Khóa luận ảnh hưởng của vitamin C lên ức chế enzyme PPO ở tôm thẻ chân trắng ĐH SPKT TP.HCM

Đồ án nghiên cứu hcmute khảo sát ảnh hưởng của vitamin c lên sự ức chế enzyme polyphenoloxydase và sự thay đổi chất, thiết kế chi tiết, tính toán kỹ thuật theo tiêu chuẩn, đánh

• Tác giả: Phạm Thị Ánh Hồng
• Người hướng dẫn: TS. Phan Thị Anh Đào
• Trường học: Trường Đại Học Sư Phạm Kỹ Thuật Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công Nghệ Thực Phẩm
• Đề tài: Khảo Sát Ảnh Hưởng Của Vitamin C Lên Sự Ức Chế Enzyme Polyphenoloxydase Và Sự Thay Đổi Chất Lượng Tôm Thẻ Chân Trắng Trong Bảo Quản Lạnh
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Thành Phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tổng quan về tôm thẻ chân trắng
• 1.2. Đặc điểm sinh học
• 1.3. Thành phần hóa học
• 1.4. Giá trị kinh tế
• 1.5. Các biến đổi trong quá trình bảo quản lạnh tôm thẻ chân trắng
• 1.6. Tổng quan về enzyme polyphenoloxydase (PPO)
• 1.7. Các phương pháp bảo quản tôm
• 1.8. Tổng quan về vitamin C
• 1.9. Định hướng nghiên cứu
• 1.10. Tình hình nghiên cứu ứng dụng phụ gia bảo quản tôm đông lạnh
• 1.11. Định hướng nghiên cứu sử dụng vitamin C trong bảo quản tôm đông lạnh
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Nguyên liệu: Tôm thẻ chân trắng
• 2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị
• 2.3. Nội dung nghiên cứu
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.5. Trích ly enzyme PPO từ phần đầu ngực của tôm thẻ chân trắng và thử hoạt tính ức chế PPO của vitamin C
• 2.6. Khảo sát nồng độ vitamin C tối ưu sử dụng trong bảo quản tôm
• 2.7. Ứng dụng nồng độ vitamin C tối ưu trong bảo quản tôm
• 2.8. Xác định các chỉ tiêu vi sinh
• 2.9. Xác định các chỉ tiêu hóa lý
• 2.10. Phương pháp xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả trích ly enzyme PPO
• 3.2. Kết quả xác định khối lượng phân tử PPO
• 3.3. Kết quả xác định hoạt độ PPO
• 3.4. Kết quả xác định hoạt tính khử của vitamin C
• 3.5. Kết quả xác định khả năng ức chế enzyme PPO của vitamin C
• 3.6. Kết quả tối ưu nồng độ vitamin C ứng dụng trong bảo quản tôm
• 3.7. Kết quả xác định pH
• 3.8. Kết quả xác định khả năng ức chế quá trình peroxide hóa lipid bằng phương pháp TBARS
• 3.9. Kết quả đánh giá cảm quan điểm biến đen
• 3.10. Kết quả so sánh mẫu vitamin C tối ưu với mẫu đối chứng và mẫu phụ gia SMS
• 3.11. Kết quả xác định sự thay đổi pH
• 3.12. Kết quả xác định giá trị TBARS
• 3.13. Kết quả đánh giá cảm quan biến đen
• 3.14. Kết quả xác định các chỉ tiêu vi sinh
• 3.15. Kết quả xác định các chỉ tiêu hóa lý
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• 4.1. Định hướng nghiên cứu
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về vitamin C

Vitamin C, hay còn gọi là axit ascorbic, là một vitamin thiết yếu cho cơ thể con người. Nó đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh học, bao gồm tổng hợp collagen, hấp thụ sắt và hoạt động như một chất chống oxy hóa. Trong ngành thực phẩm, vitamin C được sử dụng rộng rãi như một chất bảo quản tự nhiên, giúp ngăn chặn sự oxy hóa và kéo dài thời gian bảo quản thực phẩm. Nghiên cứu cho thấy tác dụng của vitamin C trong việc ức chế hoạt động của enzyme polyphenoloxydase (PPO), một enzyme gây ra hiện tượng biến đen ở thực phẩm, đặc biệt là trong tôm thẻ chân trắng. Việc sử dụng vitamin C trong bảo quản tôm không chỉ giúp duy trì chất lượng mà còn cải thiện giá trị dinh dưỡng của sản phẩm. Theo một nghiên cứu, nồng độ vitamin C tối ưu cho việc bảo quản tôm thẻ chân trắng là 0,05%, cho thấy khả năng ức chế hoạt động của enzyme polyphenoloxydase và giảm thiểu sự phát triển của vi sinh vật gây hại.

1.1. Cơ chế hoạt động của vitamin C

Vitamin C hoạt động chủ yếu thông qua cơ chế khử, giúp ngăn chặn quá trình oxy hóa lipid và protein trong thực phẩm. Khi vitamin C được thêm vào tôm thẻ chân trắng, nó sẽ tương tác với các gốc tự do và các hợp chất oxy hóa, từ đó làm giảm thiểu sự hình thành của các sản phẩm oxy hóa có hại. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng tác động của vitamin C không chỉ giúp bảo quản chất lượng tôm mà còn cải thiện cảm quan của sản phẩm. Việc sử dụng vitamin C trong bảo quản tôm thẻ chân trắng đã cho thấy sự giảm thiểu đáng kể trong chỉ số TBARS, một chỉ số quan trọng để đánh giá mức độ oxy hóa lipid. Điều này chứng tỏ rằng vitamin C có khả năng bảo vệ tôm khỏi sự hư hỏng do oxy hóa, từ đó kéo dài thời gian bảo quản và duy trì chất lượng sản phẩm.

