Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ chuyên ngành Vi sinh vật học (mã số 62 42 01 07) của tác giả Mai Thi, thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. TS. Nguyễn Hữu Hiệp tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ (năm bảo vệ: 2018), giải quyết bài toán xử lý chất thải rắn hữu cơ phục vụ phát triển nông nghiệp tại tỉnh Sóc Trăng.

Về tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu, sự phát triển kinh tế - xã hội, đô thị hóa và gia tăng dân số đã làm phát sinh khối lượng lớn chất thải rắn sinh hoạt. Tại Việt Nam nói chung và khu vực Đồng bằng sông Cửu Long nói riêng, việc xử lý rác sinh hoạt chủ yếu áp dụng phương pháp chôn lấp thô sơ hoặc đổ đống tại các bãi lộ thiên, dẫn đến nguy cơ ô nhiễm không khí và nguồn nước ngầm. Địa bàn tỉnh Sóc Trăng phát sinh hơn 248,2 tấn rác thải mỗi ngày, tương đương trên 6.258,3 tấn/năm, trong đó thành phần rác hữu cơ dễ phân hủy chiếm tỷ lệ trên 80%. Tỉnh chưa vận hành quy trình công nghệ xử lý đạt chuẩn mà chủ yếu tập trung rác về bãi hở (như bãi rác Sóc Vồ) chờ phân hủy tự nhiên, gây ô nhiễm môi trường và phát sinh ruồi muỗi, mầm bệnh. Việc phun xịt một số chế phẩm sinh học hiện có chưa đáp ứng được công suất và hiệu quả xử lý thực tế. Luận án lựa chọn giải quyết khoảng trống về việc thiếu hụt các chủng vi sinh vật bản địa có hoạt tính phân giải cao, thích ứng với điều kiện sinh thái địa phương để thay thế hoặc bổ trợ các chế phẩm thương mại, gắn khâu xử lý rác với việc tạo ra phân bón hữu cơ phục vụ canh tác cây trồng.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án:

  • Phân lập và tuyển chọn được các dòng vi khuẩn bản địa có khả năng phân hủy cellulose, tinh bột và protein từ nguồn rác thải hữu cơ, ruột sùng đất và ruột trùn đất tại tỉnh Sóc Trăng.
  • Thử nghiệm xử lý rác thải hữu cơ bằng các dòng vi khuẩn tuyển chọn ở quy mô mẻ ủ (composting), so sánh hiệu quả với các chế phẩm sinh học đang lưu hành.
  • Ứng dụng nguồn phân hữu cơ vi sinh tạo thành sau quá trình ủ để bón cho cây dưa leo (Cucumis sativus L.), đánh giá khả năng thay thế một phần phân bón hóa học.

Nội dung nghiên cứu chính của luận án được chia thành 3 phần:

  1. Phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose, tinh bột và protein từ ruột sùng đất, trùn đất và các bãi rác trên địa bàn tỉnh Sóc Trăng để định danh và tuyển chọn dòng vi khuẩn triển vọng.
  2. Thử nghiệm xử lý rác thải hữu cơ bằng vi khuẩn của luận án và so sánh đối chiếu với một số chế phẩm ngoại nhập tại bãi rác Đại Ngãi thuộc tỉnh Sóc Trăng.
  3. Rác thải hữu cơ sau xử lý được dùng làm phân hữu cơ vi sinh và bón thử nghiệm trên cây dưa leo ở Sóc Trăng.

Đối tượng nghiên cứu:

  • Các chủng vi khuẩn bản địa có hoạt tính enzyme ngoại bào phân giải cellulose, tinh bột, protein.
  • Nguồn rác thải hữu cơ sinh hoạt thu gom từ các bãi rác; ấu trùng sùng đất (Holotrichia parallela) và trùn đất (Lumbricus terrestris).
  • Phân hữu cơ vi sinh thành phẩm và cây dưa leo (Cucumis sativus L.).

Phạm vi nghiên cứu:

  • Phạm vi không gian: Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học và Phòng thí nghiệm chuyên sâu (Trường Đại học Cần Thơ); Phòng thí nghiệm Hóa Sinh thuộc Trung tâm Quan trắc Tài nguyên và Môi trường tỉnh Sóc Trăng; các bãi rác thị trấn Trần Đề, thị trấn Kế Sách, xã Tân Long (huyện Ngã Năm), bãi rác xã Đại Ngãi (huyện Long Phú); trang trại nông hộ tại ấp Thạnh An 3, xã Thạnh Thới Thuận, huyện Trần Đề, tỉnh Sóc Trăng.
  • Phạm vi thời gian: Thực hiện từ tháng 08/2013 đến tháng 12/2016.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Tổng quan tài liệu của luận án tập trung khảo sát các nguồn dữ liệu về phát sinh rác thải, cơ chế phân giải các hợp chất hữu cơ cao phân tử và tiềm năng ứng dụng vi sinh vật từ các hệ sinh thái đặc thù.

