhóm hợp chất có khung cấu trúc steroid hoặc triterpene (như ganoderic acid A, ganoderic acid DM, lanosterol), thể hiện tính kháng viêm, ức chế enzyme và gây độc tế bào ung thư.
  • Hợp chất Phenolic: Các phân tử chứa một hoặc nhiều nhóm hydroxy gắn trực tiếp vào vòng thơm, có năng lực khử mạnh và dập tắt các gốc tự do phản ứng (ROS).

2. Phương pháp thực nghiệm chiết xuất và định lượng hóa học

• Phương pháp thu hồi cao chiết nước: Sử dụng phương pháp chiết nóng bằng nước cất ở nhiệt độ 80°C trong thời gian 7 giờ liên tục từ nguyên liệu bột nấm Linh chi đã qua xử lý khô, sau đó lọc và sấy cô đặc để thu cắn dịch chiết (cao chiết toàn phần).
• Định lượng Polysaccharide tổng số: Sử dụng phương pháp tạo màu Phenol – Acid Sulfuric đậm đặc. Glucose tinh khiết được dùng làm chất chuẩn để xây dựng đường chuẩn ở các dải nồng độ từ 0,1 đến 0,8 mg/mL. Phản ứng tạo phức màu cam-vàng được đo mật độ quang học (OD) tại bước sóng $\lambda = 490\text{ nm}$.
• Định lượng Saponin tổng số: Áp dụng phương pháp so màu Vanillin – Acid Sulfuric 72%. Phản ứng aldol hóa giữa nhóm aldehyde của vanillin với khung triterpenoid/sapogenin trong môi trường acid mạnh ở 60°C trong 15 phút sinh ra phức hợp màu tím đỏ, đo độ hấp thụ tại bước sóng $\lambda = 560\text{ nm}$. Đường chuẩn được thiết lập bằng acid oleanolic ở dải nồng độ 0,03 – 0,5 mg/mL.
• Định lượng Phenolic tổng số: Áp dụng phương pháp so màu với thuốc thử Folin – Ciocalteu (hỗn hợp acid phosphotungstic và acid phosphomolybdic) trong môi trường kiềm hóa bởi $\text{Na}_2\text{CO}_3\text{ 7,5%}$. Các nhóm phenolic khử thuốc thử tạo thành phức màu xanh lam đặc trưng, đo OD tại bước sóng $\lambda = 765\text{ nm}$ sau 30 phút ủ tối. Acid gallic (dải nồng độ 0,05 – 0,25 mg/mL) được dùng làm chuẩn đối chiếu; hàm lượng quy đổi về miligam đương lượng acid gallic trên một gam cắn dịch chiết (mg GA/g DC).

3. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học

• Hoạt tính dập tắt gốc tự do DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl): Thử nghiệm dựa trên khả năng nhường hydro của các chất chống oxy hóa trong dịch chiết nấm làm chuyển màu tím của gốc tự do DPPH sang màu vàng nhạt của dạng khử DPPH-H. Đo độ giảm hấp thụ quang học tại bước sóng $\lambda = 517\text{ nm}$. Acid ascorbic (0,2 – 1,0 mg/mL) được sử dụng làm chất đối chứng dương.
• Hoạt tính làm giảm lực khử ion sắt (Ferric Reducing Power): Đánh giá năng lực khử của dịch chiết qua phản ứng biến đổi ion $[\text{Fe}(\text{CN})_6]^{3-}$ trong kali ferricyanid thành $[\text{Fe}(\text{CN})_6]^{4-}$, phản ứng tiếp với $\text{FeCl}_3$ tạo phức Prussian blue ($\text{Fe}_4[\text{Fe}(\text{CN})_6]_3$) có màu xanh dương đậm. Hỗn hợp phản ứng được ly tâm lạnh tại 4°C với tốc độ 3.000 vòng/phút trong 20 phút và đo độ hấp thụ quang tại bước sóng $\lambda = 700\text{ nm}$.
• Hoạt tính kháng khuẩn: Sử dụng kỹ thuật khuếch tán đục lỗ thạch trên môi trường Luria Bertani (LB) agar đối với chủng vi khuẩn mô hình Escherichia coli DH5α. Dịch chiết nấm được thử nghiệm ở các nồng độ 30, 40 và 50 mg/mL; đối chứng âm là dung môi methanol, đối chứng dương là kháng sinh ampicillin (50 mg/mL); đĩa thạch được ủ ấm ở 37°C trong 24 giờ để ghi nhận vòng ức chế sinh trưởng.