II. Enzyme polyphenoloxydase và vai trò của nó trong bảo quản tôm

Enzyme polyphenoloxydase (PPO) là một enzyme quan trọng trong quá trình oxy hóa phenolic, dẫn đến hiện tượng biến đen ở nhiều loại thực phẩm, bao gồm cả tôm thẻ chân trắng. Hoạt động của PPO có thể gây ra sự giảm chất lượng cảm quan và giá trị dinh dưỡng của tôm. Nghiên cứu cho thấy rằng việc ức chế hoạt động của enzyme polyphenoloxydase là một trong những phương pháp hiệu quả để bảo quản tôm. Vitamin C đã được chứng minh là một chất ức chế mạnh mẽ đối với PPO, giúp ngăn chặn sự oxy hóa và biến đổi màu sắc của tôm. Kết quả từ các thí nghiệm cho thấy rằng nồng độ vitamin C tối ưu có thể làm giảm đáng kể hoạt tính của PPO, từ đó cải thiện chất lượng tôm trong quá trình bảo quản lạnh. Việc hiểu rõ cơ chế hoạt động của enzyme polyphenoloxydase và cách mà vitamin C tác động lên enzyme này là rất quan trọng trong việc phát triển các phương pháp bảo quản hiệu quả cho tôm thẻ chân trắng.

2.1. Tác động của enzyme polyphenoloxydase đến chất lượng tôm

Hoạt động của enzyme polyphenoloxydase trong tôm thẻ chân trắng có thể dẫn đến sự hình thành các hợp chất không mong muốn, gây ra hiện tượng biến đen và giảm giá trị dinh dưỡng của sản phẩm. Khi tôm bị oxy hóa, không chỉ màu sắc mà còn hương vị và kết cấu của tôm cũng bị ảnh hưởng. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc kiểm soát hoạt động của PPO thông qua việc sử dụng vitamin C có thể làm giảm thiểu những tác động tiêu cực này. Các thí nghiệm cho thấy rằng tôm được bảo quản với vitamin C có chất lượng tốt hơn so với các mẫu không sử dụng chất bảo quản. Điều này cho thấy rằng việc ứng dụng vitamin C không chỉ giúp bảo quản tôm mà còn nâng cao giá trị cảm quan của sản phẩm, từ đó tạo ra lợi ích kinh tế cho ngành thủy sản.

III. Ứng dụng vitamin C trong bảo quản tôm thẻ chân trắng

Việc ứng dụng vitamin C trong bảo quản tôm thẻ chân trắng đã cho thấy nhiều lợi ích rõ rệt. Nghiên cứu cho thấy rằng vitamin C không chỉ giúp ức chế hoạt động của enzyme polyphenoloxydase mà còn cải thiện chất lượng cảm quan của tôm trong quá trình bảo quản lạnh. Các thí nghiệm đã chỉ ra rằng tôm được xử lý bằng vitamin C có chỉ số TBARS thấp hơn, cho thấy mức độ oxy hóa lipid thấp hơn so với các mẫu đối chứng. Điều này chứng tỏ rằng vitamin C có khả năng bảo vệ tôm khỏi sự hư hỏng do oxy hóa, từ đó kéo dài thời gian bảo quản và duy trì chất lượng sản phẩm. Hơn nữa, việc sử dụng vitamin C cũng an toàn cho sức khỏe người tiêu dùng và thân thiện với môi trường, điều này làm cho nó trở thành một lựa chọn lý tưởng cho ngành công nghiệp thực phẩm.

3.1. Nghiên cứu và kết quả ứng dụng

Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng nồng độ vitamin C tối ưu cho việc bảo quản tôm thẻ chân trắng là 0,05%. Tại nồng độ này, vitamin C đã cho thấy khả năng ức chế hoạt động của enzyme polyphenoloxydase và giảm thiểu sự phát triển của vi sinh vật gây hại. Các chỉ tiêu cảm quan và hóa lý của tôm được bảo quản bằng vitamin C đều tốt hơn so với mẫu đối chứng. Điều này cho thấy rằng việc ứng dụng vitamin C trong bảo quản tôm không chỉ giúp duy trì chất lượng mà còn nâng cao giá trị dinh dưỡng của sản phẩm. Kết quả này mở ra hướng đi mới cho việc phát triển các phương pháp bảo quản tự nhiên, an toàn và hiệu quả cho tôm thẻ chân trắng trong ngành công nghiệp thực phẩm.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Ngành xuất khẩu thủy sản của Việt Nam đóng vai trò then chốt trong nền kinh tế, trong đó tôm và các sản phẩm chế biến từ tôm luôn chiếm tỷ trọng lớn trong cơ cấu mặt hàng xuất khẩu. Năm 2013 ghi nhận bước chuyển quan trọng khi diện tích nuôi tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) tại 30 tỉnh thành đạt trên 66.000 ha với sản lượng gần 300.000 tấn, chính thức vượt qua tôm sú cả về sản lượng lẫn kim ngạch, đóng góp gần 60% trong tổng giá trị kim ngạch xuất khẩu tôm (khoảng 3 tỷ USD). Tuy nhiên, sau khi thu hoạch và trong chuỗi cung ứng bảo quản lạnh, tôm nguyên liệu chịu tác động tiêu cực của hiện tượng hóa đen (melanosis) và sự ươn hỏng do quá trình peroxide hóa lipid. Hiện tượng này làm suy giảm nghiêm trọng giá trị cảm quan, dinh dưỡng và giá trị thương phẩm.