Về tình hình rác thải, tác giả phân tích số liệu từ Báo cáo hiện trạng môi trường tỉnh Sóc Trăng (2016), Cục Thống kê tỉnh Sóc Trăng (2015) và Báo cáo môi trường quốc gia Chất thải rắn (2011). Tại khu vực nông thôn như thị xã Vĩnh Châu và huyện Cù Lao Dung, chỉ số phát sinh rác sinh hoạt đạt 0,3 kg/người/ngày; khối lượng phát sinh lần lượt là 27,7 tấn/ngày và 16,7 tấn/ngày, nhưng tỷ lệ thu gom chỉ đạt 3,6%. Phân loại thành phần rác tại các chợ trung tâm TP. Sóc Trăng, chợ thị trấn Mỹ Xuyên và chợ thị trấn Trần Đề cho thấy thành phần rác hữu cơ chiếm tỷ trọng áp đảo (tại chợ Trần Đề, rác hữu cơ rau củ, trái cây chiếm 85,22% với khối lượng 711,5 - 740,4 kg; phế phẩm động vật chiếm 1,52%).

Về mặt sinh hóa, sự phân hủy các chất hữu cơ diễn ra qua hệ thống enzyme chuyên biệt:

  • Cellulose: Lynd et al. (2002), Nguyễn Lân Dũng và ctv. (2006), Nguyễn Đức Lượng và ctv. (2004), Teeri (1997) và Saha et al. (2006) chỉ rõ cấu trúc tinh thể liên kết β-1,4-glycoside của cellulose đòi hỏi sự phối hợp của ba enzyme: endoglucanase (cắt ngẫu nhiên liên kết nội mạch), exoglucanase (cắt đầu không khử giải phóng cellobiose hoặc glucose) và cellobiase/β-glucosidase (thủy phân cellobiose thành glucose).
  • Tinh bột: Phân tích theo French (1973) và Marc et al. (2002) cho thấy tinh bột gồm amylose và amylopectin, bị phân cắt bởi hệ thống enzyme cắt nhánh (phân cắt liên kết α-1,6-glycoside), endoamylase (α-amylase phân cắt liên kết α-1,4-glycoside nội mạch) và exoamylase (β-amylase, γ-amylase, α-glucosidase).
  • Protein: Phân cắt liên kết peptide thông qua cơ chế 1 bước của protease acid (pH 2-4) hoặc cơ chế 2 bước của protease trung tính (pH 7-8).

Về vi sinh vật xử lý rác, luận án tổng hợp các nghiên cứu về nấm (Aspergillus niger, Rhizopus stolonifer, Trichoderma theo Saim et al., Pothiraj et al. 2006, Leeuwen et al., Zhang et al.), xạ khuẩn (Cellulomonas, Streptomyces theo Ramesh et al. 2011, Hesham 2007, Roshan et al., Muhammad et al. 2014, Veloorvalappil et al. 2013), và vi khuẩn (Bacillus, Pseudomonas, Clostridium theo Rainey et al., Rapp và Beerman 1991, Ramesh et al., Ajay et al. 2016, Saleem et al. 2014, Payapanon et al., Fergusg 1977, Nguyễn Hữu Hiệp và Nguyễn Thị Hải Lý 2012, Sulaiman et al., Mary et al., Liang et al.). Trong đó, chi Bacillus chiếm ưu thế nhờ khả năng sinh nội bào tử, chịu nhiệt và tiết enzyme ngoại bào phong phú.

Đặc biệt, luận án điểm lại các công bố về vi sinh vật nội cộng sinh đường ruột:

  • Ruột trùn đất (Lumbricus terrestris): Theo Lavelle et al., Brown và Double (2004), Parle (1963), Fujii et al. (2012), Sumathi và Arockiam (2013), Shankar et al. (2011), mật số vi khuẩn trong ruột trùn cao gấp 2,5 lần so với môi trường đất xung quanh, có hoạt tính cellulase đạt 0,035 - 0,127 UI/mL.
  • Ruột sùng đất (Holotrichia parallela): Theo Shengwei et al. (2012) và Sheng et al., ấu trùng sùng đất phân giải rơm rạ mục và rễ cây, chứa 21 dòng vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí thuộc các chi Pseudomonas, Bacillus, Ochrobactrum, Cellulosimicrobium có hoạt tính sinh enzyme cellulase cao.