4. Nguồn dữ liệu và xử lý số liệu

Tất cả phép đo quang phổ spectrophotometer được tiến hành lặp lại độc lập 3 lần để lấy giá trị trung bình $\pm$ độ lệch chuẩn. Số liệu thực nghiệm, phương trình hồi quy tuyến tính ($R^2$) và phần trăm hoạt tính được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng thuật toàn diện các cơ sở lý luận và bằng chứng thực nghiệm về nấm nói chung và nấm Linh chi nói riêng:

• Đại cương về giới nấm: Trình bày vị trí phân loại học, hình dạng đại thể sợi nấm, cấu trúc màng tế bào, đặc điểm hóa sinh của vách tế bào nấm (chứa mạng lưới glucan, chitin và mannoprotein liên kết bền vững) và các hình thức sinh sản, dinh dưỡng hoại sinh.
• Tổng quan về nấm Linh chi (Ganoderma lucidum): Phân tích các đặc điểm hình thái học, chu trình phát triển tự nhiên, vùng phân bố tại Đông Nam Á và Việt Nam. Tổng hợp các nhóm hợp chất thứ cấp chủ yếu đã được phân lập từ thể quả nấm, tập trung vào cấu trúc không gian của các chuỗi polysaccharide phân nhánh và các dẫn xuất triterpene đặc trưng như ganoderic acid A, ganoderic acid DM, lanosterol.
• Dược lý học và ứng dụng thực tiễn: Hệ thống hóa các công bố quốc tế về tác dụng chống oxy hóa, kháng khuẩn, bảo vệ gan, hạ đường huyết, ức chế tế bào ung thư và điều hòa miễn dịch; đồng thời điểm qua các dạng chế phẩm thương mại hiện hành từ nấm Linh chi.

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm, hóa chất, trang thiết bị và kỹ thuật thu nhận, phân tích mẫu:

• Mô tả đối tượng: Mẫu nấm Linh chi thu hái tại rừng huyện A Lưới, tỉnh Thừa Thiên Huế, được làm sạch, sấy khô và nghiền nhỏ.
• Quy trình chiết xuất: Thực hiện chiết hồi lưu bằng nước cất ở 80°C trong 7 giờ, thu dịch chiết và sấy bay hơi để thu cao đặc.
• Giao thức định lượng: Trình bày chi tiết từng bước chuẩn bị mẫu thử, hóa chất tinh khiết (phenol, $\text{H}_2\text{SO}_4$, vanillin, thuốc thử Folin – Ciocalteu, $\text{Na}_2\text{CO}_3$), lập các dãy nồng độ chuẩn của glucose, oleanolic acid, gallic acid và công thức tính toán hàm lượng phần trăm hoặc đương lượng hoạt chất.
• Giao thức thử nghiệm sinh học: Thiết lập quy trình pha loãng mẫu, thời gian ủ nhiệt, thông số bước sóng đo quang phổ cho các phép thử DPPH, lực khử sắt và thử nghiệm ức chế vi sinh vật trên đĩa thạch.

Chương 3: Kết quả và bàn luận

Chương này công bố các dữ liệu định lượng và thảo luận kết quả thực nghiệm đạt được:

• Hiệu suất thu hồi cao chiết nước: Từ 38,13 gam nguyên liệu nấm ban đầu qua quá trình chiết xuất ở 80°C trong 7 giờ và xử lý khô, thu nhận được 3,5 gam cắn cao chiết nấm Linh chi.
• Định lượng Polysaccharide tổng số:
  • Đường chuẩn glucose thiết lập được có dạng $y = 0,7954x + 0,1475$ với hệ số tương quan $R^2 = 0,9935$ tại bước sóng 490 nm.
  • Hàm lượng polysaccharide tổng số trong cắn dịch chiết nấm Linh chi A Lưới đạt $22,61 \pm 0,01%$.
  • Tác giả so sánh kết quả này với các công bố khoa học trên các loại dược liệu khác (Bảng 1).

