Đánh Giá Độ Đặc Hiệu và Giới Hạn Phát Hiện của Bộ Kit RT-qPCR TopSPEC® FMDV và EMCV

Khóa luận đánh giá tính đặc hiệu và xác định giới hạn phát hiện của bộ kit topspec® fmdv rt qpcr và topspec® emcv rt qpcr trong công nghệ sinh học.

• Tác giả: Tran Nguyen Minh Thanh
• Người hướng dẫn: Dr. Dinh Xuan Phat
• Trường học: Nong Lam University
• Chuyên ngành: Biotechnology
• Đề tài: Đánh Giá Độ Đặc Hiệu và Giới Hạn Phát Hiện của Bộ Kit RT-qPCR TopSPEC® FMDV và EMCV
• Loại tài liệu: graduation thesis
• Năm xuất bản: 2019 - 2023
• Địa điểm: Thu Duc City

Mục lục chi tiết

• ACKNOWLEDGEMENTS
• CONFIRMATION COMMITMENT
• ABSTRACT
• TÓM TẮT
• TABLE OF CONTENTS
• LIST OF ABBREVIATIONS
• LIST OF TABLES
• LIST OF FIGURES
• 1. CHƯƠNG 1: INTRODUCTION
• 1.1. Objectives
• 1.2. Contents
• 2. CHƯƠNG 2: LITERATURE REVIEW
• 2.1. Introduction to FMDV
• 2.1.1. Classification
• 2.1.2. Structure of FMDV
• 2.1.3. Geographic distribution
• 2.1.4. Susceptible species
• 2.2. Introduction to EMCV
• 3. CHƯƠNG 3: MATERIALS AND METHODS
• 3.1. Time and location of the research
• 3.2. Materials of the Test
• 3.3. Reverse transcription Real-time PCR
• 4. CHƯƠNG 4: RESULTS AND DISCUSSION
• 4.1. Evaluation of the specificity
• 4.2. Determine the limit of detection (LOD)
• 4.3. Investigate the presence of FMDV and EMCV in field samples
• 5. CHƯƠNG 5: CONCLUSION AND RECOMMENDATIONS
• APPENDIX

Tóm tắt

I. Tổng quan về Đánh Giá Độ Đặc Hiệu Bộ Kit RT qPCR TopSPEC

Đánh giá độ đặc hiệu và giới hạn phát hiện của bộ kit RT-qPCR TopSPEC® FMDV và EMCV là một nghiên cứu quan trọng trong lĩnh vực chẩn đoán bệnh. Nghiên cứu này không chỉ giúp xác định khả năng phát hiện của các bộ kit mà còn cung cấp thông tin về độ chính xác trong việc phát hiện các tác nhân gây bệnh. Việc sử dụng các bộ kit này trong chẩn đoán sẽ giúp nâng cao hiệu quả kiểm soát dịch bệnh trong ngành chăn nuôi heo.

1.1. Mục tiêu của nghiên cứu về bộ kit TopSPEC

Mục tiêu chính của nghiên cứu là đánh giá độ đặc hiệu và giới hạn phát hiện của bộ kit TopSPEC® FMDV và EMCV. Nghiên cứu sẽ cung cấp thông tin chi tiết về khả năng phát hiện các virus này trong mẫu thực địa.

1.2. Tầm quan trọng của việc đánh giá độ đặc hiệu

Đánh giá độ đặc hiệu của bộ kit RT-qPCR là rất quan trọng để đảm bảo rằng các kết quả chẩn đoán là chính xác. Điều này giúp ngăn ngừa việc chẩn đoán sai và giảm thiểu thiệt hại kinh tế cho ngành chăn nuôi.

II. Vấn đề và Thách thức trong Chẩn Đoán Bệnh

Chẩn đoán bệnh bằng phương pháp RT-qPCR gặp nhiều thách thức, đặc biệt là trong việc phát hiện các virus như FMDV và EMCV. Các vấn đề như độ nhạy, độ đặc hiệu và khả năng phát hiện trong điều kiện thực địa là những yếu tố cần được xem xét kỹ lưỡng. Việc phát hiện chính xác các virus này là rất quan trọng để kiểm soát dịch bệnh hiệu quả.

2.1. Những khó khăn trong việc phát hiện virus

Việc phát hiện virus FMDV và EMCV trong mẫu thực địa có thể gặp khó khăn do sự hiện diện của các tác nhân gây bệnh khác. Điều này đòi hỏi bộ kit phải có độ đặc hiệu cao để tránh kết quả dương tính giả.

2.2. Tác động của dịch bệnh đến ngành chăn nuôi

Dịch bệnh do FMDV và EMCV gây ra có thể dẫn đến thiệt hại kinh tế lớn cho ngành chăn nuôi. Việc phát hiện sớm và chính xác các virus này là cần thiết để giảm thiểu thiệt hại.

III. Phương Pháp Đánh Giá Độ Đặc Hiệu Bộ Kit RT qPCR

Nghiên cứu sử dụng phương pháp RT-qPCR để đánh giá độ đặc hiệu và giới hạn phát hiện của bộ kit TopSPEC®. Phương pháp này cho phép xác định chính xác số lượng bản sao virus trong mẫu và so sánh với các tiêu chuẩn đã được thiết lập. Kết quả cho thấy bộ kit có độ nhạy cao và khả năng phát hiện tốt trong các điều kiện khác nhau.

3.1. Quy trình thực hiện RT qPCR

Quy trình RT-qPCR bao gồm các bước chuẩn bị mẫu, phản ứng PCR và phân tích kết quả. Mỗi bước đều cần được thực hiện cẩn thận để đảm bảo độ chính xác của kết quả.

3.2. Đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu

Độ nhạy và độ đặc hiệu của bộ kit được đánh giá thông qua việc so sánh với các mẫu chuẩn. Kết quả cho thấy bộ kit có khả năng phát hiện virus ở nồng độ thấp.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu và Ứng Dụng Thực Tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy bộ kit TopSPEC® FMDV và EMCV có giới hạn phát hiện là 5 copies/phản ứng. Điều này cho thấy bộ kit có khả năng phát hiện virus ở nồng độ rất thấp, điều này rất quan trọng trong việc chẩn đoán sớm bệnh. Các bộ kit này đã được áp dụng thành công trong việc kiểm tra mẫu từ các trang trại heo tại miền Nam Việt Nam.

4.1. Kết quả từ mẫu thực địa

Trong nghiên cứu, 80 mẫu thực địa đã được kiểm tra và tất cả đều cho kết quả âm tính với FMDV và EMCV. Điều này cho thấy bộ kit có khả năng phát hiện chính xác các virus này.

4.2. Ứng dụng trong chẩn đoán thường quy

Bộ kit TopSPEC® FMDV và EMCV có thể được sử dụng trong chẩn đoán thường quy tại các trang trại heo, giúp nâng cao hiệu quả kiểm soát dịch bệnh.