Về quy trình ủ phân hữu cơ vi sinh, luận án trích dẫn các tài liệu của Bhattacharyya (2007), Ranalli et al., Benito et al., Hassen et al. (2001), Brito et al. (2008), Misra et al., xác định các yếu tố kiểm soát mẻ ủ gồm tỷ lệ C/N (nguyên liệu đầu vào tối ưu từ 25:1 đến 30:1; thành phẩm đạt 10:1 đến 15:1), độ ẩm (50-60%), nhiệt độ (pha ưa nhiệt 40-60°C tiêu diệt mầm bệnh), độ thoáng khí và kiểm soát pH không quá 8,0 để tránh thất thoát đạm bay hơi dạng NH3.

Vị trí của luận án: Kế thừa các phát hiện của Shengwei et al. (2012) và Shankar et al. (2011) về nguồn vi sinh vật đường ruột côn trùng, luận án mở rộng đối tượng phân lập sang rác thải sinh hoạt và nước rỉ rác địa phương; đồng thời không dừng lại ở mức độ phân lập trong phòng thí nghiệm mà đi trọn vẹn chu trình từ tuyển chọn, giải trình tự 16S rRNA, xây dựng cây phả hệ, đến thực nghiệm ủ phân rác quy mô 100 kg/mẻ và khảo nghiệm đồng ruộng bón cho cây dưa leo.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu vận dụng khung phân tích thực nghiệm vi sinh vật học cổ điển kết hợp kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại, tiến hành qua 5 khối phương pháp chính:

1. Phân lập, định dạng hình thái và kiểm tra sinh hóa

  • Mẫu rác và nước rỉ rác được pha loãng bậc 10 (từ 10^-1 đến 10^-5). Mẫu sùng đất (12 con, 2,5 - 15 g) và trùn đất (12 con, 3 - 11 g) được khử trùng bề mặt bằng cồn 70° (5 phút) và H2O2 3% (5 phút), mổ lấy ruột cấy gạt lên các môi trường chuyên biệt bổ sung cycloheximide (0,1 g/L) để ức chế nấm: môi trường CMC 1% (phân giải cellulose), tinh bột 1% (phân giải tinh bột), peptone 1% và skim milk 1% (phân giải protein). Ủ hiếu khí ở 30°C trong 72 giờ.
  • Quan sát hình thái khuẩn lạc (hình dạng, độ nổi, bìa, màu sắc, kích thước). Quan sát tế bào qua phương pháp trắc vi thị kính (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002).
  • Thử nghiệm nhuộm Gram, nhuộm nội bào tử bằng malachite green 7,6% và safranin 0,5% (Nguyễn Lân Dũng, 2006). Khảo sát khả năng di động trên thạch đứng LB.
  • Thử nghiệm sinh hóa: Phép thử catalase bằng H2O2 3%; phép thử Methyl red trên môi trường glucose - phosphate để kiểm tra khả năng sinh acid (Nguyễn Lân Dũng, 2006).

2. Đánh giá hoạt tính phân giải cơ chất và định lượng enzyme

  • Khảo sát sơ bộ bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch (agar-well diffusion): Đục giếng thạch đường kính 5 mm, tra dịch vi khuẩn nuôi cấy 24 giờ. Đo đường kính vòng phân giải sau 48-72 giờ qua chỉ số E = D - d (D: đường kính vòng sáng, d: đường kính khuẩn lạc). Nhuộm dung dịch lugol đối với cơ chất CMC và tinh bột; quan sát vòng trong suốt trực tiếp đối với cơ chất skim milk. Khảo sát bổ sung khả năng phân hủy bột giấy lọc 1%.
  • Định lượng hoạt tính cellulase và amylase bằng phương pháp Nelson-Somogyi (Nelson, 1944): Thu dịch enzyme thô sau ly tâm 5000 vòng/phút ở 4°C. Cơ chất phản ứng gồm CMC 5% (xác định endoglucanase), bột cellulose 5% (xác định exoglucanase) và tinh bột 1% (xác định amylase). Phản ứng tạo màu với thuốc thử đồng và arsenomolybdate, đo mật độ quang (OD) ở bước sóng 520 nm bằng máy so màu UV-VIS Cary 50 Varian. Hoạt tính enzyme (UI/mL) tính theo công thức: $$U = \left(\frac{X}{T}\right) \times \left(\frac{V_R}{V_E}\right) \times k$$
  • Định lượng hoạt tính protease theo phương pháp Cupp-Enyard (2008): Phản ứng thủy phân casein 0,65% ở 37°C trong 10 phút, kết tủa protein dư bằng trichloroacetic acid (TCA) 110 mM, lọc dịch và phát hiện tyrosine tạo thành bằng thuốc thử Folin 0,5 mM trong môi trường kiềm Na2CO3 500 mM, đo OD ở bước sóng 660 nm. Hoạt tính enzyme (UI/mL) tính theo công thức: $$U = \left(\frac{X}{T}\right) \times \left(\frac{V_R}{V_E \times V_{OD}}\right) \times k$$