Phương pháp phổ biến nhất trong công nghiệp hiện nay nhằm ngăn chặn biến đen là sử dụng phụ gia hóa học sodium metabisulfite (SMS). Mặc dù có hiệu quả cao, hợp chất này lại tiềm ẩn nhiều nguy cơ đối với sức khỏe con người, đã bị các cơ quan quốc tế như ACGIH, DOT, NIOSH và IARC cảnh báo về khả năng gây kích ứng niêm mạc, dị ứng đường hô hấp và hen suyễn khi phơi nhiễm kéo dài. Do đó, nhu cầu tìm kiếm các chất kháng oxy hóa có nguồn gốc tự nhiên, an toàn sinh học và giá thành hợp lý là một đòi hỏi cấp thiết của ngành công nghệ thực phẩm. Vitamin C (acid ascorbic) được lựa chọn nghiên cứu nhờ khả năng khử mạnh, tính sẵn có và mức độ lành tính cao đối với người tiêu dùng.

Nhiệm vụ của khóa luận được phân định thành 7 nội dung cụ thể:

1. Tổng quan cơ sở lý thuyết về tôm thẻ chân trắng, các biến đổi sinh hóa trong quá trình bảo quản tôm, các phương pháp bảo quản phổ biến; tổng quan về vitamin C và hoạt tính sinh học của hợp chất này.
2. Điều chế enzyme polyphenoloxydase (PPO) từ phần đầu ngực của tôm thẻ chân trắng, xác định hoạt tính của PPO và xác định khối lượng phân tử của enzyme bằng kỹ thuật sắc ký lọc gel.
3. Khảo sát khả năng ức chế enzyme PPO của vitamin C trong điều kiện phòng thí nghiệm.
4. Xác định hoạt tính khử của vitamin C thông qua thử nghiệm quang phổ.
5. Khảo sát khả năng bảo quản tôm của vitamin C ở các nồng độ khác nhau bằng phương pháp thử hoạt tính kháng oxy hóa TBARS, từ đó chọn ra nồng độ xử lý tối ưu.
6. Khảo sát ảnh hưởng của vitamin C ở nồng độ tối ưu lên chất lượng tôm thẻ chân trắng, tiến hành so sánh đối chứng với mẫu ngâm nước và mẫu xử lý bằng phụ gia sodium metabisulfite (SMS) thông qua các chỉ tiêu: giá trị TBARS, biến đổi pH, đánh giá cảm quan điểm biến đen trong 7 ngày bảo quản ở nhiệt độ 2°C.
7. Đánh giá số ngày bảo quản tối đa của mẫu tôm sử dụng vitamin C; xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí, vi khuẩn lạnh (Pseudomonas aeruginosa, Enterobacteriaceae) và các chỉ tiêu đạm sau 5 ngày bảo quản ở 2°C.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei), kích cỡ đồng đều 50 - 60 con/kg, thu mua sống tại chợ Việt Thắng (quận Thủ Đức, TP. Hồ Chí Minh), duy trì oxy trong suốt quá trình vận chuyển về phòng thí nghiệm.
• Phạm vi thời gian: Thực hiện từ ngày 06/02/2017 đến ngày 31/07/2017.
• Phạm vi không gian: Khóa luận được bố trí thực nghiệm tại Phòng thí nghiệm Hóa hữu cơ, Phòng thí nghiệm Hóa sinh, Xưởng Công nghệ Thực phẩm thuộc Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật TP. Hồ Chí Minh; Viện Khoa học Vật liệu ứng dụng TP. Hồ Chí Minh (quận 12); Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQG TP. Hồ Chí Minh (quận 5); và Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh (quận 3).

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết của đề tài tập trung vào động học phân giải sau chết của động vật giáp xác và cơ chế xúc tác enzyme:

• Biến đổi sinh hóa - hóa học: Sau khi chết, tôm trải qua các giai đoạn biến đổi gồm tiết chất nhớt, phân giải glycogen yếm khí qua chu trình Embden - Meyerhof - Parnas tạo acid lactic làm hạ pH tạm thời, kế tiếp là quá trình tự phân giải (autolysis) giải phóng amoniac ($NH_3$), dẫn đến sự tăng pH trở lại và thối rữa do vi sinh vật. Quá trình peroxide hóa lipid diễn ra khi oxy đơn bội hoặc gốc tự do tấn công acid béo chưa bão hòa, tạo hydroperoxide và phân hủy thứ cấp thành malondialdehyde (MDA).
• Cơ chế hình thành melanosis: Enzyme polyphenoloxydase (PPO, hay tyrosinase, EC 1.1) là enzyme oxy hóa khử có chứa hai ion đồng ($Cu_A$ và $Cu_B$) tại trung tâm xúc tác, liên kết với các gốc histidine. PPO xúc tác phản ứng hydroxyl hóa monophenol thành o-diphenol và tiếp tục oxy hóa o-diphenol thành o-benzoquinone; các quinone này tiếp tục trùng hợp phi enzyme tạo thành sắc tố melanin màu nâu đen.
• Cơ chế tác dụng của Vitamin C: Acid ascorbic ($C_6H_8O_6$, phân tử lượng 176,13 g/mol) có cấu trúc enediol ở vị trí carbon 2 và 3. Khi tiếp xúc với tác nhân oxy hóa, vitamin C nhường 2 electron tạo thành gốc ascorbyl trơ sinh học và acid dehydro-L-ascorbic. Hợp chất này ngăn chặn hóa nâu bằng cách khử ngược o-quinone về dạng o-diphenol ban đầu hoặc gây ức chế hoạt tính xúc tác của PPO.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm bao gồm:

• Phương pháp tách chiết enzyme PPO: Dựa trên quy trình cải tiến của Nirmal & Benjakul (2009a) và Simpson et al. (1987). Phần đầu ngực tôm được ngâm lạnh đông nhanh trong nitơ lỏng (-196°C), xay khô thành bột mịn. Chiết rút bằng đệm phosphate 0,05 M (pH 7,2) chứa NaCl 1,0 M và Brij-35 0,2%. Dịch chiết được ly tâm phân đoạn, tủa protein bằng ammonium sulfate $(NH_4)_2SO_4$ ở độ bão hòa 40%, sau đó thẩm tích bằng màng bán thấm ở 4°C trong 24 giờ để loại muối, thu cao trích PPO thô.
• Phương pháp đo hoạt độ PPO: Sử dụng chất nền L-DOPA (L-β-(3,4 dihydroxylphenyl) alanine) 15 mM trong môi trường đệm phosphate 0,05 M (pH 6,0), ủ ở 45°C trong 3 phút và đo độ hấp thu ở bước sóng 475 nm bằng máy quang phổ UV-Vis. Hoạt độ được tính theo công thức: $$A = \frac{\Delta A_{475}}{K \times m \times T}$$ Trong đó $K = 0,001$; $m$ là khối lượng enzyme (mg); $T$ là thời gian (phút).
• Phương pháp sắc ký lọc gel: Xác định khối lượng phân tử PPO trên hệ thống sắc ký với cột Ultrahydrogel 500 ($300 \times 7,8$ mm ID), pha động $KNO_3$ 0,5 M, tốc độ dòng 1,0 mL/phút, thể tích tiêm 20,0 µL, nhiệt độ cột 40°C, nhiệt độ đầu dò 35°C.
• Phương pháp đo hoạt tính khử của Vitamin C: Theo phương pháp của Negi et al., phối trộn mẫu với potassium ferricyanide 1% và đệm phosphate 2,0 M (pH 6,6), ủ 50°C trong 20 phút, bổ sung TCA 10%, ly tâm lấy dịch nổi phản ứng với $FeCl_3$ 0,1% và đo độ hấp thu tại bước sóng 700 nm.
• Phương pháp đánh giá peroxide hóa lipid (TBARS): Dựa trên phản ứng giữa MDA và thiobarbituric acid (TBA) theo tỷ lệ mol 1:2 trong môi trường acid trichloroacetic (TCA 7,5%) ở nhiệt độ 100°C trong 15 phút, tạo phức chất màu hồng hấp thu cực đại ở bước sóng 532 nm; định lượng thông qua đường chuẩn MDA xây dựng trong dải nồng độ 0,01 - 10,0 µg/mL.
• Phương pháp đo pH: Đồng hóa 2 g thịt tôm với 20 mL nước cất bằng máy đồng hóa IKA trong 1 phút, để ổn định 5 phút và đo trên máy đo pH Seven easy.
• Đánh giá cảm quan biến đen: Sử dụng phương pháp của Montero et al. với hội đồng gồm 11 chuyên viên đánh giá cảm quan được huấn luyện, phân cấp theo thang điểm 5 (Điểm 1: dưới 10% bề mặt; Điểm 2: khoảng 20%; Điểm 3: từ 20 - 40%; Điểm 4: từ 40 - 60%; Điểm 5: từ 60 - 100% diện tích bị đen).
• Phương pháp vi sinh và hóa lý: Tổng vi sinh vật hiếu khí theo TCVN 4884-1:2015 (ISO 4833-1:2013); định lượng Enterobacteriaceae theo TCVN 5518-2:2007 (ISO 21528-2:2004); định lượng Pseudomonas aeruginosa theo Quyết định số 3347/2001/QĐ-BYT; xác định hàm lượng nitơ tổng số và protein thô theo TCVN 3705:1990; xác định nitơ acid amin theo TCVN 3708:1990.
• Xử lý thống kê: Số liệu thí nghiệm được phân tích phương sai (ANOVA) và kiểm định khoảng phân vị Tukey HSD với mức ý nghĩa $p \le 0,05$ trên phần mềm Minitab.

Nguồn dữ liệu thực nghiệm hoàn toàn xuất phát từ việc cân đo, phân tích mẫu sinh học trực tiếp trong quá trình làm khóa luận với các hóa chất phân tích chuẩn quốc tế từ Sigma-Aldrich, Merck, Eagle Biosciences và Xilong Chemical.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này hệ thống hóa các đặc trưng sinh học và giá trị thương phẩm của tôm thẻ chân trắng, phân tích thành phần hóa học cơ bản (nước chiếm 70 - 80%, protein chiếm 70 - 80% chất khô chứa đầy đủ các acid amin không thay thế, lipid và glucid thấp chỉ 0,3 - 1,4%). Tác giả phân tích sâu cơ chế biến đen do enzyme PPO: PPO ở tôm tập trung ở phần đầu ngực, là một enzyme kim loại chứa đồng, hoạt động tối ưu ở pH 6,5 - 9,0 và nhiệt độ 40 - 45°C, kém bền nhiệt khi vượt quá 50°C và mất hoạt tính ở pH dưới 5,0.

Chương tổng quan cũng phân tích các phương pháp ức chế melanosis hiện hành, bao gồm bảo quản lạnh (-2 đến 5°C), lạnh đông sâu (-18°C trở xuống), sử dụng các chất chống oxy hóa tổng hợp (sulfite, sodium metabisulfite) và chất tự nhiên (trích ly trà xanh, catechin, acid ferulic, vitamin C). Tác giả làm rõ các nguy cơ bệnh lý khi người tiêu dùng tiếp xúc với dư lượng sulfite, từ đó khẳng định định hướng nghiên cứu ứng dụng vitamin C như một giải pháp thay thế an toàn cho sức khỏe.

Chương 2: Vật liệu và phương pháp

Chương 2 mô tả tường tận vật liệu nghiên cứu gồm tôm thẻ chân trắng sống cỡ 50 - 60 con/kg và các hệ thống thiết bị phân tích chuyên dụng (HPLC 1100 Agilent, máy quang phổ UV-Vis Hitachi, máy ly tâm lạnh Hermle, máy đo pH Seven easy, tủ sấy Memmert).