STT	Dược liệu	Tên khoa học	Hàm lượng Polysaccharide tổng số (%)	Nguồn tài liệu
1	Cây Giảo cổ lam	Gynostemma pentaphyllum	$5,71 \pm 0,02$	[8]
2	Nấm Linh chi Thượng hoàng	Phellinus linteus	$10,70 \pm 0,50$	[6]
3	Cây Xuân hoa đỏ	Pseuderanthemum carruthersii	$11,63 \pm 0,38$	[9]
4	Củ Đẳng sâm	Codonopsis javanica	$21,59 \pm 0,68$	[7]
5	Nấm Linh chi (A Lưới)	Ganoderma lucidum	$\mathbf{22,61 \pm 0,01}$	Nghiên cứu này

• Định lượng Saponin tổng số:
  • Đường chuẩn oleanolic acid xác định theo phương trình $y = 1,5512x + 0,3845$ với $R^2 = 0,9936$ tại bước sóng 560 nm.
  • Hàm lượng saponin tổng số trong cắn dịch chiết đạt $3,77 \pm 0,03%$.
  • Tác giả tổng hợp đối chiếu với các nguồn mẫu sâm và dược liệu khác (Bảng 2).

STT	Dược liệu	Tên khoa học	Hàm lượng Saponin tổng số (%)	Nguồn tài liệu
1	Sâm Trung Quốc	Panax notoginseng	$1,99 \pm 0,01$	[7]
2	Cây Giảo cổ lam	Gynostemma pentaphyllum	$2,22 \pm 0,01$	[8]
3	Sâm Nhật Bản	Panax japonicus	$2,22 \pm 0,02$	[7]
4	Nấm Linh chi Thượng hoàng	Phellinus linteus	$2,31 \pm 0,21$	[6]
5	Nấm Linh chi (A Lưới)	Ganoderma lucidum	$\mathbf{3,77 \pm 0,03}$	Nghiên cứu này
6	Củ Đẳng sâm	Codonopsis javanica	$5,14 \pm 0,68$	[7]

• Định lượng Phenolic tổng số:
  • Đường chuẩn gallic acid đạt phương trình $y = 1,638x + 0,0866$ với $R^2 = 0,9961$ tại bước sóng 765 nm.
  • Hàm lượng phenolic tổng số trong cắn dịch chiết đạt $187,4 \pm 0,01\text{ mg GA/g DC}$.
  • Kết quả so sánh cho thấy hàm lượng polyphenol trong nấm Linh chi A Lưới vượt trội so với nhiều loại sâm nhưng hơi thấp hơn một ít so với nấm Linh chi Thượng hoàng (Bảng 3).

STT	Dược liệu	Tên khoa học	Hàm lượng Phenolic tổng số (mg GA/g DC)	Nguồn tài liệu
1	Nhân sâm	Panax ginseng L.	$19,56 \pm 1,26$	[48]
2	Hồng sâm đỏ	Radix Ginseng Rubra	$35,16 \pm 0,12$	[49]
3	Cây Cơm rượu	Glycosmis parviflora	$147,47 \pm 0,33$	[10]
4	Nấm Linh chi (A Lưới)	Ganoderma lucidum	$\mathbf{187,40 \pm 0,01}$	Nghiên cứu này
5	Nấm Linh chi Thượng hoàng	Phellinus linteus	$189,90 \pm 7,50$	[6]

• Khảo sát hoạt tính sinh học:
  • Khả năng hấp thụ gốc tự do DPPH: Dịch chiết nấm Linh chi thể hiện khả năng quét gốc tự do DPPH phụ thuộc nồng độ (nồng độ thử nghiệm từ 0,5 đến 2,0 mg/mL), tương quan thuận với nồng độ chất chống oxy hóa trong mẫu.
  • Năng lực làm giảm lực khử $\text{FeCl}_3$: Dịch chiết nấm Linh chi ở nồng độ 2,0 mg/mL thể hiện khả năng khử $\text{Fe}^{3+}$ thành $\text{Fe}^{2+}$ thông qua sự gia tăng mật độ quang tại bước sóng 700 nm khi tạo phức màu xanh dương Prussian blue.
  • Khả năng ức chế sinh trưởng vi sinh vật: Khảo sát trên chủng vi khuẩn mô hình Escherichia coli DH5α ở các nồng độ dịch chiết 30, 40 và 50 mg/mL bằng phương pháp đục lỗ thạch cho thấy mức độ tạo vòng kháng khuẩn tương ứng.

