MỞ ĐẦU Tinh dầu nghệ đƣợc biết đến nhƣ là một chất có khả năng chống oxy hóa và có tính đối kháng vi sinh vật tốt, nhất là ức chế các vi sinh vật có khả năng gây hỏng quả. Trong khi chitosan là một loại polymer carbohydrate tự nhiên đƣợc tạo ra bằng cách deacetyl hóa chitin, có thể tìm thấy trong nhiều loài động vật giáp xác, côn trùng và một vài loại nấm. Với nhiều tính năng nhƣ tính tƣơng thích sinh học, phân hủy sinh học, bám dính màng và không độc hại nên hiện nay nó trở thành nguyên liệu cho nhiều ứng dụng trong dƣợc sinh học và thực phẩm chức năng. Vì những tính chất ƣu việt của nó mà trong những năm gần đây, chitosan đã đƣợc nghiên cứu sử dụng để tạo ra các hạt nano chitosan.
Cùng với tinh dầu nghệ, nano chitosan là chất có khả năng kháng nấm và vi khuẩn mạnh. Quả tƣơi và rau rất dễ bị hỏng và mẫn cảm đối với các bệnh sau thu hoạch, hạn chế thời gian bảo quản và đƣa chúng ra thị trƣờng. Ngoài ra, hƣ hỏng sau thu hoạch gây thất thu kinh tế đáng kể trên toàn thế giới. Nhƣ đã biết, các loại thuốc diệt nấm tổng hợp đƣợc sử dụng từ lâu nhƣ phƣơng thức chính để kiểm soát các bệnh sau thu hoạch.
Nhƣng hiện ngƣời ta lo ngại về ảnh hƣởng của các chất này đến sức khỏe ngƣời tiêu dùng cũng nhƣ sự xuất hiện của các nguồn bệnh kháng thuốc. Vì vậy cần có các biện pháp thay thế để kiểm soát nguồn bệnh sau thu hoạch có hiệu quả, dƣ lƣợng thấp, ít độc hoặc không độc đối với cơ thể không đích. Trong sản phẩm rau hoa quả của Việt Nam, quả Thanh Long đang chiếm vị trí quan trọng trong xuất khẩu, mang lại hiệu quả kinh tế cao. Vì vậy việc sử dụng các chất hoạt tính sinh học tự nhiên để bảo quản quả Thanh Long không những có ý nghĩa kinh tế, mà còn mở ra phƣơng pháp mới trong ngành bảo quản sau thu hoạch ở nƣớc ta.
6 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Với đề tài nghiên cứu “ Nghiên cứu bảo quản Thanh long bằng chế phẩm sinh học nano chitosan kết hợp với tinh dầu nghệ ” sẽ đóng góp thêm một phƣơng pháp bảo quản rau hoa quả an toàn và hiệu quả. Mục tiêu của đề tài: Thử nghiệm in vitro chế phẩm nano chitosan và tinh dầu nghệ với vi sinh vật gây hỏng quả Thanh Long để tìm nồng độ ức chế vi sinh vật tối thiểu MBC. Thử nghiệm chế phẩm nano chitosan và tinh dầu nghệ trên quả để kéo dài thời gian bảo quản thanh long, đảm bảo thanh long còn tƣơi, không bị vi sinh vật làm hỏng quả. Nội dung nghiên cứu: Xác định hoạt tính đối kháng nấm của chế phẩm nano chitosan kết hợp với tinh dầu nghệ.
Nghiên cứu thăm dò ứng dụng nano chitosan kết hợp với tinh dầu nghệ trong bảo quản quả thanh long. 7 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Chƣơng 1 – TỔNG QUAN 1. Chitosan Chitosan, đƣợc phát hiện bởi Rouget năm 1859 [55], là một loại polymer polysaccharide sinh học quan trọng. Về mặt hóa học, đó là một phân tử có trọng lƣợng phân tử cao, polycationic gồm hai monosaccharide, N-acetyl-D-glucosamine và D- glucosamine, liên kết với nhau bởi cầu nối β-(1 → 4) glycosidic (Hình 1.