Bố cục nghiên cứu được thiết kế mạch lạc thành ba giai đoạn thực nghiệm liên hoàn:

• Giai đoạn 1: Tách chiết PPO từ đầu tôm qua xử lý nitơ lỏng, trích ly trong dung dịch đệm kiềm yếu, tủa muối $(NH_4)_2SO_4$ 40% và thẩm tích loại muối. Xác định phân tử lượng PPO qua sắc ký lọc gel, tính toán hoạt độ enzyme trên cơ chất L-DOPA, đo hoạt tính khử của vitamin C (ở các mức 0,1; 0,5; 1,0 mg/mL) và đo tỷ lệ ức chế enzyme PPO in vitro ở các nồng độ vitamin C 0,01%, 0,05%, 0,1%.
• Giai đoạn 2: Khảo sát lựa chọn nồng độ vitamin C tối ưu (0,025%, 0,05% và 0,1%) trong dung dịch ngâm tôm (tỷ lệ tôm/dung dịch là 1:2 w/v, thời gian để ráo 2 phút) được bảo quản ở 2°C trong 7 ngày. Các tiêu chí theo dõi hàng ngày gồm giá trị pH, mức peroxide hóa lipid TBARS và điểm đánh giá cảm quan mức độ hóa đen.
• Giai đoạn 3: Ứng dụng nồng độ vitamin C tối ưu đã tuyển chọn để bảo quản tôm ở 2°C trong 7 ngày, tiến hành đánh giá so sánh song song với hai nghiệm thức đối chứng: mẫu ngâm nước lã (đối chứng âm) và mẫu ngâm phụ gia sodium metabisulfite (SMS) 1,25% (đối chứng dương). Hệ thống tiêu chí kiểm tra bao gồm động thái thay đổi pH, giá trị TBARS, biến đổi cảm quan ngoại quan, mật độ vi sinh vật tổng số, định lượng vi khuẩn gây hỏng lạnh (Pseudomonas, Enterobacteriaceae), hàm lượng nitơ tổng số và nitơ acid amin.

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Nội dung chương 3 công bố đầy đủ các số liệu định lượng thu được từ các giai đoạn thực nghiệm:

• Hiệu suất trích ly PPO: Từ 800 g tôm tươi ban đầu, tách được 164 g đầu ngực bỏ vỏ và sau chu trình chiết xuất thu nhận được 1,1 g cao PPO thô dạng bột đông khô.
• Khối lượng phân tử của PPO: Kết quả sắc ký lọc gel trên cột Ultrahydrogel 500 xác định được phân tử lượng trung bình số $\bar{M}_n = 3,5063 \times 10^3$ g/mol, phân tử lượng trung bình khối $\bar{M}_w = 3,6933 \times 10^3$ g/mol, phân tử lượng trung bình nhớt $\bar{M}_v = 3,6933 \times 10^3$ g/mol và chỉ số phân tán $D = 1,0533$. Phân tử lượng trung bình số của nhóm phân tử chiếm 90% đạt $5,1094 \times 10^3$ g/mol (tương đương khoảng 5,1 kDa). Tác giả đối chiếu và thảo luận rằng giá trị 5,1 kDa thấp hơn đáng kể so với dải 20 - 25 kDa do Chen (1977) công bố; sự sai khác này được lý giải do giai đoạn phát triển sinh lý của tôm, điều kiện sinh thái môi trường sống tại Việt Nam và sự tồn dư tạp chất peptide có kích thước nhỏ trong dịch chiết thô.
• Hoạt độ enzyme PPO: Dựa trên độ biến thiên hấp thu quang tại bước sóng 475 nm từ 1,4676 (ở 0 giây) lên 1,4681 (ở 120 giây), tính toán theo công thức thực nghiệm cho thấy hoạt độ PPO thô đạt 1,25 units/mg enzyme. Giá trị này thấp hơn mức 21,2 units/mg ghi nhận trên PPO từ khoai tây (Yong et al.), phản ánh đặc trưng xúc tác của nguồn gốc sinh vật biển và mức độ tinh khiết của dịch trích.
• Hoạt tính khử và khả năng ức chế PPO của Vitamin C: Hoạt tính khử tăng dần theo nồng độ khảo sát (độ hấp thu quang ở 700 nm đạt $3,530 \pm 0,002$ ở 0,1 mg/mL; $4,065 \pm 0,003$ ở 0,5 mg/mL; $4,219 \pm 0,002$ ở 1,0 mg/mL). Trên cơ sở đó, khảo sát ức chế PPO cho thấy vitamin C làm giảm rõ rệt tốc độ tạo phức dopachrome.
• Tối ưu hóa nồng độ bảo quản: Trong 3 nồng độ khảo sát (0,025%, 0,05%, 0,1%), nghiệm thức vitamin C 0,05% thể hiện hiệu quả bảo quản vượt trội thông qua việc kìm hãm chỉ số TBARS, kiểm soát pH cơ thịt tốt và duy trì điểm cảm quan biến đen thấp nhất.
• So sánh hiệu quả bảo quản giữa các nghiệm thức:
  • Chỉ số TBARS (phản ánh mức độ ôi hóa lipid): Mẫu đối chứng đạt cực đại vào ngày thứ 4 với 6,225 mg MDA/kg thịt tôm; mẫu ngâm vitamin C 0,05% kìm hãm sự oxy hóa, dời điểm cực đại đến ngày thứ 5 với giá trị 6,025 mg MDA/kg; trong khi mẫu xử lý SMS 1,25% duy trì ức chế tốt nhất khi dời đỉnh TBARS đến ngày thứ 6 với 6,298 mg MDA/kg.
  • Đánh giá cảm quan biến đen: Vào ngày bảo quản thứ 7, mẫu vitamin C 0,05% đạt 4,3 điểm, tốt hơn mẫu đối chứng ngâm nước (4,7 điểm - mức đen nặng gần như toàn bộ vỏ), song kém hơn mẫu SMS (3,7 điểm).
  • Biến đổi pH và vi sinh vật: Thịt tôm xử lý bằng vitamin C duy trì độ pH ổn định hơn và có tổng số vi sinh vật hiếu khí cũng như khuẩn lạnh thấp hơn mẫu đối chứng và mẫu SMS nhờ đặc tính acid hữu cơ nhẹ của dung dịch ngâm.

