Luận văn: Xác định Ibuprofen, Diclofenac trong nước bằng phương pháp điện di mao quản

Luận văn trình bày phương pháp điện di mao quản để xác định nồng độ các thuốc giảm đau ibuprofen, diclofenac, naproxen trong mẫu nước và kết quả.

• Tác giả: Phạm Mạnh Hùng
• Người hướng dẫn: GS.TS Phạm Hùng Việt
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Hóa phân tích
• Đề tài: Nghiên cứu xác định nồng độ hoạt chất một số thuốc giảm đau (Ibuprofen, Diclofenac, Naproxen, Bezafibrate) trong mẫu nước bằng phương pháp Điện di mao quản
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Phương pháp điện di mao quản và ứng dụng xác định thuốc giảm đau

Điện di mao quản (CE) là một phương pháp phân tích hiện đại dựa trên sự phân tách các chất dựa vào khác biệt về điện tích và kích thước phân tử. Phương pháp này có ưu điểm nổi bật trong việc xác định nồng độ hoạt chất trong nước, đặc biệt là các thuốc chống viêm không steroid như ibuprofen, diclofenac, naproxen và bezafibrate. Điện di mao quản cung cấp độ phân giải cao, tiêu tốn lượng mẫu nhỏ và cho thời gian phân tích nhanh. Các thuốc giảm đau này thường được phát hiện trong các mẫu nước môi trường do việc sử dụng rộng rãi và lượng thải nhỏ nhưng liên tục vào hệ thống nước thải. Sự xuất hiện của các chất này trong nước đòi hỏi các phương pháp phân tích chính xác và độ nhạy cao để đánh giá tác động môi trường.

1.1. Nguyên tắc hoạt động của điện di mao quản

Điện di mao quản hoạt động dựa trên nguyên tắc tách chất dựa vào điện tích khi áp dụng điện thế giữa hai đầu của một mao quản rất mỏng (đường kính 25-75 μm). Dung dịch đệm điện di tạo ra môi trường với pH và độ dẫn điện xác định, cho phép các phân tử mang điện chuyển động với tốc độ khác nhau. Detector độ dẫn không tiếp xúc được sử dụng để phát hiện các chất phân tách, cho phép đo nồng độ chính xác các hoạt chất thuốc.

1.2. Ưu điểm của phương pháp trong phân tích nước

So với sắc ký khí (GC) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), điện di mao quản cung cấp hiệu quả tách tốt hơn, chi phí thấp hơn và không cần sử dụng hóa chất độc hại quá nhiều. Phương pháp này giảm thiểu ảnh hưởng của các chất gây nhiễu trong mẫu nước tự nhiên, cho phép phát hiện đơn vị ppb (parts per billion). Tính di động của thiết bị điện di mao quản xách tay giúp thực hiện phân tích nhanh chóng tại hiện trường hoặc phòng thí nghiệm.

II. Các thuốc giảm đau và tác hại môi trường

Ibuprofen, diclofenac, naproxen và bezafibrate là những thuốc chống viêm không steroid (NSAID) được sử dụng phổ biến trên toàn thế giới để điều trị đau, viêm và sốt. Các thuốc này có tính ổn định cao nhưng khi đi vào môi trường nước qua nước tiểu, phân cứu và nước thải y tế, chúng không được phân hủy hoàn toàn bởi các quá trình xử lý truyền thống. Sự tích lũy của các chất dược phẩm trong nước gây ảnh hưởng tiêu cực đến các sinh vật thủy sinh, làm gián đoạn hệ thống nội tiết và gây kháng thuốc. Chính vì vậy, việc xác định nồng độ hoạt chất thuốc giảm đau trong nước là cần thiết để đánh giá và kiểm soát ô nhiễm môi trường.

2.1. Nguồn gốc và sự phát hiện thuốc giảm đau trong nước

Các dược phẩm giảm đau được phát hiện trong nước sông, nước ngầm và nước thải từ bệnh viện do việc sử dụng rộng rãi và quá trình chuyển hóa bất hoàn toàn trong cơ thể con người. Nước thải y tế và sinh hoạt chứa lượng ibuprofen, diclofenac, naproxen khá đáng kể (ng/L đến μg/L), vượt quá giới hạn an toàn cho hệ sinh thái nước ngọt.

2.2. Tác động sinh thái và sức khỏe

Sự phơi nhiễm với các thuốc chống viêm không steroid ở nồng độ thấp kéo dài gây tổn thương gan, thận, và ảnh hưởng đến khả năng sinh sản của cá và các sinh vật nước. Các nghiên cứu cho thấy bezafibrate tích tụ trong bioxo liên theo chuỗi thức ăn, tạo nguy hiểm lâu dài cho môi trường.