V. Kết Luận và Tương Lai của Nghiên Cứu

Nghiên cứu đã chứng minh rằng bộ kit TopSPEC® FMDV và EMCV có độ đặc hiệu cao và giới hạn phát hiện thấp. Điều này mở ra cơ hội cho việc áp dụng rộng rãi các bộ kit này trong chẩn đoán bệnh. Tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu để cải thiện độ nhạy và độ đặc hiệu của các bộ kit, đồng thời mở rộng ứng dụng trong các lĩnh vực khác.

5.1. Đề xuất cho nghiên cứu tiếp theo

Cần thực hiện thêm các nghiên cứu để đánh giá khả năng phát hiện của bộ kit trong các điều kiện khác nhau và với các chủng virus khác nhau.

5.2. Tầm quan trọng của việc cải tiến công nghệ

Cải tiến công nghệ trong sản xuất bộ kit RT-qPCR sẽ giúp nâng cao độ chính xác và hiệu quả trong chẩn đoán bệnh, từ đó góp phần bảo vệ ngành chăn nuôi.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Ngành chăn nuôi heo đóng vai trò thiết yếu trong việc cung cấp nguồn thực phẩm và thúc đẩy tăng trưởng kinh tế tại nhiều quốc gia, đặc biệt là khu vực Đông Á, Đông Nam Á và Trung Âu. Mặc dù vậy, hoạt động chăn nuôi hiện nay phải đối mặt với nhiều rủi ro lớn từ chi phí đầu vào, an toàn sinh học và đặc biệt là áp lực dịch bệnh truyền nhiễm nguy hiểm. Trong số các tác nhân gây bệnh truyền nhiễm đường máu, hô hấp và sinh sản ở đàn heo, virus gây bệnh lở mồm long móng (Foot-and-Mouth Disease Virus - FMDV) và virus gây viêm não - viêm cơ tim (Encephalomyocarditis Virus - EMCV) là hai đối tượng gây tổn thất kinh tế nghiêm trọng.

Bệnh lở mồm long móng (FMD) là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm hàng đầu ở động vật móng guốc, đứng đầu danh sách bệnh bảng A của Tổ chức Thú y Thế giới (WOAH). FMD lây lan nhanh qua đường hô hấp và tiếp xúc, dẫn đến việc tiêu hủy hàng loạt đàn gia súc để khoanh vùng dập dịch. Tổn thất kinh tế do FMD ước tính có thể lên tới 49,8 tỷ USD trong vòng 10 năm tại các quốc gia bị ảnh hưởng, kèm theo chi phí kiểm soát và bồi thường khổng lồ. Trong khi đó, virus EMCV thuộc nhóm Cardiovirus phân bố rộng rãi, lây truyền qua chất thải hoặc xác động vật gặm nhấm (chuột), gây viêm cơ tim cấp tính và đột tử ở heo con, đồng thời gây hội chứng rối loạn sinh sản (sảy thai, thai lưu, thai gỗ) ở heo nái. Điểm đáng lưu ý trong thực tiễn lâm sàng là các tổn thương viêm cơ tim do EMCV và FMDV ở heo con có nhiều nét tương đồng (bệnh tích tim vằn hổ), gây khó khăn cho việc phân biệt bằng mắt thường hay chẩn đoán lâm sàng đơn thuần.

Phương pháp Reverse Transcription Real-time PCR (RT-qPCR) với ưu thế về độ nhạy, độ đặc hiệu cao và khả năng cho kết quả nhanh chóng là công cụ chẩn đoán phân tử tiêu chuẩn nhằm phát hiện sớm hai tác nhân này. Nhằm đánh giá chất lượng và khả năng ứng dụng thực địa của hai bộ kit chẩn đoán sản xuất thử nghiệm trong nước, đề tài khóa luận "Đánh giá độ đặc hiệu và giới hạn phát hiện của hai bộ kit thử nghiệm TopSPEC® FMDV RT-qPCR KIT và TopSPEC® EMCV RT-qPCR KIT" đã được thực hiện.

Mục tiêu và nội dung nghiên cứu cụ thể bao gồm:

1. Đánh giá độ đặc hiệu phân tích và xác định giới hạn phát hiện (Limit of Detection - LOD) của bộ kit thử nghiệm TopSPEC® EMCV RT-qPCR KIT.
2. Đánh giá độ đặc hiệu phân tích và xác định giới hạn phát hiện (LOD) của bộ kit thử nghiệm TopSPEC® FMDV RT-qPCR KIT.
3. Ứng dụng hai bộ kit thử nghiệm trên để tầm soát và phát hiện sự hiện diện của FMDV và EMCV trên các mẫu bệnh phẩm thực địa thu thập từ các trang trại chăn nuôi heo tại các tỉnh phía Nam.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Hai bộ sinh phẩm RT-qPCR thử nghiệm (TopSPEC® FMDV RT-qPCR KIT và TopSPEC® EMCV RT-qPCR KIT); các mẫu plasmid chuẩn mang đoạn gene mục tiêu của FMDV và EMCV (nồng độ ban đầu $10^6$ copies/$\mu$L); vaccine FMDV vô hoạt nhũ dầu (Cat#973483-23, Biogenesis Bago); các chủng vi sinh vật đối chứng âm chéo gồm 6 loài vi khuẩn và 3 loại virus gây bệnh phổ biến trên heo; 80 mẫu bệnh phẩm lâm sàng thực địa (gồm 58 mẫu máu và 22 mẫu mô).
• Thời gian nghiên cứu: Từ ngày 02/03/2023 đến ngày 17/07/2023.
• Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm Công nghệ Gene (BIO313), Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh; phối hợp với Phòng xét nghiệm Chẩn đoán Thú y Biomin (Chi nhánh Biomin Việt Nam tại Bình Dương, thuộc Tập đoàn DSM) trong việc cung cấp mẫu vi sinh vật kiểm chứng.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Cơ sở lý thuyết

Đề tài dựa trên các cơ sở khoa học về virus học thú y và kỹ thuật sinh học phân tử chẩn đoán:

• Đặc điểm virus FMDV: Thuộc chi Aphthovirus, họ Picornaviridae, mang bộ gene RNA sợi đơn dương dài khoảng 8.400 nucleotide, không có vỏ bọc ngoài, cấu trúc capsid đối xứng hình khối 20 mặt (kích thước 25-30 nm) tạo thành từ 60 capsomer chứa 4 protein cấu trúc (VP1, VP2, VP3, VP4). FMDV gồm 7 serotype chính (A, O, C, Asia-1, SAT1, SAT2, SAT3) không có miễn dịch chéo. Bộ gene gồm vùng 5' UTR (chứa cấu trúc IRES khởi đầu dịch mã không phụ thuộc cap, poly(C)), một khung đọc mở duy nhất (ORF) mã hóa tiền chất polyprotein phân cắt thành các protein cấu trúc (P1-2A: VP1-4) và phi cấu trúc (Lpro, P2, P3: 2B, 2C, 3A, 3B, 3Cpro, 3Dpol), cùng vùng 3' UTR. Virus xâm nhiễm tế bào đích thông qua tương tác giữa protein capsid với thụ thể integrin $\alpha_V\beta_6$.
• Đặc điểm virus EMCV: Thuộc chi Cardiovirus, họ Picornaviridae, mang bộ gene ssRNA(+) dài khoảng 7.800 base dịch mã trực tiếp tạo polyprotein gồm tiền chất P1 (VP1-4) và các protein phi cấu trúc P2, P3. EMCV gồm hai serotype (EMCV-1 và EMCV-2), gây bệnh viêm cơ tim hoại tử cấp tính qua trung gian các cytokine tiền viêm (IL-18, TNF-$\alpha$, IL-6).
• Nguyên lý kỹ thuật RT-qPCR sử dụng mẫu dò TaqMan (TaqMan Probe): Kỹ thuật kết hợp phản ứng phiên mã ngược (chuyển RNA thành cDNA) và phản ứng PCR khuếch đại định lượng. Mẫu dò TaqMan là một đoạn oligonucleotide (24-30 base) mang chất phát huỳnh quang (Reporter) ở đầu 5' và chất dập tắt huỳnh quang (Quencher) ở đầu 3'. Khi enzyme Taq DNA polymerase tiến hành kéo dài chuỗi, hoạt tính 5'-3' exonuclease của enzyme sẽ thủy phân mẫu dò, giải phóng Reporter khỏi Quencher tạo ra tín hiệu huỳnh quang tỷ lệ thuận với số lượng bản sao khuếch đại được ghi nhận qua chu kỳ ngưỡng (Ct). Phản ứng tích hợp kênh màu FAM (phát hiện tác nhân mục tiêu) và kênh màu HEX (phát hiện chứng nội kiểm tra - Internal Control (IC)).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

1. Quy trình ly trích RNA: Sử dụng bộ kit AccuRive pDNA/RNA Prep Kit (Cat#EX-DRA05.1A, KT BIOTECH) từ 200 $\mu$L mẫu máu hoặc dịch đồng hóa mô theo quy trình ly giải, kết tủa và rửa 5 bước (sử dụng các dung dịch KTS1, KTS2, KTS3, KTS4 và hoàn nguyên RNA trong 50 $\mu$L KTS5).
2. Thiết lập phản ứng RT-qPCR: Phản ứng được thực hiện trên hệ thống máy LineGene K Plus Real-time PCR (Cat#FQD-48A, BIOER) với tổng thể tích phản ứng 25 $\mu$L (gồm 20 $\mu$L RT-qPCR Mix chuyên biệt của kit và 5 $\mu$L RNA mẫu tách chiết). Chu trình nhiệt đồng nhất cho cả hai bộ kit:
   • Giai đoạn phiên mã ngược: 45°C trong 15 phút.
   • Giai đoạn biến tính ban đầu: 95°C trong 3 phút.
   • Giai đoạn chu kỳ (45 chu kỳ): Biến tính ở 95°C trong 15 giây; Bắt cặp và kéo dài ở 60°C trong 30 giây (thu nhận tín hiệu huỳnh quang FAM và HEX tại bước này).
3. Đánh giá độ đặc hiệu phân tích: Thử nghiệm phản ứng RT-qPCR của từng bộ kit với các mẫu đối chứng âm chéo gồm DNA/RNA của 6 loài vi khuẩn (Escherichia coli, Salmonella spp., Staphylococcus aureus, Staphylococcus hyicus, Streptococcus spp., Clostridium perfringens) và 3 loại virus thường gặp trên heo (Porcine Circovirus type 2 - PCV2, Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus - PRRSV, African Swine Fever Virus - ASFV) cùng mẫu chứng âm của kit (NTC).
4. Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và xây dựng đường chuẩn: Tiến hành pha loãng bậc 10 plasmid chuẩn chứa gene mục tiêu của FMDV và EMCV từ nồng độ $10^6$ copies/$\mu$L xuống $10^0$ copies/$\mu$L bằng đệm TE pH 8.0 vô trùng (Cat#D0123, BIO BASIC). Nồng độ đưa vào phản ứng 25 $\mu$L (sử dụng 5 $\mu$L mẫu) tương ứng dải nồng độ từ $5 \times 10^6$ đến $5 \times 10^0$ copies/phản ứng. Mỗi nồng độ được thực hiện lặp lại 3 lần. Đường chuẩn tuyến tính biểu diễn mối tương quan giữa giá trị Ct trung bình và $\log_{10}$ số lượng bản sao plasmid để xác định hệ số góc (Slope), hệ số tương quan ($R^2$) và hiệu suất phản ứng khuếch đại ($E%$) theo công thức: $$E% = (10^{-1/\text{Slope}} - 1) \times 100%$$
5. Thử nghiệm kiểm tra ức chế phản ứng (Spiking test): Để loại trừ âm tính giả trên mẫu thực địa, tiến hành trộn bổ sung đối chứng dương (vaccine FMDV vô hoạt) vào các mẫu thực địa âm tính ngẫu nhiên, sau đó tiến hành tách chiết RNA và chạy RT-qPCR kiểm tra sự khuếch đại.
6. Xử lý số liệu: Thu thập dữ liệu tín hiệu huỳnh quang, lập bảng tính toán giá trị trung bình Ct và dựng đồ thị đường chuẩn bằng phần mềm Microsoft Excel 2016.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Mở đầu (Introduction)

Chương 1 thiết lập tính cấp thiết của đề tài xuất phát từ nhu cầu thực tiễn trong công tác kiểm soát dịch bệnh thú y tại Việt Nam. Tác giả chỉ rõ mức độ nguy hại của hai dịch bệnh FMD và EMC trên đàn heo, sự giống nhau trong biểu hiện lâm sàng viêm cơ tim giữa hai tác nhân này, và vai trò của việc phát triển các bộ sinh phẩm chẩn đoán RT-qPCR đạt tiêu chuẩn phân tích. Chương này xác định rõ mục tiêu tổng quát, mục tiêu cụ thể và 3 nội dung nghiên cứu chính cần thực hiện.