3. Kỹ thuật sinh học phân tử định danh vi khuẩn

  • Ly trích DNA theo quy trình của Carr và Kaguni (2001) có cải tiến, phá vỡ vách tế bào bằng bi sắt và lysis buffer, tủa bằng ethanol 95% và 70%, hòa tan trong đệm TE 0,1X.
  • Khuếch đại đoạn gen 16S rRNA bằng máy PCR Perkin Elmer 9700 (Lane, 1991) với cặp mồi phổ quát:
    • 27F: 5’-AGAGTTTAGTCCTTGGCTCAG-3’
    • 1492R: 5’-GGCTACCTTGTTACGACTT-3’ Thành phần phản ứng 25 µL: Nước cất 2 lần (13,25 µL), Buffer 10X (2,5 µL), MgCl2 0,5 µM/µL (2 µL), dNTPs 25 µM/µL mỗi loại (4 µL), DMSO 1% (0,5 µL), mồi xuôi 27F 15 pmol/µL (0,25 µL), mồi ngược 1492R 15 pmol/µL (0,25 µL), Taq DNA polymerase 0,5 U/µL (0,25 µL), DNA khuôn ~25 ng/µL (2 µL). Chu trình nhiệt: Biến tính ban đầu 95°C trong 5 phút; 30 chu kỳ gồm biến tính 95°C trong 1 phút, bắt cặp 53°C trong 0,5 phút, kéo dài 72°C trong 1,5 phút; kéo dài chung cuộc 72°C trong 5 phút. Điện di kiểm tra trên gel agarose 2% nhuộm Safeview.
  • Giải trình tự chuỗi bằng hóa chất BigDye trên máy ABI PRISM 3130. Trình tự được đối chiếu đồng nhất trên ngân hàng dữ liệu NCBI qua công cụ BLASTN. Cây phả hệ và haplotype di truyền được thiết lập bằng phần mềm MEGA 5 (Tamura et al.).

4. Thử nghiệm xử lý rác hữu cơ quy mô pilot

  • Bố trí thí nghiệm khối hoàn toàn ngẫu nhiên (RCBD), 4 lần lặp lại trong các bồn gốm chứa 100 kg rác hữu cơ phân loại tại bãi rác Đại Ngãi (huyện Long Phú).
  • Gồm 5 nghiệm thức:
    • NT1: Đối chứng (không bổ sung chế phẩm vi sinh).
    • NT2: Chế phẩm SEMSR / SEM 09 (Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Công nghệ sinh học Môi trường TP.HCM).
    • NT3: Chế phẩm EM (Trung tâm Ứng dụng KH&CN Tiền Giang).
    • NT4: Chế phẩm EcoClean 1XF HC (nhập khẩu từ Mỹ).
    • NT5: Hỗn hợp các dòng vi khuẩn bản địa triển vọng của luận án.
  • Mật số vi sinh vật bổ sung đạt 10^9 CFU/mL (pha 1 L dịch nuôi vào 9 L nước sạch phun đều cho 100 kg rác). Theo dõi vào các ngày 0, 1, 7, 14, 21, 28, 35: mật số vi khuẩn hiếu khí (môi trường PCA theo Jackson, 2000), nhiệt độ, pH, hàm lượng C (oxy hóa bằng K2Cr2O7 - H2SO4 - H3PO4, chuẩn độ FeSO4), N (Kjeldahl), P (phức màu phosphomolybdenum đo quang UV-VIS Cary 50), K (phương pháp quang phổ hấp thu nguyên tử AAS trên máy AA 7000 Shimadzu) và tỷ lệ C/N, đối chiếu quy chuẩn TCVN 7185:2002.