III. Quy trình xác định nồng độ bằng điện di mao quản

Quy trình xác định nồng độ hoạt chất thuốc giảm đau bằng điện di mao quản bao gồm hai bước chính: chiết pha rắn (SPE) và phân tích điện di. Bước chiết pha rắn sử dụng cột C18 để loại bỏ các chất gây nhiễu và làm giàu nồng độ mục tiêu từ mẫu nước. Sau đó, các chất được phân tách bằng điện di mao quản với pha động chứa đệm phosphate và chất bổ trợ HP-β-cyclodextrin để cải thiện độ phân giải. Điều kiện tối ưu bao gồm pH 7.0-7.5, điện thế 25 kV, và thời gian chuyển mẫu 5 giây. Phương pháp này đạt giới hạn định lượng (LOQ) từ 5-50 ng/mL tùy theo chất phân tích, độ lặp lại tốt (RSD < 10%) và độ thu hồi 85-110%.

3.1. Bước chuẩn bị và chiết pha rắn

Mẫu nước được chuẩn bị bằng cách điều chỉnh pH về 2.5-3.0 để tăng hiệu suất chiết các thuốc giảm đau có tính acid yếu. Sử dụng cột chiết C18 có kích thước 500 mg được kích hoạt với methanol và nước cất. Mẫu được đẩy qua cột dưới áp suất âm, sau đó rửa với nước rồi elution bằng acetonitrile 80% để thu nhận các chất phân tích.

3.2. Tối ưu điều kiện điện di và phát hiện

Pha động điện di được chuẩn bị từ dung dịch đệm phosphate 25 mM, pH 7.2 có chứa 2 mM HP-β-CD như chất bổ trợ. Áp dụng điện thế 25 kV với thời gian chuyển mẫu 5 giây bằng áp thế. Detector độ dẫn không tiếp xúc ghi nhận tín hiệu từ các chất phân tích được tách biệt, cho phép xác định nồng độ chính xác thông qua so sánh với đường chuẩn.

IV. Kết quả phân tích và ứng dụng thực tiễn

Các nghiên cứu sử dụng phương pháp điện di mao quản để xác định nồng độ ibuprofen, diclofenac, naproxen và bezafibrate trong mẫu nước thật đã cho kết quả chính xác và đáng tin cậy. Phương pháp này đã được xác thực so sánh với HPLC, cho thấy sự tương quan tốt về kết quả nồng độ. Các mẫu nước từ sông, hồ và nước thải xử lý được phân tích cho thấy nồng độ ibuprofen từ 150-450 ng/L, diclofenac 80-320 ng/L, naproxen 50-200 ng/L, và bezafibrate 20-150 ng/L. Phương pháp điện di mao quản không chỉ cung cấp công cụ phân tích hiệu quả mà còn giúp đánh giá rủi ro ô nhiễm dược phẩm trong các hệ thống nước tự nhiên, hỗ trợ các cơ quan quản lý môi trường trong việc đưa ra các biện pháp kiểm soát và xử lý nước thải hiệu quả.

4.1. Độ chính xác và độ tin cậy của phương pháp

Phương pháp điện di mao quản đạt giới hạn phát hiện (LOD) từ 2-15 ng/mL và giới hạn định lượng (LOQ) từ 5-50 ng/mL. Độ lặp lại (RSD) nhỏ hơn 10%, độ thu hồi từ 85-110%, cho phép xác định đáng tin cậy các chất phân tích ở nồng độ rất thấp. So với HPLC, phương pháp này cho kết quả tương quan tốt (R² > 0.99) và chi phí thấp hơn.

4.2. Ứng dụng trong giám sát môi trường nước

Kết quả phân tích từ các mẫu nước thật cho thấy sự hiện diện phổ biến của thuốc giảm đau trong môi trường nước Việt Nam. Phương pháp điện di mao quản là công cụ hiệu quả để giám sát chất lượng nước, hỗ trợ các chính sách bảo vệ môi trường và nâng cao tiêu chuẩn xử lý nước thải.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Hiện nay, bên cạnh những chất ô nhiễm cổ điển nhƣ các chất hữu cơ bền vững (các thuốc trừ sâu, PCBs…) thì dƣ lƣợng dƣợc phẩm trong nƣớc cũng đang là vấn đề nổi cộm về môi trƣờng. Nƣớc thải của những nhà máy sản xuất dƣợc phẩm, nƣớc thải bệnh viện không đƣợc xử lý đúng cách xả ra môi trƣờng và sự đào thải dƣợc phẩm qua quá trình sử dụng thuốc của con ngƣời là nguyên nhân chính gây ra sự xuất hiện của dƣợc phẩm trong môi trƣờng nƣớc. Vấn đề này đã trở thành một mối lo về môi trƣờng và sức khỏe của con ngƣời vì đây là những chất có hoạt tính sinh học nhất định. Sự xuất hiện của chúng có thể ảnh hƣởng đến môi trƣờng sống, thay đổi đặc tính của các loại vi sinh, sinh vật trong nƣớc.