Chương 2: Tổng quan tài liệu (Literature Review)

Chương 2 tổng hợp hệ thống cơ sở lý luận và các y văn khoa học liên quan:

• Tổng quan về virus FMDV: Lịch sử phân lập, phân loại học, 7 serotype và các topotype/genotype phân bố theo vùng địa lý; cấu trúc virion kích thước 25-30 nm; cấu tạo bộ gene 8.400 nt gồm các protein cấu trúc (VP1-4) và phi cấu trúc (Lpro, 2A-C, 3A-D); động vật cảm nhiễm móng guốc; các con đường lây truyền trực tiếp, gián tiếp và qua không khí; cơ chế sinh bệnh học gắn thụ thể $\alpha_V\beta_6$; các biểu hiện lâm sàng mụn nước ở miệng, móng và bệnh tích tim vằn hổ (tiger heart) gây chết đột ngột ở heo con dưới 8 tuần tuổi.
• Tổng quan về virus EMCV: Lịch sử phát hiện từ năm 1945, thuộc chi Cardiovirus; cấu trúc hạt virus 30 nm mang ssRNA(+) dài 7.800 base; dịch tễ học với ổ chứa chính là loài gặm nhấm; cơ chế xâm nhập qua đường tiêu hóa, nhân lên tại cơ tim gây phù thũng màng tim, tràn dịch lồng ngực và hoại tử cơ tim thất phải; biểu hiện sảy thai, chết lưu ở nái và tỷ lệ chết gần 100% ở heo con theo mẹ (20-40 ngày tuổi).
• Kỹ thuật Real-time PCR: So sánh chất nhuộm huỳnh quang xen gắn sợi đôi (SYBR Green I) và mẫu dò huỳnh quang đặc hiệu trình tự (TaqMan Probe); phân tích 3 pha của đường cong khuếch đại (pha tuyến tính khởi đầu, pha hàm số mũ, pha bình nguyên); định nghĩa chu kỳ ngưỡng Ct.
• Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước: Tổng kết các công trình chẩn đoán RT-qPCR phát hiện EMCV nhắm vào gene 3D (Yuan et al., 2014), phát hiện đặc hiệu các serotype FMDV vùng Trung Đông trên vùng gene VP1 (Reid et al., 2014) và hệ thống RT-PCR cầm tay chẩn đoán nhanh FMD tại chuồng (Matsui et al., 2023).

Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (Materials and Methods)

Chương 3 trình bày chi tiết điều kiện thực nghiệm, bao gồm thời gian từ tháng 3 đến tháng 7/2023 tại PTN BIO313 ĐH Nông Lâm TP.HCM. Tác giả mô tả chi tiết nguồn gốc vật liệu:

• Mẫu chuẩn plasmid FMDV và EMCV nồng độ $10^6$ copies/$\mu$L do đơn vị sản xuất bộ kit TopSPEC® cung cấp.
• Vaccine FMDV thương mại (Biogenesis Bago) và các chủng vi sinh vật đối chứng do PTN Chẩn đoán Thú y Biomin cung cấp.
• 80 mẫu bệnh phẩm thực địa (58 mẫu máu, 22 mẫu mô) thu thập từ các trang trại heo ở các tỉnh phía Nam.
• Thiết bị máy luân nhiệt Real-time PCR LineGene K Plus và quy trình ly trích RNA 5 bước qua bộ kit AccuRive.
• Nguyên tắc đánh giá kết quả đa kênh: mẫu được kết luận dương tính khi kênh FAM xuất hiện đường cong khuếch đại có giá trị Ct xác định; âm tính khi kênh FAM không có tín hiệu (Ct = 0 hoặc Undetermined) trong khi kênh HEX (chứng nội IC) xuất hiện tín hiệu khuếch đại hợp lệ.

Chương 4: Kết quả và thảo luận (Results and Discussion)

Chương 4 trình bày toàn bộ số liệu thực nghiệm thu được từ hai bộ kit thử nghiệm:

1. Kết quả đánh giá bộ kit TopSPEC® EMCV RT-qPCR KIT:

• Độ đặc hiệu phân tích: Khi kiểm tra với 9 chủng vi sinh vật không mục tiêu (E. coli, S. aureus, S. hyicus, Salmonella spp., C. perfringens, Streptococcus spp., PCV2, PRRSV, ASFV) và mẫu chứng âm (NTC), kênh FAM hoàn toàn không có tín hiệu khuếch đại. Chỉ có mẫu đối chứng dương của kit cho tín hiệu khuếch đại đặc hiệu ở kênh FAM với giá trị Ct = 32. Tín hiệu chứng nội IC ở kênh HEX đều xuất hiện ở tất cả các giếng phản ứng với giá trị Ct dao động ổn định trong khoảng 29 đến 31, khẳng định quá trình thao tác và hóa chất không bị ức chế.
• Giới hạn phát hiện (LOD): Thử nghiệm pha loãng plasmid EMCV từ $5 \times 10^6$ xuống $5 \times 10^0$ copies/phản ứng qua 3 lần lặp lại độc lập. Kết quả ghi nhận 100% các giếng ở tất cả các mức nồng độ đều được khuếch đại thành công. Nồng độ thấp nhất cho kết quả dương tính tin cậy ở cả 3 lần lặp là $5 \times 10^0$ copies/phản ứng (5 copies/phản ứng).
• Đường chuẩn định lượng: Phương trình hồi quy tuyến tính của kit EMCV được thiết lập là $y = -3.4606x + 38.914$, trong đó $y$ là giá trị Ct và $x$ là $\log_{10}$ nồng độ plasmid. Các thông số kỹ thuật đạt chuẩn phân tích gồm: hệ số dốc $\text{Slope} = -3.4606$, hệ số tương quan tuyến tính $R^2 = 0.9997$, và hiệu suất phản ứng khuếch đại $E% = 95%$.

2. Kết quả đánh giá bộ kit TopSPEC® FMDV RT-qPCR KIT:

• Độ đặc hiệu phân tích: Tương tự kit EMCV, phản ứng khuếch đại kênh FAM chỉ xuất hiện ở mẫu đối chứng dương của kit, không bắt chéo với bất kỳ mẫu DNA/RNA của 9 chủng vi khuẩn và virus đối chứng âm. Kênh HEX ghi nhận tín hiệu chứng nội IC rõ ràng, chứng minh kit có độ đặc hiệu 100% với FMDV.
• Giới hạn phát hiện (LOD): Thử nghiệm dải nồng độ plasmid FMDV từ $5 \times 10^6$ đến $5 \times 10^0$ copies/phản ứng qua 3 lần chạy lặp lại đều cho kết quả dương tính đồng nhất. Giới hạn phát hiện LOD của kit FMDV được xác định là $5 \times 10^0$ copies/phản ứng (5 copies/phản ứng).
• Đường chuẩn định lượng: Phương trình đường chuẩn đạt $y = -3.3969x + 38.668$, với hệ số dốc $\text{Slope} = -3.3969$, hệ số tương quan $R^2 = 0.9969$, và hiệu suất khuếch đại đạt $E% = 97%$.