---

Kết quả và đóng góp

1. Kết quả định lượng chính xác

• Thiết lập quy trình chiết nóng bằng nước cất ở 80°C trong 7 giờ, thu hồi được 3,5 gam cao khô từ 38,13 gam nguyên liệu tươi ban đầu.
• Xác định cụ thể 3 chỉ số hóa thực vật chính trong cắn dịch chiết nước của nấm Linh chi thu hái tại huyện A Lưới:
  • Hàm lượng Polysaccharide tổng số: $22,61 \pm 0,01%$.
  • Hàm lượng Saponin tổng số: $3,77 \pm 0,03%$.
  • Hàm lượng Phenolic tổng số: $187,40 \pm 0,01\text{ mg GA/g DC}$.
• Chứng minh dịch chiết nước nấm Linh chi A Lưới có hoạt tính chống oxy hóa rõ rệt qua 2 cơ chế: bắt giữ gốc tự do DPPH (đo tại bước sóng 517 nm) và lực khử ion sắt $\text{Fe}^{3+}$ (đo tại bước sóng 700 nm), đồng thời ghi nhận hoạt tính ức chế sinh trưởng vi khuẩn E. coli DH5α.

2. Đóng góp khoa học của đề tài

• Cung cấp dẫn liệu thực nghiệm định lượng đầu tiên về thành phần hóa thực vật cơ bản và hoạt tính sinh học của nguồn nấm Linh chi tự nhiên tại huyện A Lưới, Thừa Thiên Huế.
• Minh chứng rằng yếu tố địa lý và điều kiện sinh thái vùng cao A Lưới tạo ra nguồn nấm Linh chi có hàm lượng polysaccharide ($22,61%$) và saponin ($3,77%$) cao hơn đáng kể khi so sánh với một số dược liệu phổ biến khác như nấm Linh chi Thượng hoàng, Giảo cổ lam và các loài Sâm.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế:
  • Nghiên cứu mới dừng lại ở việc khảo sát dịch chiết toàn phần bằng dung môi nước cất; chưa tiến hành khảo sát tối ưu hóa dung môi chiết phân cực khác (như ethanol, methanol, ethyl acetate) hoặc phương pháp chiết hỗ trợ siêu âm/vi sóng.
  • Các phép định lượng thực hiện ở mức tổng số nhóm chất thông qua phương pháp đo quang phổ UV-Vis, chưa phân lập và định danh chi tiết từng cấu tử đơn chất (chẳng hạn các loại Ganoderic acid cụ thể) bằng các kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) hay khối phổ (LC-MS).
  • Hoạt tính kháng khuẩn mới khảo sát trên một chủng vi khuẩn Gram âm mô hình trong phòng thí nghiệm (Escherichia coli DH5α).
• Hướng nghiên cứu tiếp:
  • Mở rộng khảo sát hoạt tính kháng khuẩn trên các chủng vi sinh vật gây bệnh thực tế (như Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis hay vi nấm gây bệnh).
  • Nghiên cứu phân đoạn dịch chiết và tinh sạch các hợp chất triterpenoid, polysaccharide có hoạt tính cao.
  • Đánh giá sâu hơn các hoạt tính sinh học in vitro và in vivo khác như hoạt tính ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase (chống tiểu đường), độc tính tế bào ung thư và khả năng bảo vệ tế bào gan.

---

Giá trị tham khảo

• Đối tượng thụ hưởng:
  • Khóa luận là tài liệu tham khảo cho sinh viên, học viên chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Sinh học Ứng dụng, Dược học và Hóa học Hợp chất Thiên nhiên.
  • Các nhóm nghiên cứu đang thực hiện đề tài về khai thác, kiểm nghiệm và đánh giá chất lượng nguồn dược liệu nấm tại miền Trung Việt Nam.
• Phần giá trị nhất:
  • Quy trình chi tiết và thông số thực nghiệm định lượng ba nhóm hoạt chất (Polysaccharide bằng phenol-acid sulfuric, Saponin bằng vanillin-acid sulfuric, Phenolic bằng Folin-Ciocalteu).
  • Hệ thống dữ liệu so sánh định lượng đa dược liệu được đối chiếu với các công bố khoa học trong và ngoài nước.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Nguồn nấm Linh chi trong khóa luận được thu hái ở đâu và phương pháp chiết xuất là gì?