Trong đó thuốc giảm đau, chống viêm là một trong những loại thuốc đƣợc sử dụng rộng rãi trong đời sống hằng ngày. Dƣ lƣợng của chúng đã đƣợc tìm thấy trong môi trƣờng nƣớc ngày càng nhiều. Việc xác định nồng độ của các dƣợc phẩm trong môi trƣờng thƣờng đƣợc thực hiện bằng những phƣơng pháp nhƣ: sắc khí lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc kí khí (GC) kết hợp với các detetor mảng diod (DAD), khối phổ (MS). Cùng với các phƣơng pháp trên, phƣơng pháp điện di mao quản sử dụng detetor đo độ dẫn không tiếp xúc (CE-C4D) là phƣơng pháp phân tích nhiều tiềm năng.

Thiết bị CE – C 4D có thể phát triển với xu hƣớng tự động hóa, vận hành đơn giản, có thể phân tích đồng thời với chi phí tƣơng đối thấp, phù hợp với nhu cầu và điều kiện thực tế tại Việt Nam. Xuất phát từ tình hình thực tế trên, luân văn này đã xây dựng quy trình chiết và phân tích nồng độ hoạt chất một số thuốc giảm đau (ibuprofen, diclofenac, naproxen, bezafibrate) trong mẫu nƣớc bằng phƣơng pháp điện di mao quản sử dụng detetor độ dẫn không tiếp xúc đã đƣợc phát triển và đánh giá. 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về các chất phân tích 1.1 Tổng quan về thuốc chống viêm, giảm đau 1.1 Khái niệm về thuốc chống viêm, giảm đau Thuốc chống viêm, giảm đau là thuốc có tác dụng lên một khâu nào đó của quá trình viêm hoặc làm ngƣng hẳn quá trình viêm. Phân loại thuốc chống viêm, giảm đau: có nhiều cách phân loại theo tác dụng, theo cách sử dụng hoặc theo các nhóm.

Phân loại theo tác dụng có hai loại: tác dụng toàn thân và tác dụng cục bộ. Trong đó, thuốc chống viêm không steroid (NSAID) là một trong những loại thuốc có tác dụng toàn thân đƣợc sử dụng phổ biến từ lâu.2 Khái niệm thuốc chống viêm không steroid Thuốc chống viêm không steroid (NSAID): là loại thuốc có tác dụng hạ sốt, giảm đau, chống viêm không có cấu trúc steroids. NSAID là thuốc giảm đau ngoại vi và không có tác dụng gây nghiện. Những thuốc tiêu biểu của nhóm này gồm có ibuprofen, diclofenac, naproxen và aspirin đã đƣợc sử dụng rộng rãi trong điều trị từ lâu.

Paracetamol (acetaminophen) có tác dụng chống viêm không đáng kể, nhƣng lại có tác dụng hạ sốt và giảm đau rất tốt, nên đôi khi vẫn đƣợc xếp trong nhóm này. Cơ chế chống viêm của thuốc NSAID: thuốc ức chế cyclooxygenase (COX) nên ức chế tổng hợp prostaglandin (PG) và thromboxan. Có hai dạng COX, COX-1 cần thiết để tổng hợp prostaglandin (bảo vệ niêm mạc dạ dày) và thromboxan cần thiết cho tiểu cầu kết dính, và COX-2 tham gia tạo ra prostaglandin khi có viêm [17]. Các thuốc chống viêm không chọn lọc ức chế cả hai loại COX-1 và COX-2, bao gồm ibuprofen, naproxen, diclofenac, indometacin, piroxicam, ketoprofen.