3. Khảo sát mẫu bệnh phẩm thực địa và thử nghiệm kiểm chứng ức chế:

• Tầm soát 80 mẫu thực địa (58 mẫu máu, 22 mẫu mô) thu từ các trại heo phía Nam bằng cả hai bộ kit: Toàn bộ 80/80 mẫu đều cho kết quả âm tính với cả FMDV và EMCV (kênh FAM không có tín hiệu, kênh HEX của chứng nội IC lên đều).
• Thử nghiệm spiking đối chứng dương FMDV vào các mẫu thực địa âm tính ngẫu nhiên: Sau khi tách chiết và chạy RT-qPCR, tất cả các mẫu bổ sung đều cho kết quả dương tính ở kênh FAM. Kết quả này chứng minh quy trình tách chiết và thành phần bệnh phẩm thực địa không chứa chất ức chế enzyme PCR, khẳng định kết quả âm tính của đàn heo khảo sát là hoàn toàn chính xác.

4. Thảo luận: Tác giả đối chiếu các thông số đường chuẩn ($R^2 > 0.99$, hiệu suất $E%$ trong khoảng 90-110%, Slope từ -3.58 đến -3.10) với hướng dẫn chuẩn định lượng quốc tế (MIQE guidelines và Green & Sambrook, 2018), khẳng định hai bộ kit đạt độ chuẩn xác cao. Đồng thời, tác giả thảo luận về tỷ lệ nhiễm FMDV và EMCV trong tự nhiên thường ở mức thấp theo các công bố quốc tế (Yuan et al., Paixao et al., Fosgate et al.), giải thích tính hợp lý của kết quả khảo sát 80 mẫu thực địa.

Chương 5: Kết luận và kiến nghị (Conclusion and Recommendations)

Chương 5 tóm tắt các kết luận cốt lõi về độ đặc hiệu tuyệt đối, giới hạn phát hiện 5 copies/phản ứng của hai bộ kit thử nghiệm, đồng thời đưa ra kiến nghị cần tiếp tục đánh giá hiệu quả phát hiện trên các mẫu bệnh phẩm dương tính thực tế từ các nguồn ổ dịch khác nhau và so sánh đối chứng song song với các kit thương mại hiện hành.

Kết quả và đóng góp

Kết quả chính

Dữ liệu định lượng và thông số kỹ thuật của hai bộ kit thử nghiệm được tổng hợp trong bảng sau:

Thông số kỹ thuật / Tiêu chí đánh giá	TopSPEC® FMDV RT-qPCR KIT	TopSPEC® EMCV RT-qPCR KIT
Độ đặc hiệu phân tích	Đặc hiệu 100% với FMDV; không phản ứng chéo với 9 tác nhân vi sinh vật đối chứng (E. coli, S. aureus, S. hyicus, Salmonella spp., C. perfringens, Streptococcus spp., PCV2, PRRSV, ASFV)	Đặc hiệu 100% với EMCV; không phản ứng chéo với 9 tác nhân vi sinh vật đối chứng (E. coli, S. aureus, S. hyicus, Salmonella spp., C. perfringens, Streptococcus spp., PCV2, PRRSV, ASFV)
Giới hạn phát hiện (LOD)	5 copies/phản ứng ($5 \times 10^0$ copies/reaction)	5 copies/phản ứng ($5 \times 10^0$ copies/reaction)
Hệ số dốc (Slope)	-3,3969	-3,4606
Hệ số tương quan ($R^2$)	0,9969	0,9997
Hiệu suất khuếch đại ($E%$)	97%	95%
Phương trình đường chuẩn	$y = -3,3969x + 38,668$	$y = -3,4606x + 38,914$
Tín hiệu kênh chứng nội IC (HEX)	Ổn định trên toàn bộ mẫu kiểm tra	Ct dao động từ 29 đến 31
Kết quả khảo sát mẫu thực địa (n=80)	0/80 mẫu dương tính (100% âm tính)	0/80 mẫu dương tính (100% âm tính)
Kiểm tra ức chế (Spiking test)	100% mẫu bổ sung vaccine FMDV đều phát hiện dương tính	Đã kiểm soát qua chứng nội IC

Đóng góp của đề tài

• Đóng góp khoa học: Cung cấp dữ liệu thực nghiệm thẩm định độc lập về các chỉ số phân tích sinh học (độ đặc hiệu, LOD, độ tuyến tính, hiệu suất phản ứng) của hai bộ sinh phẩm RT-qPCR chẩn đoán FMDV và EMCV theo các tiêu chuẩn phân tích định lượng quốc tế.
• Đóng góp thực tiễn: Khẳng định hai bộ kit thử nghiệm TopSPEC® FMDV RT-qPCR KIT và TopSPEC® EMCV RT-qPCR KIT đáp ứng đầy đủ yêu cầu kỹ thuật để đưa vào ứng dụng chẩn đoán thường quy, phục vụ công tác giám sát dịch tễ học thú y và kiểm soát bệnh truyền nhiễm trên đàn heo tại Việt Nam.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế: Toàn bộ 80 mẫu thực địa thu thập ngẫu nhiên tại các trang trại phía Nam trong giai đoạn nghiên cứu đều âm tính với FMDV và EMCV, do đó nghiên cứu chưa có điều kiện đánh giá độ nhạy chẩn đoán lâm sàng trên các mẫu bệnh phẩm tự nhiên mang tải lượng virus thực tế từ các ổ dịch bùng phát.
• Hướng nghiên cứu tiếp: Cần tiếp tục mở rộng quy mô thử nghiệm đánh giá hiệu quả phát hiện của hai bộ kit trên các nguồn mẫu bệnh phẩm lâm sàng dương tính thực tế từ nhiều vùng dịch tễ, đồng thời tiến hành so sánh đối chiếu song song với các bộ kit thương mại quốc tế đã được chuẩn hóa trên đa dạng các nền mẫu sinh học khác nhau (huyết thanh, dịch ngoáy mũi họng, mụn nước, phân, dịch mô).

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận có giá trị tham khảo chuyên môn đối với:

• Sinh viên, học viên cao học ngành Công nghệ Sinh học, Thú y, Chăn nuôi: Tham khảo quy trình chuẩn hóa phương pháp thực nghiệm thẩm định bộ sinh phẩm chẩn đoán phân tử (đánh giá độ đặc hiệu phân tích, xác định LOD qua dải pha loãng nồng độ bản sao plasmid, dựng và biện luận phương trình đường chuẩn hồi quy tuyến tính).
• Kỹ thuật viên phòng xét nghiệm chẩn đoán thú y và sinh học phân tử: Tham khảo quy trình thao tác ly trích RNA và thiết lập phản ứng RT-qPCR đa kênh kết hợp kiểm soát chứng nội (Internal Control) để loại trừ triệt để hiện tượng âm tính giả.
• Các đơn vị nghiên cứu và phát triển sản phẩm (R&D) sinh phẩm chẩn đoán: Sử dụng các thông số thực nghiệm làm cơ sở đối chuẩn trong quá trình tối ưu hóa các kit xét nghiệm real-time RT-PCR phát hiện virus gây bệnh động vật.