Mẫu nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) được thu hái tự nhiên tại địa bàn huyện A Lưới, tỉnh Thừa Thiên Huế. Tác giả sử dụng phương pháp chiết nóng bằng nước cất ở 80°C trong thời gian 7 giờ liên tục, từ 38,13 gam mẫu nấm ban đầu thu được 3,5 gam cắn cao chiết khô.

2. Hàm lượng polysaccharide tổng số trong cắn dịch chiết là bao nhiêu và được xác định bằng phương pháp nào?

Hàm lượng polysaccharide tổng số đạt $22,61 \pm 0,01%$. Chỉ số này được xác định bằng phương pháp so màu Phenol – Acid Sulfuric đậm đặc tại bước sóng 490 nm, dựa trên phương trình đường chuẩn glucose: $y = 0,7954x + 0,1475$ ($R^2 = 0,9935$).

3. Hàm lượng saponin tổng số và phenolic tổng số của mẫu nấm đạt mức bao nhiêu?

• Hàm lượng saponin tổng số đạt $3,77 \pm 0,03%$, định lượng bằng phương pháp Vanillin – Acid Sulfuric tại bước sóng 560 nm theo đường chuẩn acid oleanolic ($y = 1,5512x + 0,3845$).
• Hàm lượng phenolic tổng số đạt $187,40 \pm 0,01\text{ mg GA/g DC}$, định lượng bằng thuốc thử Folin – Ciocalteu tại bước sóng 765 nm theo đường chuẩn acid gallic ($y = 1,638x + 0,0866$).

4. So sánh với các dược liệu khác, hàm lượng hoạt chất của nấm Linh chi A Lưới có đặc điểm gì nổi bật?

Hàm lượng polysaccharide của nấm Linh chi A Lưới ($22,61%$) cao hơn so với nấm Linh chi Thượng hoàng ($10,70%$), Giảo cổ lam ($5,71%$) và Cây Xuân hoa đỏ ($11,63%$). Hàm lượng saponin ($3,77%$) cao hơn nấm Linh chi Thượng hoàng ($2,31%$), Sâm Trung Quốc ($1,99%$), Sâm Nhật Bản ($2,22%$). Hàm lượng polyphenol ($187,4\text{ mg GA/g DC}$) vượt trội so với Nhân sâm ($19,56\text{ mg GA/g}$) và Hồng sâm đỏ ($35,16\text{ mg GA/g}$).

5. Những hoạt tính sinh học nào đã được đánh giá trong khóa luận?

Tác giả đã đánh giá 3 hoạt tính sinh học in vitro: hoạt tính dập tắt gốc tự do DPPH (đo quang tại bước sóng 517 nm), năng lực khử ion sắt $\text{Fe}^{3+}$ trong phản ứng tạo phức Prussian blue (đo quang tại bước sóng 700 nm) và khả năng ức chế sinh trưởng của vi khuẩn mô hình Escherichia coli DH5α bằng phương pháp đục lỗ thạch ở các dải nồng độ dịch chiết 30, 40 và 50 mg/mL.

---

Kết luận

Khóa luận cử nhân của tác giả Nguyễn Phước Huyền Trang đã xây dựng thành công quy trình thu nhận cắn dịch chiết nước và định lượng chính xác ba nhóm hoạt chất cơ bản của nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) thu hái tại huyện A Lưới, Thừa Thiên Huế. Kết quả thực nghiệm xác nhận hàm lượng cao của polysaccharide ($22,61%$), saponin ($3,77%$) và phenolic tổng số ($187,40\text{ mg GA/g DC}$), đồng thời chứng minh năng lực chống oxy hóa và kháng khuẩn in vitro rõ rệt của dịch chiết. Công trình là nguồn tài liệu thực nghiệm có giá trị khoa học, góp phần khẳng định tiềm năng dược liệu của nguồn nấm Linh chi tự nhiên tại miền Trung Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam là đất nước thuộc vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, lượng mưa dồi dào và độ ẩm cao. Đây là điều kiện thuận lợi cho các loại sinh vật phát triển, tạo ra hệ thực vật rất phong phú và đa dạng bao gồm các loại thực vật bậc cao, nấm ăn và nấm dược liệu. Đến nay, mặc dù chưa có sự thống kê đầy đủ về sự đa dạng thành phần các loài nấm ở Việt Nam, tuy nhiên, các dẫn liệu khoa học đã được công bố cho thấy Việt Nam có nhiều loại nấm quý hiếm [1]. Nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) còn gọi là Tiên thảo, nấm Trường thảo, Vạn niên nhung, thuộc họ nấm Lim.