Các thuốc NSAID ức chế chọn lọc COX-2 gồm có ketorolac, parecoxib, celecoxib, meloxicam, rofecoxib… 2 Ibuprofen Diclofenac Naproxen Bezafibrate Tên Chất Hình 1.1 Cơ chế tác động của thuốc chống viêm giảm đau 1.3 Giới thiệu về các chất phân tích (ibuprofen, diclofenac, naproxen, bezafibrate) Các chất phân tích đều là thành phần chính trong các loại dƣợc phẩm đƣợc sử dụng rộng rãi. Trong đó có ba chất thuộc nhóm thuốc chống viêm giảm đau NSAID và một chất là dƣợc phẩm tác dụng điều chỉnh lipit. Các thông tin chung của bốn dƣợc phẩm đƣợc trình bày trong bảng 1. 1 Thônagxtiitn2c-(h2u- caáxcitc(h+ấ)t- h (4-(2- (pSh)â-2n- tíc axit 2- (n2g,6c-ủa metylpropyl) (6-metoxy (4[16]phenoxy)-2- Tên hóa học dicloro phenyl phenyl) naphtalen-2-yl) metylpropanoic amino) phenyl) propanoic propanoic axetic Công thức C13H18O2 C14H11Cl2NO2 C14H14O3 C19H20ClNO4 phân tử Công thức cấu tạo Khối lƣợng phân tử 206,28 296,15 230,26 361,82 (g/mol) pKa 4,41 4,18 4,80 3,60 Tác dụng của các loại thuốc: Thuốc ibuprofen có tác dụng kháng viêm, giảm đau trong các trƣờng hợp: đau đầu, đau bụng kinh, đau răng, đau cơ, bong gân, viêm khớp dạng thấp, viêm xƣơng khớp.

Thuốc diclofenac có tác dụng điều trị lâu dài triệu chứng thấp khớp mạn tính, viêm đa khớp dạng thấp, viêm cứng khớp sống. Điều trị ngắn hạn triệu chứng cơn kịch phát cấp tính ngoài khớp, viêm khớp vi tinh thể, hƣ khớp, đau lƣng, đau rễ thần kinh trầm trọng, đau kinh tự phát. 4 Thuốc naproxen tác dụng điều trị các bệnh về xƣơng khớp: viêm cột sống dính khớp, thoái hoá xƣơng - khớp, viêm khớp dạng thấp, đau bụng kinh, nhức đầu bao gồm cả chứng đau nửa đầu, đau sau phẫu thuật, đau do tổn thƣơng phần mềm, gút cấp, sốt. Thuốc bezafibrate có tác dụng điều trị tăng cholesterol máu, tăng triglyceride máu, tăng lipid máu loại III và máu kết hợp.2 Tình hình sản xuất và sử dụng các loại dược phẩm Trong thập kỷ gần đây, với sự phát triển mạnh mẽ của y học thì việc sử dụng dƣợc phẩm cho con ngƣời và vật nuôi cũng ngày càng phát triển.000 dƣợc phẩm khác nhau đƣợc sản xuất mỗi năm nhƣng các dữ liệu cụ thể về quá trình sử dụng trên toàn cầu của chúng còn chƣa đƣợc ghi nhận [13].

Đặc biệt là quá trình tiêu thụ của từng loại lại khác nhau đáng kể ở từng nƣớc khác nhau. Có những dƣợc phẩm đƣợc mua bán theo đơn nhƣng có những dƣợc phẩm có thể mua dễ dàng ở các nhà thuốc mà không cần đơn chỉ định của bác sĩ. Chính vì vậy khó có thể xác định đƣợc số lƣợng tiêu thụ của các dƣợc phẩm ở mỗi nƣớc. Theo thống kê dữ liệu ở các nƣớc châu Âu sản lƣợng các thuốc chống viêm, giảm đau nhƣ ibuprofen ở Đức năm 2001 có sản lƣợng 344,89 tấn, ở Anh ibuprofen năm 2000 đạt sản lƣợng 162,3 tấn.

Ngoài ra còn các loại thuốc khác nhƣ diclofenac ở Đức sản lƣợng 85 tấn trong năm 2001, bezafibrate ở Ý có sản lƣợng 7,6 tấn [10]. Bên cạnh đó còn nhiều loại chƣa đƣợc thống kê đầy đủ. Ngay cả ở Việt Nam theo thống kê của cục quản lý dƣợc, giá trị tiền thuốc sử dụng của ngƣời Việt tăng dần theo năm nhƣ trong bảng 1.2 Giá trị tiền thuốc sử dụng theo năm của người Việt Nam 5 Bình quân tiền Tổng trị giá tiền thuốc Trị giá SX Trị giá thuốc thuốc đầu Năm sử dụng trong nƣớc nhập khẩu ngƣời (1.572 22,25 Theo Cục Quản lý Dƣợc Việt Nam thì sự phát triển của thị trƣờng dƣợc Việt Nam tiếp tục tăng trƣởng đến năm 2011 thị trƣờng tiếp tục tăng từ 17-19% và đạt 2 tỷ USD [1].3 Sự xuất hiện của các dược phẩm trong môi trường Cùng sự phát triển của ngành dƣợc, dƣ lƣợng dƣợc phẩm đƣợc phát hiện trong môi trƣờng ngày càng tăng. Dƣợc phẩm có thể xâm nhập vào môi trƣờng qua nhiều con đƣờng khác nhau nhƣ hình 1.2 Quá trình đào thải của dược phẩm ra ngoài môi trường Sau khi con ngƣời sử dụng, dƣợc phẩm đƣợc bài tiết qua thông qua phân hoặc nƣớc tiểu và theo con đƣờng đó xâm nhập vào nƣớc thải.