Hàm lƣợng tƣơng đối của hai monosaccharide trong chitosan có thể khác nhau, mỗi mẫu ở các mức độ khác nhau phụ thuộc vào mức độ deacetyl hóa (75-95%), khối lƣợng phân tử (50- 2.000 kDa), độ nhớt, giá trị pKa, v. Do đó, chitosan không thể đƣợc định nghĩa là một hợp chất duy nhất, nó chỉ đơn thuần là họ của các copolymer với các phân số khác nhau của các đơn vị acetyl.1: Cấu trúc hóa học của chitosan đƣợc điều chế từ chitin. Chitosan liên kết (1→4) 2- amino-2-deoxy-β-D-glucan, đƣợc điều chế từ chitin qua quá trình thủy phân bằng kiềm nhóm N-acetyl. 8 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Chitosan chủ yếu đƣợc sản xuất từ quá trình deacetyl hóa chitin xảy ra ở môi trƣờng kiềm: chitin sôi trong kiềm nồng độ cao vài giờ (40-45% natri hydroxit, 120°C, 1-3 h).
Trong điều kiện đó N-deacetyl hóa xảy ra không hoàn toàn, chitosan đƣợc xem nhƣ là một dẫn xuất một phần N-deacetyl hóa của chitin. Chitosan cũng đƣợc tìm thấy trong tự nhiên, chẳng hạn nhƣ trong thành tế bào của nấm thuộc lớp Zygomycetes [43], tảo xanh Chlorella sp., nấm men và động vật nguyên sinh cũng nhƣ lớp biểu bì trong côn trùng [ 47]. Gần đây trong công nghệ lên men cho thấy nấm (Aspergillus niger) có thể cung cấp một nguồn thay thế chitosan. Phương pháp điều chế nano chitosan từ chitosan.
Công nghệ nano là một công nghệ rất quan trọng trong khoa học, chủ yếu là do ứng dụng rộng rãi của nó trong một phạm vi rộng lớn bao gồm các ngành kỹ thuật, y học, hóa học và sinh học. Việc sử dụng các biopolymer nhƣ polysaccharide trong công nghệ nano ngày càng đƣợc quan tâm, là trọng tâm các nghiên cứu của các nhà khoa học trên toàn thế giới. Trong 30 năm qua, kỹ thuật điều chế nano chitosan đã đƣợc phát triển dựa trên công nghệ chitosan vi hạt. Nano chitosan có thể đƣợc chế tạo bằng một vài phƣơng pháp khác nhau.
Trƣớc kia, ngƣời ta dùng sodium sulphate nhƣ chất để tủa. Năm 1994, một số tác giả đã sử dụng glutaraldehyde nhƣ chất liên kết để liên kết chéo các nhóm amino tự do của chitosan, sau đó nhũ tƣơng hóa (emulsifier), tạo hạt 5-fluorouracil (5- FU) chitosan với kích thƣớc trung bình 0,8 ± 0,1µm [42]. Phƣơng pháp này hiện vẫn đƣợc dùng. Nhìn chung, kỹ thuật chế tạo hạt nano chitosan đã đƣợc phát triển dựa trên kỹ thuật vi hạt chitosan.
Có ít nhất 4 phƣơng pháp: sự đông đặc ion hóa (ionotropic gelation); vi nhũ tƣơng (microemulsion), khuếch tán dung môi nhũ tƣơng (emulsification solvent diffusion) và tổ hợp đa điện phân (polyelectrolyte complex). 9 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Hai phƣơng pháp thƣờng sử dụng là ionotropic gelation và tự lắp ráp polyelectrolyte [50]. Phương pháp Ionotropic gelation Nano chitosan chuẩn bị bằng kỹ thuật gel ionotropic lần đầu tiên đƣợc Calvo và cộng sự báo cáo. Cơ chế tạo nanochitosan dựa trên tƣơng tác tĩnh điện giữa nhóm amine của chitosan và nhóm tích điện âm của polyanion nhƣ tripolyphosphate.
Phƣơng pháp này đơn giản, nhẹ nhàng. Trƣớc tiên, chitosan có thể hòa tan trong axit axetic, có hoặc không có chất ổn định, sau đó bổ sung anionic polyme. Khuấy ở nhiệt độ phòng và các hạt nano đƣợc tạo thành một cách tự phát. Có thể thay đổi kích thƣớc và điện tích bề mặt của hạt bằng cách thay đổi tỉ lệ chitosan và chất ổn định [7].
Phương pháp Microemulsion Nano chitosan đƣợc điều chế bằng kỹ thuật microemulsion lần đầu tiên đƣợc phát triển bởi Maitra và cộng sự [7]. Kỹ thuật này dựa trên sự hình thành của nano chitosan bên trong giọt micellar đảo ngƣợc và sau đó liên kết ngang qua glutaraldehyde. Trong phƣơng pháp này, một chất hoạt động bề mặt đƣợc hòa tan trong N-hexane, sau đó, chitosan trong dung dịch axetic và glutaraldehyde đƣợc thêm vào chất có hoạt tính bề mặt / hỗn hợp hexane, khuấy liên tục ở nhiệt độ phòng. Hạt nano đƣợc hình thành trong sự hiện diện của chất hoạt động bề mặt.