Câu hỏi thường gặp

1. Giới hạn phát hiện (LOD) của hai bộ kit TopSPEC® FMDV và TopSPEC® EMCV đạt mức bao nhiêu?

Giới hạn phát hiện của cả hai bộ kit thử nghiệm TopSPEC® FMDV RT-qPCR KIT và TopSPEC® EMCV RT-qPCR KIT đều được xác định chính xác ở mức 5 bản sao/phản ứng ($5 \times 10^0$ copies/reaction), tương ứng nồng độ plasmid $10^0$ copies/$\mu$L khi nạp thể tích 5 $\mu$L mẫu vào phản ứng 25 $\mu$L. Cả 3 lần lặp lại thực nghiệm độc lập ở mức nồng độ này đều cho kết quả khuếch đại dương tính đồng nhất.

2. Những tác nhân vi sinh vật nào đã được sử dụng để kiểm tra độ đặc hiệu phân tích của hai bộ kit?

Độ đặc hiệu phân tích được kiểm tra chéo với DNA/RNA của 9 loài vi sinh vật thường xuất hiện và gây bệnh trên đàn heo, bao gồm 6 chủng vi khuẩn (Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Staphylococcus hyicus, Salmonella spp., Clostridium perfringens, Streptococcus spp.) và 3 chủng virus (Porcine Circovirus type 2 - PCV2, Porcine reproductive and respiratory syndrome virus - PRRSV, African swine fever virus - ASFV). Cả hai bộ kit đều không xuất hiện phản ứng chéo với bất kỳ tác nhân nào trong số này.

3. Các thông số đường chuẩn (Slope, $R^2$, Hiệu suất $E%$) của từng bộ kit đạt kết quả cụ thể như thế nào?

• Kit FMDV: Phương trình $y = -3,3969x + 38,668$, hệ số góc $\text{Slope} = -3,3969$, hệ số tương quan $R^2 = 0,9969$, hiệu suất khuếch đại $E% = 97%$.
• Kit EMCV: Phương trình $y = -3,4606x + 38,914$, hệ số góc $\text{Slope} = -3,4606$, hệ số tương quan $R^2 = 0,9997$, hiệu suất khuếch đại $E% = 95%$. Các giá trị này đều nằm hoàn toàn trong ngưỡng chuẩn quốc tế (Slope từ -3,58 đến -3,10; $R^2 \ge 0,98$; $E%$ từ 90% đến 110%).

4. Kết quả khảo sát trên 80 mẫu thực địa là gì và tác giả đã làm gì để loại trừ âm tính giả do ức chế phản ứng?

Khảo sát trên 80 mẫu thực địa (58 mẫu máu, 22 mẫu mô) từ các trại heo phía Nam cho kết quả 100% âm tính với cả hai virus. Để loại trừ khả năng âm tính giả do chất ức chế trong nền mẫu, tác giả đã: (1) Theo dõi tín hiệu chứng nội IC (kênh HEX) - kết quả cho thấy IC đều khuếch đại bình thường (Ct 29-31); và (2) Thực hiện thí nghiệm spiking trộn vaccine FMDV vào các mẫu thực địa âm tính ngẫu nhiên trước khi tách chiết - kết quả 100% các mẫu trộn đều cho tín hiệu dương tính ở kênh FAM, khẳng định nền mẫu không gây ức chế phản ứng PCR.

5. Chu trình nhiệt của phản ứng RT-qPCR được thiết lập như thế nào?

Cả hai bộ kit sử dụng chu trình nhiệt đồng nhất trên hệ thống LineGene K Plus: Phiên mã ngược ở 45°C trong 15 phút; Biến tính ban đầu ở 95°C trong 3 phút; tiếp theo là 45 chu kỳ gồm Biến tính ở 95°C trong 15 giây và Bắt cặp - Kéo dài ở 60°C trong 30 giây (đọc tín hiệu huỳnh quang FAM và HEX tại bước 60°C).

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Trần Nguyễn Minh Thanh đã hoàn thành việc đánh giá các thông số phân tích của hai bộ kit thử nghiệm TopSPEC® FMDV RT-qPCR KIT và TopSPEC® EMCV RT-qPCR KIT. Kết quả thực nghiệm khẳng định cả hai bộ kit đều đạt độ đặc hiệu phân tích 100% với tác nhân đích, không phản ứng chéo với các vi sinh vật phổ biến trên heo, và đạt giới hạn phát hiện ở mức 5 bản sao/phản ứng với hiệu suất khuếch đại tối ưu (95% - 97%). Khảo sát trên 80 mẫu bệnh phẩm thực địa tại miền Nam cho thấy tình trạng âm tính trên đàn khảo sát và chứng minh tính ổn định, không bị ức chế phản ứng của quy trình xét nghiệm. Nghiên cứu đã chứng minh hai bộ kit hoàn toàn đủ tiêu chuẩn kỹ thuật để ứng dụng trong công tác chẩn đoán thường quy và giám sát dịch bệnh lở mồm long móng cũng như viêm não - viêm cơ tim trong thực tiễn chăn nuôi thú y.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY - HO CHI MINH CITY FACULTY OF BIOLOGICAL SCIENCES EVALUATING SPECIFICITY AND DETERMINING THE LIMIT OF DETECTION OF TopSPEC® FMDV RT-qPCR KIT and TopSPEC® EMCV RT-qPCR KIT Major : BIOTECHNOLOGY Student : TRAN NGUYEN MINH THANH Student code : 19126163 Academic year : 2019 - 2023 Thu Duc City, 08/2023 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY - HO CHI MINH CITY FACULTY OF BIOLOGICAL SCIENCES GRADUATION THESIS EVALUATING SPECIFICITY AND DETERMINING THE LIMIT OF DETECTION OF TopSPEC® FMDV RT-qPCR KIT and TopSPEC® EMCV RT-qPCR KIT Advisor Student Dr. DINH XUAN PHAT TRAN NGUYEN MINH THANH Thu Duc City, 08/2023 ACKNOWLEDGEMENTS First of all, I would like to thank the Board of Nong Lam University Ho Chi Minh City and the Board of Faculty of Biological Sciences along with all the teachers who taught and imparted knowledge to me during my time studying at the school. In addition, I also want to thank Biomin Veterinary Diagnostics Laboratory, Branch of Biomin Vietnam in Binh Duong (belonging to DSM Group). I really appreciate my advisor, PhD Dinh Xuan Phat, whose expertise was invaluable in formulating the research questions and methodology.

Your insightful feedback pushed me to sharpen my thinking and brought my work to a higher level. I am so grateful to Ms. Nguyen Thi Mi Mi, Ms. Cao Tran Quynh Nhu, Mr.

Le Thanh Binh, Mr. Hoang Gia Lam and other members of Gene Technology Laboratory BIO313 for supporting me during the completion of my graduation thesis. And last but not least, I want to send thanks of my family for always listening, trusting and accompanying over the past time. You are always there for me, at my worst, at my best.