Trong quá trình xử lý nƣớc thải dƣợc phẩm ít bị biến đổi hoặc bị loại bỏ và từ đó đƣợc chuyển ra môi trƣờng nƣớc sông hồ. Bên cạnh đó, việc sử dụng thuốc thú y cũng tƣơng tự nhƣ ở con ngƣời. Động vật cũng bài tiết dƣợc phẩm qua phân và nƣớc tiểu. Khi sử dụng sản phẩm từ 7 phân gia súc để làm nông nghiệp cũng là con đƣờng để dƣợc phẩm xâm nhập vào môi trƣờng.

Ngoài ra, nƣớc thải của các nhà máy sản xuất dƣợc phẩm và nƣớc thải của các bệnh viện không đƣợc xử lý đúng cách thải ra môi trƣờng sông hồ cũng chính là con đƣờng giúp dƣợc phẩm xâm nhập vào môi trƣờng [6]. Với những con đƣờng khác nhau và cách xử lý không đúng dẫn đến sự ô nhiễm dƣợc phẩm trong môi trƣờng nƣớc sông, hồ, đất và ở một số trƣờng hợp đặc biệt còn phát hiện một số dƣợc phẩm nhƣ methaqualon và thuốc kháng sinh với các nhóm penicillin, thuốc chống viêm trong nƣớc uống [9, 17, 25]. Trong số những dƣợc phẩm phát hiện nhiều trong môi trƣờng nƣớc có những dƣợc phẩm thuộc nhóm thuốc chống viêm giảm đau.4 Tác hại của dược phẩm đến môi trường Tác hại của diclofenac đã đƣợc đề cập ảnh hƣởng đến sự suy giảm của các cá thể kền kền ở Ấn Độ [18, 19]. Một nghiên cứu tại vƣờn quốc gia Keoladeo, Ấn Độ số lƣợng cá thể kền kền giảm 95% năm 2003.

Theo báo cáo diclofenac ở dạng thuốc thú y đƣợc sử dụng trên động vật, gia súc nuôi. Những con kền kền ăn thịt những gia súc có sử dụng diclofenac sẽ bị nhiễm độc dần dần, do chúng không có enzym để phá vỡ diclofenac. Diclofenac làm cho những con kền kền có triệu chứng suy thận. Ngoài ra đã có những báo cáo khi tiếp xúc lâu dài với diclofenac sẽ ảnh hƣởng đến thận của một số loại sinh vật nhƣ cá [24], chuột [17].

Tác giả Yohana M cùng cộng sự đã nghiên cứu tác dụng của bezafibrate ảnh hƣởng khả năng sinh dục và sinh tinh của cá ngựa vằn. Cá ngựa vằn trƣởng thành đã đƣợc tiếp xúc với bezafibrate qua đƣờng miệng trong 21 ngày. Máu và bộ phận sinh dục đƣợc thu thập để đánh giá hypocholesterol. Kết quả cho thấy sự suy giảm tinh hoàn.

Nghiên cứu thấy đƣợc bezafibrate tạo ra một tác nhân là hypocholesterol ở cá ngựa vằn đực trƣởng thành. Nó là nguyên nhân gây ra sự rối loạn nội tiết ảnh hƣởng đến sinh tinh [26]. 8 Đồng thời có nghiên cứu đánh giá rủi ro môi trƣờng bằng phƣơng pháp kiểm tra Daphania trên tảo và cá. Nghiên cứu đã đánh giá độc tính của ibuprofen, diclofenac, naproxen đối môi trƣờng sống của tảo.

Tác giả đã chỉ ra ibuprofen, diclofenac có khả năng gây nguy hại cho môi trƣờng và đã phát hiện ra có những hiệu ứng kết hợp của các loại dƣợc phẩm gây ảnh hƣởng đến môi trƣờng nƣớc [7, 8].5 Các phương pháp xác định 1.