Chương 4: Kết luận và kiến nghị

Tác giả tổng kết các kết quả đạt được, khẳng định vitamin C ở nồng độ 0,05% có tác dụng làm chậm quá trình ươn hỏng hóa học và ức chế phần nào melanosis trên tôm thẻ chân trắng ở 2°C. Các kiến nghị tập trung vào việc nghiên cứu thêm các kỹ thuật tinh sạch sâu enzyme PPO và phối hợp vitamin C với các phụ gia tự nhiên khác nhằm nâng cao hơn nữa thời gian bảo quản thương phẩm.

Kết quả và đóng góp

Khóa luận đã cung cấp hệ thống số liệu thực nghiệm đầy đủ về đặc tính lý hóa của enzyme PPO và hiệu quả bảo quản tôm của vitamin C.

Bảng tổng hợp kết quả phân tích phân tử lượng PPO bằng sắc ký lọc gel:

Đại lượng đo	Ký hiệu	Đơn vị	Kết quả
Phân tử lượng trung bình số	$\bar{M}_n$	g/mol	$3,5063 \times 10^3$
Phân tử lượng trung bình khối	$\bar{M}_w$	g/mol	$3,6933 \times 10^3$
Phân tử lượng trung bình nhớt	$\bar{M}_v$	g/mol	$3,6933 \times 10^3$
Chỉ số phân tán	$D$	-	$1,0533$
Phân tử lượng phân đoạn 10%	-	g/mol	$2,8300 \times 10^3$
Phân tử lượng phân đoạn 30%	-	g/mol	$3,1746 \times 10^3$
Phân tử lượng phân đoạn 50%	-	g/mol	$3,4426 \times 10^3$
Phân tử lượng phân đoạn 70%	-	g/mol	$3,7754 \times 10^3$
Phân tử lượng phân đoạn 90%	-	g/mol	$5,1094 \times 10^3$

Bảng đo độ hấp thu quang thể hiện hoạt tính khử của vitamin C (Mean ± SD, n = 3):

Nồng độ Vitamin C (mg/mL)	Độ hấp thu tại 700 nm (Abs)
0,1	$3,530 \pm 0,002$
0,5	$4,065 \pm 0,003$
1,0	$4,219 \pm 0,002$

Bảng so sánh các chỉ tiêu bảo quản chính sau 7 ngày ở 2°C giữa các nghiệm thức:

Chỉ tiêu theo dõi	Mẫu đối chứng (Nước)	Mẫu Vitamin C (0,05%)	Mẫu phụ gia SMS (1,25%)
Thời điểm đạt đỉnh TBARS	Ngày thứ 4	Ngày thứ 5	Ngày thứ 6
Giá trị TBARS cực đại (mg MDA/kg)	6,225	6,025	6,298
Điểm cảm quan biến đen ngày thứ 7	4,7	4,3	3,7
Kiểm soát vi sinh vật hiếu khí	Trung bình	Tốt nhất	Trung bình

Giải pháp tác giả đề xuất: Sử dụng dung dịch vitamin C ở nồng độ 0,05% để ngâm tôm theo tỷ lệ tôm/dung dịch là 1:2 (w/v) trong thời gian 15 phút, sau đó vớt ra để ráo 2 phút trước khi đóng gói bảo quản lạnh ở 2°C.

Đóng góp mới mà tác giả tự khẳng định:

• Khảo sát thực nghiệm và xác lập được quy trình trích ly enzyme PPO từ nguồn nguyên liệu đầu tôm thẻ chân trắng địa phương tại TP. Hồ Chí Minh; xác định được phân tử lượng phân bố và hoạt độ riêng phần của PPO thô trên cơ chất L-DOPA.
• Định lượng hóa hoạt tính khử và khả năng ức chế trực tiếp enzyme PPO của vitamin C trong điều kiện phòng thí nghiệm.
• Xác lập được nồng độ vitamin C tối ưu (0,05%) và chứng minh trên cơ sở thực nghiệm rằng vitamin C có khả năng làm chậm quá trình oxy hóa chất béo (kéo dài thời điểm đạt đỉnh TBARS thêm 24 giờ so với đối chứng), hạn chế gia tăng pH và ức chế mật độ vi sinh vật gây hại trong suốt 7 ngày bảo quản lạnh ở 2°C.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận đã nêu rõ các giới hạn tồn tại trong quá trình thực nghiệm:

• Dịch chiết enzyme PPO thu nhận từ đầu ngực tôm mới dừng lại ở mức dịch chiết thô qua tủa ammonium sulfate và thẩm tích loại muối, chưa qua các bước tinh sạch sâu bằng sắc ký trao đổi ion hoặc sắc ký ái lực. Do đó, chế phẩm còn lẫn nhiều protein và peptide tạp, dẫn đến kết quả khối lượng phân tử sắc ký gel phân tán (~5,1 kDa) và hoạt độ đo được (1,25 units/mg) chưa phản ánh hoàn toàn hoạt lực tự nhiên của enzyme tinh khiết.
• Mặc dù vitamin C có khả năng kìm hãm sự tăng sinh vi sinh vật và giảm tốc độ oxy hóa chất béo tốt hơn mẫu đối chứng, song hiệu quả ngăn ngừa biến đen cảm quan của vitamin C đơn lẻ (4,3 điểm) vẫn kém hơn phụ gia hóa học truyền thống sodium metabisulfite (3,7 điểm). Nguyên nhân là do bản chất vitamin C bị tiêu hao nhanh khi tiếp xúc với oxy phân tử trong môi trường bảo quản hở.