5. Thử nghiệm đồng ruộng trên cây dưa leo

  • Bố trí khối hoàn toàn ngẫu nhiên (RCBD) gồm 4 nghiệm thức, 4 lần lặp lại tại xã Thạnh Thới Thuận, huyện Trần Đề:
    • NT1: Đối chứng không bón phân.
    • NT2: Bón 100% phân hóa học theo tập quán nông hộ (phân NPK 16-16-8).
    • NT3: Bón 100% phân hữu cơ vi sinh sản xuất từ luận án.
    • NT4: Bón 50% phân hóa học kết hợp 50% phân hữu cơ vi sinh của luận án.
  • Thu thập các chỉ tiêu sinh trưởng và năng suất: Chiều dài trái, đường kính trái, trọng lượng trái, số trái/cây, ngày ra hoa và ngày thu hoạch.

6. Xử lý số liệu

  • Phân tích phương sai (ANOVA) và so sánh trung bình nghiệm thức theo kiểm định Fisher (LSD) ở độ tin cậy 95% (p < 0,05) sử dụng phần mềm Minitab 17 và Microsoft Excel 2010.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Giới thiệu

Chương này đặt nền tảng cơ sở về mặt thực tiễn và quản lý môi trường tại địa phương. Tác giả luận chứng tính cấp thiết khi lượng rác thải của tỉnh Sóc Trăng phát sinh 248,2 tấn/ngày nhưng chưa có công nghệ xử lý triệt để, rác hữu cơ chiếm hơn 80%. Đặt ra mục tiêu phân lập các dòng vi sinh vật bản địa phân giải cellulose, tinh bột, protein để chế tạo chế phẩm sinh học xử lý rác thải hữu cơ thành phân bón compost đạt tiêu chuẩn TCVN 7185:2002, ứng dụng thực nghiệm bón cây dưa leo giúp giảm áp lực phân bón hóa học. Bố cục luận án gồm 5 chương chính (chương 1: 3 trang; chương 2: 19 trang; chương 3: 15 trang; chương 4: 48 trang; chương 5: 1 trang), cùng 11 trang tài liệu tham khảo và 40 trang phụ lục.

Chương 2: Tổng quan tài liệu

Nội dung chương 2 tổng hợp hệ thống cơ sở lý thuyết về thành phần rác thải, cơ chế phân giải các hợp chất đại phân tử sinh học và vai trò của các nhóm vi sinh vật:

  • Tổng hợp số liệu phát sinh rác tại Sóc Trăng, chứng minh thành phần rác hữu cơ tại các chợ trung tâm và chợ đầu mối huyện đạt từ 80% đến trên 85%.
  • Phân tích cơ chế tác động đồng vận của hệ enzyme cellulase (endoglucanase, exoglucanase, β-glucosidase), amylase (α-amylase, β-amylase, glucoamylase, enzyme cắt nhánh) và protease (acid và trung tính).
  • Khảo cứu sinh thái học vi sinh vật phân giải chất hữu cơ từ tự nhiên, đặc biệt là hệ vi khuẩn đường ruột của trùn đất (Lumbricus terrestris) và sùng đất (Holotrichia parallela).
  • Nêu rõ đặc điểm phân loại học của chi Bacillus (Gram dương, hình que, di động, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy nghi, sinh nội bào tử, phản ứng catalase dương tính) và khả năng ứng dụng công nghệ vi sinh xử lý chất thải.
  • Cơ sở động học quá trình ủ phân hữu cơ (composting): diễn biến nhiệt độ qua các pha, độ ẩm, độ thoáng khí, cân bằng tỷ lệ C/N từ 25:1 - 30:1 xuống dưới 15:1. Đặc tính nông học và nhu cầu dinh dưỡng của cây dưa leo (Cucumis sativus L.).

Chương 3: Phương tiện và phương pháp

Trình bày chi tiết toàn bộ các trang thiết bị phân tích, vật liệu, môi trường nuôi cấy và quy trình thực nghiệm từ phòng thí nghiệm ra đến hiện trường. Mô tả chi tiết quy trình chiết tách DNA vi khuẩn, phản ứng khuếch đại gen 16S rRNA bằng cặp mồi 27F - 1492R, chu trình nhiệt PCR 30 chu kỳ, quy trình giải trình tự gen trên máy ABI PRISM 3130. Trình bày phương pháp định lượng đường khử theo Nelson-Somogyi trên máy quang phổ đo mật độ quang 520 nm và chuẩn độ tyrosine theo Cupp-Enyard ở 660 nm. Thiết lập mô hình ủ compost 100 kg/bồn theo khối ngẫu nhiên có đối chứng và chế phẩm thương mại, cùng thí nghiệm bón phân dưa leo theo 4 công thức nghiệm thức tại huyện Trần Đề, tỉnh Sóc Trăng.