lucidum thường sinh trưởng ở nơi rừng núi cao, đặc biệt là những khu rừng có nhiều cây lá rộng, chúng được xem là một loại dược liệu quý, cây thuốc quan trọng tại các nước Đông Nam Á [2]. Trong những năm gần đây, các nhóm nghiên cứu trong và ngoài nước đã công bố nhiều kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học chính trong nấm Linh chi có các hoạt tính sinh học đáng chú ý như điều trị và hỗ trợ điều trị nhiều bệnh tật liên quan đến sức khỏe của con người: bệnh tim, cao huyết áp, bệnh gan, ung thư, tiểu đường [54]. Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu về nấm Linh chi nhưng chúng tôi nhận thấy nấm trồng ở các vùng địa lý khác nhau (mọc tự nhiên hoặc nuôi trồng) có thể có sự khác nhau về thành phần hoạt chất và hoạt tính sinh học. Do đó, chúng tôi nghiên cứu sơ bộ về định lượng các thành phần và bước đầu đánh giá một số hoạt tính sinh học từ dịch chiết nấm Linh chi (G.

lucidum), với đề tài: “Định lƣợng một số thành phần hoạt chất cơ bản và bƣớc đầu đánh giá hoạt tính sinh học có trong dịch chiết nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) thu hái ở huyện A Lƣới (Thừa Thiên Huế)” nhằm cung cấp thêm dữ liệu khoa học về hoạt tính sinh học quý của nấm Linh chi ở Việt Nam và góp phần mở rộng tiềm năng sử dụng loại dược liệu này. 1 Đề tài này gồm ba mục tiêu sau: 1. Xây dựng quy trình thu nhận cắn dịch chiết nước nấm Linh chi. Khảo sát hàm lượng một số hoạt chất có trong cắn dịch chiết và so sánh với các kết quả đã công bố.

Đánh giá một số hoạt tính sinh học của dịch chiết như: hoạt tính kháng khuẩn, chống oxy hóa. Đại cƣơng về nấm Giới nấm bao gồm các sinh vật nhân thực, không có diệp lục, không có sự phân hóa thành rễ, thân, lá, không có hoa, phần lớn không chứa cellulose trong thành tế bào và sống dị dưỡng. Nấm có một số phương thức dinh dưỡng bao gồm hoại sinh, ký sinh hay cộng sinh [2]. Hình dạng đại thể của nấm Tế bào nấm phát triển và phân nhánh tạo thành sợi nấm, sợi nấm tiếp tục phát triển và phân nhánh tạo thành hệ nấm phát triển chằng chịt trên bề mặt môi trường.

Trong sợi nấm có vách ngăn ngăn cách các tế bào nấm với nhau. Những sợi nấm này hình thành khuẩn lạc có thể nhìn thấy bằng mắt thường. Cấu tạo của tế bào nấm Cấu tạo chung của tế bào nấm tương tự như tế bào động vật, có màng tế bào, bào tương, các bào quan, nhân, tuy nhiên nấm có thành tế bào [2][55]. Thành tế bào Thành tế bào (cell wall): có cấu tạo nhiều lớp, 90% là polysaccharide gồm các loại hexose và hexosamine polymers như chitin, glucan, mannan, v., 10% là các protein và glycoprotein.

Thành tế bào làm nhiệm vụ đảm bảo hình dạng, độ cứng, sự vững chắc và bảo vệ tế bào nấm chống lại áp lực thẩm thấu. Ngoài ra thành tế bào có tính kháng nguyên [2]. Màng tế bào Màng tế bào: cấu tạo hai lớp, thành phần có phospholipids và sterols (ergosterol, zymosterol). Màng có chức năng bảo vệ bào tương, điều hoà hoạt động bài tiết và hấp thu những chất hoà tan, tạo điều kiện thuận lợi cho việc tổng hợp bao vỏ, thành tế bào [2].