I promise that I will try harder to become successful and make you proud. CONEIRMATION COMMITMENT My name is Tran Nguyen Minh Thanh, Student ID: 19126163, Class: DH19SHA, Faculty of Biological Sciences, Nong Lam University Ho Chi Minh City. I guarantee that this research was conducted by myself and that the results presented are utterly truthful and objective. Thu Duc City, August 2023 Student’s signature il ABSTRACT The purpose ofthis study was performed to evaluate the specificity and determine the limit of detection for two trial kits: TopSPEC® FMDV RT-qPCR KIT and TopSPEC® EMCV RT-qPCR KIT.

The qPCR of the trial kit was performed determining the limit of detection and checking specificity with some bacteria and viruses commonly appearance in samples. The results showed that the limit of detection of two kits was 5 copies/reaction and its specificity with target pathogens. The standard curve parameters of trial kits were a slope of -3.3969, a linear correlation (R2) of 0.9969, efficiency (E%) of 97% for FMDV’s kit, and a slope of -3.4606, a linear correlation (R?) of 0.9997, and efficiency (E%) of 95% for EMCV’s kit. After that the two trial kits were applied to investigate the presence of FMDV and EMCV in clinical samples collected from pig farms in Southern Vietnam.

Eighty field samples were examined and all samples were confirmed to be negative with each of pathogens. Additionally, it’s indicated that TopSPEC® FMDV RT-qPCR KIT and TopSPEC® EMCV RT-qPCR KIT can be utilized in routine diagnostics of these pathogens in pig farms. Keywords: EMCV, FMDV, limit of detection, real-time PCR (qPCR), specificity, trial Kit. il TÓM TẮT Đánh giá độ đặc hiệu và giới hạn phát hiện của hai bộ kit thử nghiệm TopSPEC® FMDV RT-qPCR KIT và TopSPEC® EMCV RT-qPCR KIT Nghiên cứu này được thực hiện nhằm đánh giá độ đặc hiệu và giới hạn phát hiện của hai bộ kit thử nghiệm 7opŠSPEC® FMDV RT-qPCR KIT và TopSPEC® EMCV RT-qPCR KIT.

Realtime PCR (qPCR) của các bộ kit được xác định giới han phát hiện và kiểm tra độ đặc hiệu với một số vi khuân và virus. Kết quả cho thấy rằng, giới hạn phát hiện của hai bộ kit thử nghiệm đều là 5 copies/phản ứng và đặc hiệu với các tác nhân muc tiêu. Các thông số đường chuẩn của TopSPEC® FMDV RT-qPCR KIT: hệ số dốc (Slope) -3,3969, hệ số tương quan R? = 0,9969 và hiệu quả khuếch đại (E%) 97%. TopSPEC® EMCV RT-qPCR KIT với hệ số dốc (Slope) là -3,4606, hệ số tương quan R7 = 0,9997 và hiệu quả khuếch đại (E%) = 95%.

Sau đó, hai bộ kit này đã được ứng dụng dé kiểm tra sự hiện điện của FMDV và EMCV với 80 mẫu thực địa được thu thập từ các tỉnh phía Nam và tất cả các mẫu đều cho kết quả âm tính. Tóm lại, kết quả nghiên cứu cũng cho thay hai bộ kit thử nghiệm TopSPEC® FMDV RT-qPCR KIT và TopSPEC® EMCV RT-qPCR KIT có thé ứng dụng trong chan đoán thường quy hai bệnh Lở mồm long móng và Viêm não-viêm cơ tim gây ra ở trên heo. Từ khóa: EMCV, FMD, giới hạn phát hiện, real-time PCR (qPCR), độ đặc hiệu, kit thử nghiệm. IV TABLE OF CONTENTS Page ACKNOW LEDGEMEN TS sssssesssnssssenes venssuasenanssnannnennennavncensaenasas tneaasnenteoceunreseensnmiennenaane 1 CONFIRMATION COMMITMENT .c0sceccsssssesssssosssnsossenssseseenesssssnessessonessesessesnens i ABSTRACTscssesssmsesausnvnn secssusen 110386519655 80366050133668358330385850380115318356G176348559313 0338886 1H ¡"my —.

iv TABLE OF CONTENTS. cà SH 20H ng. n0 xeg nas V LIST OF ABBREVIATIONS cácniieneinseeioioinisL0gg SEồ N2 34I4051385333953531314838193843358538 vill LIST OF TABLES piissecsrcssieietsiietboSiGG0001008:38250130Ẹ3Đ430/0u81804004E314305JV31580099133108601430060012086 1X LIST OF FIGURES sua sssssniidnssebieodiisodiidES081300363005309593960958400S080E0E9S0IGG20/4G1030/GTĐ08530/500 18.-- 2-1 21 21222 HH HH HH re 1 Dl TAGS OI, ố.ỐốỐốốốẽẽ nemenserasnionmnasraranreaneinmeseamaaianzae’ 1 1L Oe) (lee ee ee ee ee ee ee ee 3 13. Content iss cove sesass cease Saeco Ss RE Ee 2 Chapter 2.

LITERATURE REVIEW scscsswnsacorvossnwnvesssxoressrreveeensnunerssyernsesseenssueanees 3 2. Introduction to FMDV 1. 3 Pe cll; CLASSIT IC ALON si sni2586016610113690650.3080585638:45©3:G83S80kESvES4383033Edg43:38uG33503820333835130L38g86 6655 3 21. sttucture of PMD V mass: mess oye eee Be ERE Eee area 3 201L, 50, (0.

e000) 0) \' ee ee a 5 Zl Sule GESORCAP NICs IST DU 6 cree nen ae nsenemeemnansinnnnsereqeceuneomaranwens sueanmeseesan teseesesnenmounecesues 5 2.ceccceccecceeceescesceeseeseeseeesececeeaecnceeaecsecesceseeaeeeceseeeseeaeeneeees 6 Delads 1: PPGTSTHISS | OM scccscse ssc scasananaw ans anes esiassiee aasencus eet ses mesion aaa Seat RACE TATRA ENOASUNERENIRNS 7 25 L4: Path GENES Set se s0 ng set lbgesv43351839358 80186 g505EE053i11588ggiuảN goidgai30gtodgagi083tgcreg trường gisÖbg2tiEt/ghD Le cl 5i1:150a:G01171161E1TTSP.ss8sssisosu3xkzsoidakz8sggeuoi38glnsgk3S0nESBUS80805i59. Introduction to EMCV 1.1, Structure Of EMG nugngbpogi61105303155544E04355EG5151XESEXSESSESISSGE4SEAEEASEASLESS4B.XEESSSS1464E 11 SOM ol oy (6 bcs 1000) (05° en ee ee eee 12 205/5 8) oP AUN O BENE SS yeseosasccs acess setssn sais atten iasteontannsssti ne snk tmmiv oiler nem awesome ORI 13 2. Climical Signs nan. Realtime PCR t6Chii que cscenvessennmemnemew eran eee 15 2.