Chương 4: Kết quả và thảo luận

Chương 4 là phần nội dung trọng tâm của luận án, trình bày kết quả phân lập, tuyển chọn, định danh 213 dòng vi khuẩn và kết quả thử nghiệm thực tế:

1. Kết quả phân lập và tuyển chọn vi khuẩn

Từ các mẫu rác, nước rỉ rác, ruột sùng đất và trùn đất, tác giả phân lập được tổng cộng 213 dòng vi khuẩn bản địa có hoạt tính phân giải cơ chất hữu cơ:

  • Phân giải cellulose: Thu được các dòng vi khuẩn tạo vòng sáng phân hủy trên môi trường CMC 1% và bột giấy lọc. Hoạt tính endoglucanase và exoglucanase được định lượng cụ thể qua phương pháp Nelson-Somogyi.
  • Phân giải tinh bột: Thu được các dòng vi khuẩn tạo vòng sáng rõ rệt trên môi trường tinh bột sau khi nhuộm lugol; định lượng hoạt tính enzyme amylase.
  • Phân giải protein: Thu được các dòng vi khuẩn có khả năng làm trong môi trường chứa gelatin, peptone và skim milk; định lượng hoạt tính protease theo phương pháp Cupp-Enyard.

Phần lớn khuẩn lạc vi khuẩn có dạng tròn hoặc không đều, độ nổi mô hoặc lài, bìa nguyên hoặc răng cưa, màu sắc trắng hoặc trắng sữa; tế bào hình que ngắn, chuyển động, bắt màu Gram dương và có khả năng sinh nội bào tử.

Nhóm nguồn mẫu phân lập Cơ chất khảo sát phân hủy Số dòng vi khuẩn ghi nhận Đặc điểm vi sinh vật chủ yếu
Rác thải và nước rỉ rác Cellulose (CMC, bột giấy) 26 dòng tế bào que, 22 dòng phân hủy CMC Gram dương, que ngắn, catalase (+), Methyl red (+)
Ruột sùng đất và trùn đất Cellulose (CMC, bột giấy) 50 dòng khảo sát hình thái/sinh hóa 10 dòng triển vọng phân hủy bột giấy lọc
Rác thải và nước rỉ rác Tinh bột gạo 1% 30 dòng Que ngắn, sinh catalase, Methyl red (+)
Ruột sùng đất và trùn đất Tinh bột gạo 1% 28 dòng hình thái, 27 dòng phân hủy tinh bột Tế bào que, di động, sinh amylase ngoại bào
Rác thải và nước rỉ rác Protein (Peptone, Casein) 29 dòng Hoạt tính protease cao ở các dòng RPp9, RPs19, RPg15
Ruột sùng đất và trùn đất Protein (Gelatin, Skim milk) 50 dòng khảo sát sinh hóa, 35 dòng phân hủy skim milk Hoạt tính protease ghi nhận ở các dòng triển vọng (TPs40...)

2. Kết quả định danh sinh học phân tử 20 dòng vi khuẩn triển vọng

Từ 213 dòng ban đầu, luận án chọn lọc 20 dòng vi khuẩn có hoạt tính enzyme ngoại bào cao nhất để giải trình tự đoạn gen 16S rRNA. Kết quả đối chiếu với cơ sở dữ liệu GenBank (NCBI) bằng công cụ BLASTN xác định toàn bộ 20 dòng đều thuộc chi Bacillus, bao gồm 8 loài/nhóm:

STT Loài vi khuẩn định danh Số dòng ghi nhận Tỷ lệ trong nhóm triển vọng (%)
1 Bacillus subtilis 6 30%
2 Bacillus megaterium 5 25%
3 Bacillus cereus 2 10%
4 Bacillus flexus 2 10%
5 Bacillus aquimaris 2 10%
6 Bacillus aryabhattai 1 5%
7 Bacillus licheniformis 1 5%
8 Bacillus sp. 1 5%
Tổng Chi Bacillus 20 100%

Phân tích quan hệ di truyền bằng phần mềm MEGA 5 đã xây dựng được cây phát sinh loài (phylogenetic tree) và biểu đồ haplotype, phản ánh nguồn gốc tiến hóa và mức độ tương đồng di truyền giữa các dòng phân lập từ ruột côn trùng và bãi rác Sóc Trăng.