Dãy chuẩn dung dịch glucose ở các nồng độ (0,1 - 0,8 mg/mL). Nồng độ (mg/mL) 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 Vglucose (mL) 0,02 0,04 0,08 0,12 0,16 Vnước cất (mL) 9,98 9,96 9,92 9,88 9,84 - Mẫu dịch chiết (2,0 mg/mL): Cân chính xác 0,2 gam cao chiết cho vào bình định mức 100 mL, thêm nước cất vừa đủ 100 mL, lắc đều. Tiến hành - Bước 1: Mẫu thử: Lấy 1,5 mL glucose ở các nồng độ (0,1 - 0,8 mg/mL) + 1 ml phenol 5% đã pha ở trên + 3 mL acid sulfuric đậm đặc. + Mẫu trắng: Lấy 1,5 mL nước cất + 1mL dung dịch phenol 5% đã pha ở trên + 3 mL acid sulfuric đậm đặc.

- Bước 2: Trộn đều và ủ trong tối 30 phút. - Bước 3: Đo mật độ quang học ở bước sóng 490 nm. Kết quả đo quang được thực hiện 3 lần và lấy giá trị trung bình. - Bước 4: Tương tự tiến hành với mẫu DC: Lấy 1,5 mL dịch chiết ở nồng độ 2 mg/mL + 1mL phenol 5% + 3 mL acid sulfuric đậm đặc [5].

- Hàm lượng polysaccharide tổng số được tính theo công thức: Trong đó: G: hàm lượng polysaccharide (%). C1: nồng độ polysaccharide chứa trong mẫu (mg/mL). C: nồng độ mẫu bột cao chiết (mg/mL) [5]. Khảo sát hàm lượng saponin tổng số Hàm lượng saponin tổng số được khảo sát theo phương pháp vanillin-sulfuric acid theo Anh Le và cộng sự (2018) [40].

Nguyên tắc Trong điều kiện acid, quá trình aldol hóa xảy ra giữa các sapogenin thu được bằng thủy phân saponin trong dịch chiết và nhóm aldehyde trong vanillin. Các sapogenin steroid có hoặc không có liên kết đôi ở C-5, các sapogenin triterpenoid, 21 sterol có nhóm OH ở vị trí C-3 của chúng phản ứng với vanillin trong môi trường axit để tạo ra phức hợp màu tím đỏ có độ hấp thụ cực đại ở 473 đến 560 nm [41]. Chuẩn bị các dung dịch thử - Dung dịch vanillin 8%: Cân chính xác 8 gam vanillin cho vào bình định mức 100 mL, thêm etanol vừa đủ 100 mL, lắc đều. - Dung dịch acid sulfuric 72%: Lấy 25 ml nước cất cho vào bình định mức 100 mL, thêm từ từ acid sulfuric đậm đặc vừa đủ 100 mL, lắc đều.

- Dung dịch oleanolic acid (1,5 mg/mL): Cân chính xác 0,15 gam oleanolic acid cho vào bình định mức 100 mL, thêm methanol vừa đủ 100 mL, lắc đều. - Chuẩn bị dãy chuẩn dung dịch oleanolic acid như Bảng 2. Dãy chuẩn dung dịch oleanolic acid ở các nồng độ (0,03 - 0,5 mg/mL). Nồng độ (mg/mL) 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 VOleanolic acid (mL) 0,21 0,42 0,83 1,67 3,33 VMeOH (mL) 9,79 0,58 9,17 8,33 6,67 - Mẫu dịch chiết (5,0 mg/mL): Cân chính xác 0,5 gam cao chiết cho vào bình định mức 100 mL, thêm nước cất vừa đủ 100 mL, lắc đều.

Tiến hành - Bước 1: Mẫu thử: lấy 0,75 mL oleanolic acid ở các nồng độ (0,03 -0,5 mg/mL) + 0,75 mL vanillin 8% + 3 mL acid sulfuric 72%. + Mẫu trắng: Lấy 0,75 mL methanol + 0,75 mL vanillin 8% + 3 mL acid sulfuric 72%. - Bước 2: Trộn đều và ủ trong đá 3 phút. - Bước 3: Ủ gia nhiệt ở 60⁰C trong 15 phút.