16 23,3 Amiplilication DOŸ cen ercemmeeenseyn meer ae ene eee 18 OB Diels (IHBREBEsecseorersoaeeroitcbszcBflErrsuedosEpgaigtrocfkgkrrjBiciiidlio:=ugfritkritroliExiiot2ggzecsizETrSieogdttz2HijHi-3ntSz 18 2/3465: LOPTESHOIM CYCLE wcccscnsnemennsecncenermencenmeuremnen aa emmerrmmenneenmnnED 18 VN0)ai6i. MATERIALS AND METHODS. Time and location of the researCH:.-- -- 2 2+ 3232313212 kg ng ng nưy 21 5.2, Materials of the Tes eae hh. 2le CHEMICALS 87id:6dPIHGIĂneeeeddeni gh ghi thai GIAHfitĐSh4HRiUNSB4GTEEUEBIGEGIRU2GIBhEBCI0.

Reverse transcription Real-time PCT. TopSPEC® EMCV RT-qPCR KÍT. ---7 c5 cSs+sererrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrree 23 Sedadly ENAIUAUOI OF [HT SPGGIHDITY su nseesssbnithotlst4g603638646803100/99HE0NBISS-SGHS. Determine the limit of detection (LOID).

TopSPEC® FMDV RT-qPCR. KU ssssvsemsecseesrsemssnr arcana: 24 3. Evaluation of the specificity 0. Determine for the limit of detection (LOID).

Investigate the presence of FMDV and EMCV in field samples. RESULTS AND DISCUSSION so bi D B2 E2 EV HD d5 20850812801838e8E 26 Mlcol SULLA sit eit ei cc tre a et aS EE 26 4. TopSPEC® EMCV RT-qPCR KIT. Testing analytical specificity.- 1t vn vn n nh HH HH HH re 26 4.

Determine the limit of detection (LOT). Investigate the presence of EMCV in field samples from pig farms. TopSPEC® FMDV RT-qPCR KIT .LESGHB ately tical SpSCih Hy sccsiccacces acenenaaaesasermcammeve ssamewa mateaummaeavemanuan ast 29 4. Determine the limit of detection (LOÏ).

Investigate the presence of FMDV in field samples from pig farms. CONCLUSION AND RECOMMENDATIONS.€€6ffiiienidliG Hỗ so se rong ndintaa DI GA IÔGAGGIỜNGIIASQSĂNHAHA903ữggBìSSISG-SAGSSI2NISGSSABSEE 35 IREEREERE N@ ES sec soxsctrsn nsec cet ee merino cet eats tou ce nse 36 APPENDIX, venvese noses snerswcncvesmeucs ensneusamanssssiences ste sesnetties eesteawans nnuceune wanna in sun euensousspenssuanvancad 43 vil LIST OF ABBREVIATIONS ASFV : African swine fever virus Ct : Cycle threshold DNA : Deoxyribonucleic acid EMC : Encephalomyocarditis EMCV : Encephalomyocarditis virus FMD : Foot-and-mouth disease FMDV : Foot-and-mouth disease virus IC : Internal control ORF : Open reading frame PC : Positive control PCR : Polymerase Chain Reaction PCV2 : Porcine Circovirus type 2 PRRSV : Porcine reproductive and respiratory syndrome virus RNA : Ribonucleic acid RT-qPCR : Reverse transcription Real-time Polymerase Chain Reaction WOAH : World Organisation for Animal Health Vill LIST OF TABLES Page Table 3. Evaluating of results qPCR to detect FMDV and EMCV. Repetitions of the qPCR for determining the limit of detection.

Repetitions of the qPCR for determining the limit of detection. 31 IX LIST OF FIGURES Page Figure 2. Genome and structure of FMDV 0. The geographical distribution of FMDV.

c7 5-5 S+cS+ccseeeseerrrexres 6 Fisure:2. Theroute of spreading the diséa$© scccsseccsserensaernscmmeenma naene Ỷ Figure 2. Vesicular lesions on feet of swine experimentally mnfected. Pigs with FMDV infection displaying clinical sign and lesions.

Genome compositions of recombinant EMCV. Heart of pig with EMCV Imf€cfion. Sagittal section of the heart of pig with EMCV Infection. The action of SYBR Green I ÏDye.

The action of TaqMan probe.- - --- -- 5522211131221 1531231 131211 1111 KH 1kg ke. The specificity evaluation of EMCV RT-qPCR KIt. The specificity evaluation of EMCV RT-qPCR KIt. Determine LOD of the EMCV RT-qPCR KIt.

Determine LOD of the EMCV RT-gPCR KIt. Detection limit and standard curves of EMCV RT-qPCR kit. The specificity evaluation of FMDV RT-qPCR kit. The specificity evaluation of FMDV RT-qPCR kit.

Determine LOD ofthe FMDV RT-qPCR KIC.- eee dl Figure 4. Determine LOD of the FMDV RT-qPCR KIt. Detection limit and standard curves of FMDV RT-qPCR kit. Introduction In recent years, pork consumption has been decreasing in some countries due to many factors, but it is still quite high because pork 1s the main ingredient of many dishes in East and Southeast Asia, and the Western world, particularly in Central Europe.

The swine industry is not only an essential food source for the people but also played an important role in economic development. Nonetheless, the livestock industry is still facing many difficulties due to the impact of a number of reasons such as input costs, biosecurity, especially diseases as FMDV and EMCV. Foot-and-mouth disease (FMD) is a severe highly contagious disease caused by picornavirus. FMD 1s the first disease for which World Organisation for Animal Health (WOAH) established an official list of disease-free countries.

FMD in swine caused a serious impact on the economy of the global livestock and trade industries, it had to lead to the slaughter of swine or the destruction of infected herds to stop the spread of the disease. The economic impacts of FMD may be estimated revenue losses of between $49.8 billion (in present value terms) were expected over 10 years. Control costs were estimated at between $60 million and $373 million, with $6.2 million representing compensation to farmers for animals destroyed during control procedures (Australian Government Department of Agriculture, Fisheries and Forestry: www. Preventing FMD disease in time is crucial to prevent damage caused by epidemics.

Encephalomyocarditis virus (EMCV) was also a widely distributed picornavirus that caused substantial pig mortalities due to heart disease. In piglet, virus could be expressed as acute myocarditis and sudden death, whereas causing abortion, fetal mummification, stillbirth, and neonatal death in transplacental infection of sows. Because of similarities between EMC and FMD myocarditis in swine, they could be specifically diagnosed via virus isolation or molecular methods (Yuan ef al. The most common molecular method to diagnose these two viruses 1s RT-qPCR.

Currently, there are many qPCR kits that had been developed and practically used in the diagnosis of FMDV and EMCV, including the JTopSPEC® FMDV RT-qPCR KIT and 7opSPEC® EMCV RT-qPCR KIT which were in testing the presence of these pathogens in pig farm.