3. Kết quả đánh giá hiệu quả ủ phân hữu cơ vi sinh tại bãi rác Đại Ngãi

Diễn biến quá trình ủ trong 35 ngày ở 5 nghiệm thức (NT1: Đối chứng; NT2: SEM 09; NT3: EM; NT4: EcoClean; NT5: Vi khuẩn luận án) cho thấy:

  • Mật số vi khuẩn hiếu khí tăng nhanh trong giai đoạn 7 - 14 ngày đầu, đạt đỉnh trên 10^8 - 10^9 CFU/g ở các mẻ có bổ sung vi sinh vật, sau đó ổn định ở pha hoai mục.
  • Nhiệt độ mẻ ủ tăng mạnh lên pha ưa nhiệt (đạt trên 50-60°C ở giai đoạn giữa), giúp ức chế vi sinh vật gây bệnh, sau đó hạ dần về nhiệt độ môi trường.
  • pH dao động từ hơi acid ở giai đoạn đầu, tăng lên trung tính và duy trì ở mức 6,8 - 7,5 ở ngày thứ 35.
  • Hàm lượng dinh dưỡng và chỉ tiêu thành phẩm: Mẻ ủ NT5 (vi khuẩn bản địa của luận án) có hiệu quả phân giải rác tương đương với các chế phẩm thương phẩm ngoại nhập (EcoClean) và chế phẩm đối chứng (EM, SEM 09). Tỷ lệ C/N của mẻ ủ giảm dần theo thời gian, kết thúc ở ngày thứ 35 đạt khoảng 10:1 - 15:1; các hàm lượng C, N, P, K đều thỏa mãn yêu cầu của Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7185:2002 đối với phân hữu cơ vi sinh.

4. Kết quả ứng dụng phân hữu cơ vi sinh trồng dưa leo

Thí nghiệm bón phân cho cây dưa leo (Cucumis sativus L.) tại huyện Trần Đề thu được các số liệu nông học cụ thể:

  • Nghiệm thức đối chứng NT1 (không bón phân) cho các chỉ tiêu sinh trưởng và năng suất thấp nhất.
  • Nghiệm thức NT4 (bón 50% phân hóa học kết hợp 50% phân hữu cơ vi sinh của luận án) cho các chỉ tiêu sinh trưởng và chất lượng trái không có sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê (p > 0,05 qua kiểm định Fisher LSD) so với nghiệm thức bón 100% phân bón hóa học truyền thống (NT2):
    • Chiều dài trái và đường kính trái tương đương nghiệm thức bón 100% hóa học.
    • Trọng lượng trái trung bình và số lượng trái/cây không có sự suy giảm.
    • Ngày ra hoa và ngày bắt đầu thu hoạch tương đương nhau giữa NT2 và NT4.
  • Kết quả khẳng định việc bổ sung phân hữu cơ vi sinh sản xuất từ nguồn rác thải ủ bằng vi khuẩn bản địa cho phép cắt giảm 50% lượng phân bón vô cơ mà vẫn đảm bảo năng suất dưa leo.

Chương 5: Kết luận và kiến nghị

Tổng kết ngắn gọn trong 1 trang các kết quả thu được về số lượng vi khuẩn phân lập (213 dòng), 20 dòng tuyển chọn thuộc chi Bacillus, hiệu quả ủ phân compost đạt tiêu chuẩn TCVN 7185:2002 và khả năng thay thế 50% phân hóa học trên cây dưa leo. Đề xuất kiến nghị ứng dụng chế phẩm vi sinh bản địa vào xử lý chất thải sinh hoạt nông thôn tại các bãi rác trên địa bàn tỉnh Sóc Trăng.

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt khoa học

  1. Luận án phân lập được 213 dòng vi khuẩn bản địa có khả năng phân hủy cellulose, tinh bột và protein từ nguồn rác hữu cơ, nước rỉ rác và hệ tiêu hóa của hai loài sinh vật đất tại Sóc Trăng là sùng đất (Holotrichia parallela) và trùn đất (Lumbricus terrestris).
  2. Tuyển chọn và định danh thành công 20 dòng vi khuẩn có hoạt tính enzyme ngoại bào mạnh bằng kỹ thuật giải trình tự gen 16S rRNA. Tất cả các dòng đều thuộc chi Bacillus, bao gồm 6 dòng Bacillus subtilis, 5 dòng Bacillus megaterium, 2 dòng Bacillus cereus, 2 dòng Bacillus flexus, 2 dòng Bacillus aquimaris, 1 dòng Bacillus aryabhattai, 1 dòng Bacillus licheniformis và 1 dòng Bacillus sp.
  3. Thiết lập được cây phả hệ phát sinh loài và phân tích haplotype di truyền của 20 dòng vi khuẩn tuyển chọn, bổ sung dữ liệu phân tử về nguồn gen vi sinh vật bản địa phân giải chất hữu cơ tại vùng đất Sóc Trăng. Cung cấp tư liệu khoa học tham khảo cho công tác nghiên cứu và giảng dạy chuyên ngành Vi sinh vật học môi trường.