Sau đó làm lạnh nhanh trong nước 5 phút. - Bước 4: Đo mật độ quang học ở bước sóng 560 nm. Kết quả đo quang được thực hiện 3 lần và lấy giá trị trung bình. - Bước 5: Tương tự tiến hành với mẫu DC: Lấy 0,75 mL dịch chiết ở các nồng 5 mg/mL + 0,75 mL vanillin 8% + 3 mL acid sulfuric 72%.

22 + Mẫu trắng: Lấy 0,75 mL nước cất + 0,75 mL vanillin 8% + 3 mL acid sulfuric 72% [43]. - Hàm lượng saponin tổng số được tính theo công thức: Trong đó: M: Hàm lượng saponin tổng số (%). a: Nồng độ saponin chứa trong mẫu (mg/mL). b: Nồng độ mẫu bột cao chiết (mg/mL) [6].

Kháo sát hàm lượng phenolic tổng số Hàm lượng phenolic tổng số được khảo sát bằng thuốc thử Folin – Ciocalteu theo N. Siddiqui và cộng sự (2017) [42]. Nguyên tắc Các hợp chất phenolic có trong dịch chiết nấm được định lượng bằng phương pháp đo màu khi dùng với thuốc thử Folin - Ciocalteu. Thuốc thử Folin - Ciocalteu là hỗn hợp hai acid: acid phosphotungstic (H3PW12O40) và acid phosphomolybdic (H3PMo12O40), hỗn hợp acid này phản ứng với các hợp chất có nhóm hydroxy phenol trong thành phần hóa học để tạo thành các phức có màu xanh lam đặc trưng.

Sử dụng phương pháp quang phổ để xác định được hàm lượng phenolic toàn phần có trong dịch chiết [43]. Chuẩn bị dung dịch thử - Dung dịch natri cacbonat 7,5%: Cân chính xác 7,5 gam natri cacbonat cho vào bình định mức 100 mL, thêm nước cất vừa đủ 100 mL, lắc đều. - Dung dịch gallic acid (0,5 mg/mL): Cân chính xác 0,05 gam gallic acid cho vào bình định mức 100 mL, thêm nước cất vừa đủ 100 mL, lắc đều. - Chuẩn bị dãy chuẩn dung dịch gallic acid như Bảng 2.

Dãy chuẩn dung dịch gallic acid ở các nồng độ (0,05 – 0,25 mg/mL). Nồng độ (mg/mL) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 Vgallic acid (mL) 1 2 3 4 5 V nước cất (mL) 9 8 7 6 5 23 - Mẫu dịch chiết (2,0 mg/mL): Cân chính xác 0,2 gam cao chiết cho vào bình định mức 100 mL, thêm nước cất vừa đủ 100 ml, lắc đều. Cách tiến hành - Bước 1: Mẫu thử: lấy 0,5 mL gallic acid ở các nồng độ (0,05 - 0,25 mg/mL) + 2,5mL Folin – Ciocalteu + 2 mL natri cacbonat 7,5%. + Mẫu trắng: Lấy 0,5 mL nước cất + 2,5 mL Folin – Ciocalteu + 2 mL natri cacbonat 7,5%.

- Bước 2: Lắc đều và ủ trong tối 30 phút. - Bước 3: Đo mật độ quang học ở bước sóng 765 nm. Kết quả đo quang được thực hiện 3 lần và lấy giá trị trung bình. - Bước 4: Tương tự tiến hành với mẫu DC: Lấy 0,5 mL DC ở các nồng độ 2 mg/mL + 2,5 mL Folin - Ciocalteu + 2 mL natri cacbonat 7,5%.

- Hàm lượng phenolic toàn phần được tính theo công thức: Trong đó: P: Hàm lượng phenolic tổng số (mg galic acid/g dịch chiết). a: Giá trị X từ đường chuẩn của gallic acid (mg/mL). V: Thể tích dịch chiết (mL). m: khối lượng dịch chiết có trong thể tích V (g) [42].

Khảo sát một số hoạt tính sinh học có trong cắn dịch chiết 2. Khả năng chống oxy hóa Khả năng hấp thụ gốc tự do DPPH (2,2-diphenyl-1-picylhydrazyl) Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp hấp thụ gốc tự do DPPH theo M. Nguyên tắc DPPH, 2,2-diphenyl-1-picylhydrazyl, là một gốc tự do điển hình có khả năng kết cặp hay “bắt giữ” các gốc tự do khác. Công thức được thể hiện ở Hình 2.

Công thức hóa học của DPPH [45].