Hướng mở rộng được đề xuất:

• Hoàn thiện quy trình tinh sạch để thu nhận enzyme PPO có độ tinh khiết cao nhằm xác định chính xác hằng số động học $K_m$ và $V_{max}$.
• Nghiên cứu kết hợp vitamin C với các hợp chất tự nhiên khác hoặc áp dụng kỹ thuật bao gói điều chỉnh khí quyển (MAP), màng bao sinh học ăn được (chitosan, alginate) nhằm hạn chế sự oxy hóa tự thân của vitamin C, tối ưu hóa khả năng chống biến đen tương đương với SMS.

Giá trị tham khảo

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Phạm Thị Ánh Hồng có giá trị tham khảo thiết thực cho nhiều nhóm đối tượng học thuật và ứng dụng:

• Sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu sinh thuộc các chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm, Công nghệ Sau thu hoạch, Bảo quản và Chế biến Thủy hải sản, Hóa sinh học: Tài liệu cung cấp cơ sở phương pháp luận rõ ràng về kỹ thuật tách chiết enzyme từ phế phụ liệu giáp xác, kỹ thuật phân tích biến đổi lipid và protein thủy sản.
• Các kỹ sư công nghệ, cán bộ nghiên cứu và phát triển (R&D) tại các nhà máy chế biến thủy sản: Đề tài cung cấp bộ dữ liệu thực nghiệm khách quan về tiềm năng cũng như giới hạn thực tế của việc sử dụng acid ascorbic nhằm định hướng lộ trình loại bỏ chất bảo quản gốc sulfite theo tiêu chuẩn "nhãn sạch" (clean label).
• Phần nội dung đáng tham khảo nhất:
  • Quy trình chi tiết điều chế PPO bằng phương pháp lạnh đông nitơ lỏng kết hợp kết tủa muối phân đoạn và thẩm tích loại muối tại Chương 2.
  • Quy trình xây dựng đường chuẩn MDA và thực hiện phản ứng so màu TBARS với TBA phục vụ kiểm soát chất lượng ôi khét của thịt tôm trong quá trình lưu kho.

Câu hỏi thường gặp

1. Phân tử lượng của enzyme PPO tách chiết từ tôm thẻ chân trắng trong nghiên cứu này được xác định là bao nhiêu và có điểm gì khác so với các nghiên cứu trước?

Kết quả phân tích sắc ký lọc gel trên cột Ultrahydrogel 500 cho thấy phân tử lượng trung bình số chiếm 90% các phân tử trong mẫu PPO thô là $5,1094 \times 10^3$ g/mol (~5,1 kDa). Kết quả này thấp hơn nhiều so với giá trị 20 - 25 kDa do Chen (1997) công bố trên tôm thẻ chân trắng. Nguyên nhân được tác giả lý giải là do sự khác biệt về độ tuổi phát triển của tôm, điều kiện sinh thái môi trường và enzyme sau trích ly vẫn ở dạng thô, còn lẫn các mảnh phân tử peptide nhỏ.

2. Nồng độ vitamin C nào được lựa chọn là tối ưu để xử lý tôm trước khi bảo quản lạnh ở 2°C?

Nồng độ vitamin C tối ưu được chọn là 0,05%. Ở nồng độ này, mẫu tôm đạt được sự cân bằng tối ưu giữa việc làm chậm tốc độ peroxide hóa chất béo (kìm hãm chỉ số TBARS), duy trì độ pH ổn định và đạt điểm đánh giá cảm quan ngăn ngừa biến đen tốt nhất trong số các dải nồng độ thử nghiệm (0,025%, 0,05% và 0,1%).

3. Động thái tích lũy chỉ số TBARS của mẫu ngâm Vitamin C 0,05% khác biệt thế nào so với mẫu đối chứng và mẫu dùng phụ gia SMS?

Mẫu đối chứng không xử lý đạt đỉnh tích lũy sản phẩm peroxide hóa MDA sớm nhất vào ngày bảo quản thứ 4 với giá trị 6,225 mg MDA/kg thịt tôm. Mẫu xử lý vitamin C 0,05% kéo dài thêm 1 ngày trước khi đạt đỉnh cực đại vào ngày thứ 5 với giá trị 6,025 mg MDA/kg thịt tôm. Mẫu xử lý SMS 1,25% duy trì ức chế tốt nhất khi dời đỉnh TBARS đến ngày thứ 6 với giá trị 6,298 mg MDA/kg thịt tôm.

4. Hoạt độ riêng phần của enzyme PPO thô đo được trên cơ chất L-DOPA trong khóa luận là bao nhiêu?

Hoạt độ của PPO thô được xác định thông qua sự biến thiên độ hấp thu ở bước sóng 475 nm với cơ chất L-DOPA 15 mM, đạt kết quả 1,25 units/mg enzyme. Trị số này thấp hơn đáng kể so với enzyme PPO chiết xuất từ khoai tây của Yong et al. (21,2 units/mg enzyme), phản ánh nồng độ enzyme thực tế còn thấp trong cao trích thô.

5. Kết quả đánh giá cảm quan điểm biến đen vào ngày bảo quản thứ 7 giữa các nghiệm thức chênh lệch ra sao?

Vào ngày thứ 7 bảo quản ở 2°C, mẫu ngâm vitamin C tối ưu (0,05%) đạt điểm cảm quan biến đen là 4,3 điểm, cho chất lượng ngoại quan tốt hơn mẫu đối chứng ngâm nước lã (4,7 điểm - diện tích đen chiếm trên 60% bề mặt). Tuy nhiên, mức độ ngăn chặn biến đen của vitamin C vẫn thấp hơn so với mẫu ngâm phụ gia hóa học sodium metabisulfite SMS (đạt 3,7 điểm).