Hệ thống này đƣợc khuấy qua đêm để hoàn thành liên kết ngang, và nhóm amin của chitosan kết hợp với glutaraldehyde. Các dung môi hữu cơ đƣợc lấy ra bằng cách bay hơi dƣới áp suất thấp. Sản lƣợng thu đƣợc là nano chitosan liên kết ngang và chất hoạt động bề mặt dƣ thừa. Chất hoạt động bề mặt dƣ thừa đƣợc lấy ra bằng cách kết tủa với CaCl2 và sau đó đƣợc loại bỏ bằng ly tâm.
Cuối cùng các hạt nano đƣợc thẩm tách và lyophilyzation. Kỹ thuật này cung cấp hạt kích thƣớc nhỏ hơn 100 nm và kích thƣớc các hạt có thể đƣợc 10 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com kiểm soát bằng cách thay đổi lƣợng glutaraldehyde từ đó làm thay đổi mức độ liên kết ngang. Tuy nhiên, phƣơng pháp có một số nhƣợc điểm nhƣ việc sử dụng các dung môi hữu cơ, quá trình chuẩn bị tốn thời gian, và sự phức tạp trong bƣớc rửa. Phương pháp khuếch tán dung môi nhũ tương hóa El-Shabouri báo cáo nano chitosan đƣợc điều chế bằng phƣơng pháp khuếch tán dung môi nhũ tƣơng, (Ban đầu đƣợc phát triển bởi Niwa và cộng sự sử dụng PLGA) [7].
Phƣơng pháp này đƣợc dựa trên một phần sự trộn lẫn của dung môi hữu cơ bằng nƣớc. Nhũ tƣơng thu đƣợc sau khi trộn chất hữu cơ vào dung dịch chitosan có chứa một chất ổn định (poloxamer) khuấy cơ, tiếp theo là đồng nhất áp suất cao. Nhũ tƣơng này sau đó đƣợc pha loãng với một số lƣợng lớn nƣớc để khắc phục sự trộn lẫn dung môi hữu cơ trong nƣớc. Sự kết tủa polymer xuất hiện nhƣ là kết quả của sự khuếch tán dung môi hữu cơ vào trong nƣớc, dẫn đến hình thành của các hạt nano.
Phƣơng pháp này phù hợp cho các loại thuốc kỵ nƣớc và cho thấy tỷ lệ ngậm thuốc cao. Những nhƣợc điểm chính của phƣơng pháp này bao gồm điều kiện xử lý khắc nghiệt (ví dụ, việc sử dụng các dung môi hữu cơ) và lực cắt cao đƣợc sử dụng khi điều chế các hạt nano. Phương pháp polyelectrolyte complex (PEC) Màng polyelectrolyte hoặc tập hợp nhóm polyelectrolyte là một thuật ngữ để mô tả màng đƣợc hình thành bằng cách tự lắp ráp của polyme mang cation và DNA plasmid. Cơ chế của PEC hình thành liên quan đến việc trung hòa điện tích giữa cation polymer và DNA dẫn phá vỡ phân tử ƣa nƣớc.
Một số polyme cation (tức là gelatin, polyethylenimine) cũng có tính chất này. Nói chung, kỹ thuật này cung cấp phƣơng pháp chuẩn bị đơn giản. Các hạt nano đƣợc hình thành một cách tự nhiên sau khi bổ 11 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com sung các DNA vào chitosan hòa tan trong dung dịch axit axetic, theo khuấy cơ học ở nhiệt độ phòng. Kích thƣớc phức hợp có thể đƣợc thay đổi từ 50 nm đến 700 nm.
Hoạt tính đối kháng vi sinh vật của chitosan Khả năng đối kháng vi sinh vật của chitosan đƣợc sử dụng rộng rãi, tuy nhiên, cơ chế đối kháng vi sinh vật chính xác của nó cho đến nay vẫn chƣa đƣợc xác định rõ ràng. Một vài cơ chế tác động kháng khuẩn của chitosan đã đƣợc đƣa ra: (i) tạo phức với các nguyên tố vết hoặc các chất dinh dƣỡng thiết yếu, nhƣ vậy ức chế sinh trƣởng của vi khuẩn; (ii) có thể tƣơng tác với các nhóm anion trên bề mặt tế bào và tạo ra các phức hợp điện phân với các hợp chất trên bề mặt vi khuẩn, tạo ra một lớp không thấm quanh tế bào, ngăn cản sự vận chuyển của các chất hòa tan cần thiết vào trong tế bào.