MỞ ĐẦU Hiện nay, an toàn vệ sinh thực phẩm đang là một vấn đề nhạy cảm, nhức nhối, và gây xôn xao dư luận. Hàng loạt các vụ việc vi phạm an toàn vệ sinh thực phẩm bị phát hiện: rau có thuốc trừ sâu; hoa quả có tồn dư chất kích thích, rượu giả, sữa nhiễm độc. Đặc biệt, gần đây việc lạm dụng các chất phụ gia, thuốc nhuộm trong thực phẩm đã gây nhiều bức xúc và là một vấn đề gây ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe con người. Auramine O là chất màu tổng hợp, chỉ được sử dụng trong công nghiệp để nhuộm nhiều sản phẩm như vải, giấy, gỗ…và dùng để làm màu sơn quét tường, không được dùng trong thực phẩm.
Theo Cơ quan nghiên cứu ung thư quốc tế của Tổ chức y tế thế giới (WHO/IARC), Auramine O là chất đứng hàng thứ 5 trong 116 chất gây ung thư hàng đầu trên thế giới. Tuy nhiên, vì lợi nhuận trước mắt, nhiều người kinh doanh thực phẩm đã dùng chất Auramine O để nhuộm màu vào thực phẩm như măng tươi, thịt gà,dưa muối, nước tương, bim bim… làm tăng màu vàng, nhìn cho đẹp mắt để có thể bán thực phẩm với giá thành cao. Khi người tiêu dùng sử dụng những thực phẩm đó sẽ dễ hấp thụ luôn lượng Auramin O còn tồn dư, dẫn tới nguy cơ bất lợi cho sức khỏe và có thể gây ung thư. Do đó, cần có phương pháp để kiểm tra hàm lượng Auramine O trong mẫu thực phẩm.
Trên cơ sở đánh giá tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước, chúng tôi thấy rằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao và sắc kí lỏng ghép nối khối phổ xác định Auramine O trong mẫu thực phẩm có độ nhạy cao nhưng giá thành thiết bị và giá thành phân tích cao, thời gian phân tích lâu. Phương pháp von - ampe hòa tan hấp phụ là phương pháp phân tích có độ nhạy và độ chọn lọc cao, quy trình phân tích không quá phức tạp, thiết bị phân tích không đắt, không tốn dung môi, chi phí phân tích không cao. Hơn nữa, chưa có công trình nào xác định Auramine O trong thực phẩm bằng phương pháp von- ampe hòa tan hấp phụ nên việc lựa chọn đề tài rất có ý nghĩa khoa học và thực tiễn. Mặt khác, cần có phương pháp kiểm tra nhanh, đảm bảo độ nhạy, độ đúng, độ chính xác để có thể kiểm tra được mẫu thực phẩm nhiễm Auramine O hay không là rất cần thiết và cấp bách đối với xã hội.
15 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Chính vì vậy, chúng tôi đã tiến hành xây dựng đề tài: “nghiên cứu xác định Auramine O trong thực phẩm bằng phương pháp von - ampe hòa tan”. 16 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com CHƢƠNG 1 : TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung về chất nghiên cứu Auramine O 1. Cấu tạo của Auramine O (AO) Auramine O (vàng ô, basic yellow) thuộc phân nhóm ketoimin, có tên khoa học là diarylmethane, tên danh pháp theo IUPAC: 4,4 – carbonnimidoylbis [N,N – dimethylbenzenamine]. Công thức phân tử của Auramine O là : C17H22N3Cl.1: Công thức cấu tạo của Auramine O Auramine O có khối lượng phân tử là 303,83 (g/mol) và có nhiệt độ nóng chảy ở 267oC (540 K).
Auramine O là chất rắn có dạng tinh thể hình kim vàng, nó tan rất tốt trong nước (10 mg/ml) và ethanol (20 mg/ml), tan trong ethyl ether (60 mg/ml). Ứng dụng của Auramine O Auramine O được sản xuất lần đầu tiên ở châu Âu (Thụy Sĩ, Đức, Anh và Pháp), và sau đó ở Hoa Kỳ. Hiện nay Auramine O sản xuất chủ yếu ở Ấn Độ và Trung Quốc năm (2008). [18] 17 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.1: Khối lượng sản xuất Auramine O ở một số quốc gia năm 2008 [18] Năm Sản lượng Auramine O (103 pounds) 1986 10 - 500 1994 10 - 500 1998 10 - 500 Trong y học: Auramine O có thể được dùng như chất huỳnh quang để xác định vi khuẩn axit có trong đờm, mô nhiễm bệnh.