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Phạm Thị Ánh Hồng đã giải quyết trọn vẹn nhiệm vụ khảo sát đặc tính sinh hóa của enzyme polyphenoloxydase và đánh giá tiềm năng ứng dụng của vitamin C trong bảo quản tôm thẻ chân trắng lạnh đông. Bằng chuỗi thực nghiệm chuẩn xác từ trích ly PPO, đo phân tử lượng bằng sắc ký lọc gel đến đánh giá các chỉ số TBARS, pH, vi sinh và cảm quan, nghiên cứu đã chứng minh nồng độ vitamin C 0,05% có tác dụng rõ rệt trong việc làm chậm quá trình oxy hóa lipid và ức chế sự sinh trưởng của vi sinh vật gây hỏng trong 7 ngày bảo quản ở 2°C. Mặc dù khả năng ngăn ngừa biến đen đơn lẻ chưa vượt qua được phụ gia hóa học sodium metabisulfite, các kết quả thu được đã đặt nền móng dữ liệu thực nghiệm quan trọng cho các nghiên cứu kết hợp phụ gia tự nhiên trong tương lai. Công trình là tài liệu tham khảo có giá trị chuyên môn cao cho sinh viên và giới nghiên cứu trong lĩnh vực chế biến, bảo quản thủy hải sản.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về tôm thẻ chân trắng 1. Đặc điểm sinh học 1. Tên gọi  Tên khoa học: Lipopenaeus vannamei hay Penaeus vannamei (Boone, 2011)  Tên tiếng Anh: White Shrimp  Tên tiếng Việt: Tôm thẻ chân trắng, tôm bạc Thái Bình Dương, tôm bạc Tây châu Mỹ.

Phân loại khoa học  Ngành: Arthropoda  Lớp: Malacostraca  Bộ: Decapoda  Họ: Penaeidae  Chi: Litopenaeus  Loài: Lipopenaeus vannamei (Boone, 2011) 1. Nguồn gốc và phân bố Tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei, tên gọi trước đây Penaeus vannamei) là một dạng của tôm panđan của vùng đông Thái Bình Dương thường được đánh bắt hoặc nuôi làm thực phẩm. Ở Việt Nam, tôm thẻ chân trắng tập trung chủ yếu ở các tỉnh Nam Trung Bộ đặc biệt là Ninh Thuận, Bình Thuận, Khánh Hòa, Phú Yên và các tỉnh Đồng bằng Sông Cửu Long. Tôm thẻ chân trắng là một trong những loài tôm được nuôi rộng rãi nhất trên thế giới.

Điều này là do chúng dễ nuôi và thời gian sinh trưởng nhanh, thời gian thu hoạch từ 120 ngày. Chấ t lươ ̣ng tôm thẻ chân trắ ng nuôi thường rấ t cao, vì có sự kiể m soát chă ̣t chẽ và không qua bảo quản như loại đánh bắ t từ biển. Đặc điểm hình thái Hình 1. Tôm thẻ chân trắng.

Nguồn: (Internet) Tôm thẻ chân trắng có màu trắng đục (hình 1.1) nên còn có tên là tôm Bạc, bình thường có màu xanh lam, chân bò có màu trắng ngà nên gọi là tôm chân trắng. Chùy là phần kéo dài tiếp với bụng. Dưới chùy có 2 – 4 răng cưa, đôi khi có tới 5 – 6 răng cưa ở phía bụng. Những răng cưa đó kéo dài, đôi khi tới đốt thứ hai.

(Boone, 2011) Vỏ đầu ngực có những gai gân và gai râu rất rõ, không có gai mắt và gai đuôi (gai telson), không có rãnh sau mắt, đường gờ sau chùy khá dài đôi khi từ mép sau vỏ đầu ngực. Gờ bên chùy ngắn, chỉ kéo dài tới gai thượng vị. Có sáu đốt bụng, ở đốt mang trứng, rãnh bụng rất hẹp hoặc không có. Gai đuôi không phân nhánh.

Râu không có gai phụ và chiều dài râu ngắn hơn nhiều so với vỏ giáp. Xúc biện của hàm dưới thứ nhất thon dài và thường có 3 – 4 hàng, phần cuối cùng của xúc biện có hình roi. Gai gốc (basial) và gai ischial nằm ở đốt thứ nhất chân ngực. Môi trường sống Ở vùng biển tự nhiên, tôm thẻ chân trắng sống nơi đáy bùn, độ sâu khoảng 72 m, có thể sống ở độ mặn trong phạm vi 5 – 50‰, thích hợp ở độ mặn nước biển 28 – 34‰, pH = 7,7 – 8,3; nhiệt độ thích hợp 25 – 32oC.

Thành phần hóa học Tôm là loại thực phẩm được ưa chuộng trên thế giới, vì tôm có giá trị dinh dưỡng cao, thơm ngon hơn so với cá và một số động vật trên cạn. Thành phần hóa học của thịt tôm gồm: protein, lipid, glucid, chất khoáng, vitamin, enzyme và hormone. Thành phần có hàm lượng cao là nước, protein, lipid và chất khoáng, hàm lượng glucide trong tôm rất ít và tồn tại dưới dạng glycogen. Ngoài ra trong tôm còn chứa một lượng carbohydrate khoảng 1 – 2%.

(Nguyễn Trọng Cẩn, Đỗ Minh Phụng, 1990) 2 do an Bảng 1. Thành phần hóa học của tôm thẻ chân trắng Nguồn: (Vũ Trọng Cẩn, Đỗ Minh Phụng, 1990) Thành phần Đặc điểm Chiếm 70 – 80% trọng lượng tôm. Giúp thân tôm mềm, bóng mượt. Nước Là môi trường hoạt động của vi sinh vật.

Đóng vai trò quan trọng trong chế biến và bảo quản. Thành phần chủ yếu trong cơ thịt, chiếm 70 – 80% trọng lượng khô. Thành phần cấu tạo là các acid amin không thay thế (tryptophan, Protein lysine, threonine, isoleusine, leusine, phenylalanine, methionine, valine).