Auramine O còn được sử dụng kết hợp cùng thuốc rhodamine để phát hiện các vi khuẩn mycobacterium tuberculosis. [24] Trong công nghiệp: Auramine O là chất nhuộm màu tổng hợp, được sử dụng trong công nghiệp để nhuộm các sản phẩm như vải, gỗ, giấy. và được dùng để làm màu sơn quét tường. [27] Trong quân sự: Auramine O được sử dụng tạo khói màu trong các ứng dụng quân sự.
Ngoài ra, trước đây Auramine O đã từng bị phát hiện sử dụng để làm thuốc nhuộm tóc, sử dụng trong tạo màu thực phẩm. Tác hại của Auramine O Auramine O là chất gây độc cực kỳ nguy hiểm. Qua tiếp xúc da, nó gây dị ứng hoặc làm mẩn ngứa da, mắt. Qua đường hô hấp, nó gây ho, ngứa cổ, khó thở, đau ngực.
Qua đường tiêu hóa, nó gây nôn mửa. Nếu tích tụ dần trong cơ thể nó gây nhiều tác hại đối với gan, thận, hệ sinh sản, hệ thần kinh cũng như có thể gây ung thư. 18 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail. Ung thư người Khi Auramine O tích ở trong cơ thể người có thể gây ung thư bàng quang.
Năm 1933, Miller đã phát hiện 2 ca ung thư bàng quang ở công nhân làm việc trong ngành công nghiệp sản xuất Auramin O. [20] Tổ chức nghiên cứu ung thư thế giới IARC đã xếp Auramin O vào nhóm 2B là nhóm các chất hoặc hỗn hợp có thể gây ung thư cho người. Nghiên cứu ở động vật Các nhà khoa học cũng tiến hành nhiều nghiên cứu thử nghiệm tác hại của Auramine O trên động vật. Kết quả cho thấy, Auramin O làm tổn thương ADN trên gan, thận, tuỷ xương của chuột, gây chết hoặc làm xuất hiện các khối ung thư hạch, ung thư gan ở chuột.2: Kết quả nghiên cứu ở động vật Loài / tài liệu Chế độ nuôi Tỷ lệ khối u Ý nghĩa tham khảo Chuột [8, 9] - Thức ăn chứa 0,1 % AO trong 52 tuần ( 728 mg /chuột).
- Ung thư gan: - P < 0,05 cả - 15 chuột đực và 15 chuột cái đực 4/15; cái 3/15. hai giới tính - 15 chuột đực và 15 cái: 2 lần - Ung thư hạch - P < 0,01, F /tuần tiêm dưới da đực 3/15; cái 8/15 - Ung thư hạch: P < 0,05 - 15 chuột đực và 15 chuột cái Chuột nhắt Chuột đực 4/7, cho ăn thức ăn có hàm lượng và chuột chuột cái 3/10. 0,1 % AO trong 52 tuần (1820 cống mg/chuột) - Ung thư gan: [29] - 12 chuột đực và 15 chuột cái chuột đực 7/12, ăn thức ăn chứa 0,2 % AO chuột cái 11/15.0001 19 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com trong 52 tuần (3640 mg/chuột). - 12 chuột đực ăn thức ăn chứa - Ung thư gan: Chuột [22] 0,1 % AO trong 87 tuần P < 0.0001 11/12 (10g/con) 20 chuột đực và 20 chuột cái - Chuột đực 13/20, Chuột [24] được cho ăn chế độ ăn uống có 8/20, 10/20 NS chứa AO ở mức 0, 50, 100 và - Chuột cái 19/20, 200 ppm 18/20, 15/20, 19/20 1.
Các quy định về hàm lượng của Auramine O Ở châu Âu, việc sản xuất Auramine O phải tuân theo các quy định của chỉ thị 2004/37/EC, áp dụng cho các hoạt động mà người lao động phải tiếp xúc với chất gây ung thư hoặc chất gây đột biến gen. Chỉ thị 2004/93/EC, ngày 21 tháng 9 năm 2004 đã xếp Auramine O và muối của nó không được xuất hiện trong các thành phần của mỹ phẩm [12, 13] Ở Việt Nam, bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn (NN&PTNT) đã ban hành thông tư số 26/2012 và thông tư bổ sung số 42/2015 cấm sản xuất, nhập khẩu, kinh doanh và sử dụng Auramine O và các hợp chất trong thức ăn chăn nuôi gia súc, gia cầm. Các phƣơng pháp xác định Auramine O Hiện nay, đã có rất nhiều phương pháp được sử dụng để xác định Auramine O như: phương pháp sắc kí, phương pháp sắc ký lớp mỏng TLC, phương pháp quang phổ, phương pháp điện di mao quản, phương pháp… 1. Phương pháp sắc kí Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) có độ nhạy, độ chọn lọc cao sử dụng dung môi metanol và axeton nitrin để chiết đồng thời rhodamin B (RB), 20 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com auramine O (AO), pararosalin (PA) trong 6 mẫu thực phẩm: cà ri, gà nướng, tương ớt, tương cà chua, bột tôm và súp bột.3: Kết quả nghiên cứu xác định AO, PA, RB bằng phương pháp HPLC Chất Rhodamin B Auramine O Pararosalin Thông số hoặc điều kiện đo Khoảng tuyến tính (µg/ml) 0,05 đến 100 0,05 đến 100 0,05 đến 50 R2 = 0,999 Đánh giá phương pháp LOD = 0,0125 LOD = 0,05 LOD = 0,0125 (µg/ml) LOQ = 0,05 LOQ = 0,125 LOQ = 0,05 Độ thu hồi (%) 91 - 99 76 - 92 88 - 102 Độ thu hồi khi thêm chuẩn 70,2% đến 102,8% 0,5 µg/ml Độ lệch chuẩn khi thêm 0,8 % đến 8,0 % chuẩn 0,5 µg/ml (RSD) Phương pháp HPLC còn xác định được đồng thời chrysoidine, AO và safranine T trong 6 mẫu thực phẩm.
Mẫu được chiết lần 1 bằng amoniac - metanol (1:50, v/v) và chiết lần 2 với dung môi CH2Cl2, rửa giải trong axit formic - metanol (1:50, v/v), làm sạch bằng n - hexan, cuối cùng hòa tan bằng metanol bão hòa. Khoảng tuyến tính của phương pháp của ba chất là 0,05 - 2,5 g/ml, hệ số tương quan đều cao hơn 0,9998. Hiệu suất thu hồi của 6 thực phẩm dao động trong khoảng 72,3 - 96,5 % và độ lệch chuẩn là 0,3 - 8,8 % (n = 6). Giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp là khoảng 0,02 mg/kg cho chrysoidine; 0,03 mg/kg cho Auramine O và 0,004 mg/kg cho safranine T.
[32] Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sử dụng detecter khối phổ phân tích: α - Naphatol, β - Naphatol và AO trong sản phẩm đậu. Thành phần pha 21 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com động: ACN và H2O (7 : 3), khoảng tuyến tính từ 0,1 đến 20,0 μg/mL với hệ số tương quan là 0,9999. Độ thu hồi của α - Naphatol, β - Naphatol và Auramine O trong khoảng 5,0 đến 15,0 mg/kg dao động từ 88,8 % đến 93,0 % với RSD từ 0,67 % đến 1,66 % (n = 6). Giới hạn phát hiện của α - Naphatol, β - Naphatol và Auramine O: 0,05 mg/kg.
Với độ thu hồi cao, LOD thấp, phương pháp này thích hợp cho việc xác định α - Naphatol, β - Naphatol và Auramine O trong sản phẩm đậu. Phương pháp quang phổ Phương pháp quang phổ hấp thụ UV – Vis xác định AO dựa trên sự tạo phức của AO với Albumin (huyết thanh bò). Các điều kiện đo: đệm B – R có pH = 7, bước sóng tại 339 nm. Khoảng nồng độ tuyến tính từ 0,16 µm đến 50 µM với LOD là 0,05 µM.