Đóng góp mới về mặt thực tiễn

  1. Chứng minh tính khả thi của việc ứng dụng các dòng vi khuẩn Bacillus bản địa trong xử lý rác thải hữu cơ sinh hoạt quy mô mẻ ủ 100 kg tại bãi rác Đại Ngãi. Hiệu quả chuyển hóa rác và biến động mật số vi khuẩn, nhiệt độ, pH và tỷ lệ C/N của mẻ ủ dùng chủng bản địa hoàn toàn tương đương với các chế phẩm thương phẩm như EcoClean (nhập khẩu từ Mỹ), SEMSR và EM.
  2. Sản phẩm sau ủ đáp ứng các chỉ tiêu về hàm lượng Carbon, Nitơ, Kali và tỷ số C/N theo quy chuẩn chất lượng phân hữu cơ vi sinh của Việt Nam (TCVN 7185:2002).
  3. Ứng dụng thành công phân hữu cơ vi sinh vào canh tác thực tế trên cây dưa leo (Cucumis sativus L.) tại huyện Trần Đề; chứng minh công thức kết hợp 50% phân hữu cơ vi sinh + 50% phân hóa học duy trì các chỉ tiêu sinh trưởng và chất lượng trái (chiều dài, đường kính, trọng lượng, số trái, ngày ra hoa và thu hoạch) tương đương với quy trình bón 100% phân hóa học của nông dân, góp phần giảm chi phí phân hóa học và hạn chế suy thoái đất.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất

  • Triển khai nhân rộng mô hình ủ rác hữu cơ bằng chế phẩm vi sinh bản địa tại các bãi rác tập trung và quy mô nông hộ trên địa bàn tỉnh Sóc Trăng nhằm giảm thiểu thể tích rác chôn lấp lộ thiên.
  • Sử dụng phân bón hữu cơ vi sinh sản xuất từ rác thải để thay thế một phần phân bón vô cơ trong cơ cấu phân bón cho cây rau màu tại địa phương.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Dựa trên các dữ kiện được tác giả trình bày và phạm vi thực tế của luận án:

  • Về phạm vi thử nghiệm đồng ruộng: Thử nghiệm bón phân hữu cơ vi sinh mới chỉ dừng lại trên một đối tượng cây trồng duy nhất là cây dưa leo (Cucumis sativus L.) tại một địa điểm thử nghiệm (hộ ông Phạm Hữu Lai, xã Thạnh Thới Thuận, huyện Trần Đề); chưa mở rộng khảo nghiệm trên các loại cây ăn trái, cây công nghiệp hoặc cây lúa nước vốn là thế mạnh của tỉnh Sóc Trăng.
  • Về quy mô xử lý chất thải: Quy mô mẻ ủ thực nghiệm tại bãi rác Đại Ngãi được thực hiện trong các bồn gốm với khối lượng 100 kg/mẻ; chưa tiến hành khảo nghiệm ở quy mô đống ủ công nghiệp lớn hàng chục tấn hoặc hệ thống cơ giới hóa liên tục.
  • Về phổ phân loại vi sinh vật: Toàn bộ 20 dòng vi khuẩn tuyển chọn định danh qua giải trình tự 16S rRNA đều thuộc về một chi duy nhất là Bacillus; các nhóm vi sinh vật tiềm năng khác (như nấm mốc hoặc xạ khuẩn có trong các mẫu phân lập ban đầu) chưa được đi sâu định danh phân tử và đưa vào công thức phối trộn chế phẩm hỗn hợp.

Hướng nghiên cứu tiếp theo cần tập trung mở rộng quy mô đống ủ tại bãi rác tập trung, tối ưu hóa công thức phối trộn đa chủng vi sinh vật (kết hợp vi khuẩn với nấm và xạ khuẩn), và đánh giá hiệu lực của phân bón hữu cơ vi sinh trên nhiều nhóm cây trồng nông nghiệp khác nhau qua nhiều vụ canh tác liên tiếp.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo chuyên ngành có giá trị thực tiễn đối với nhiều nhóm đối tượng:

  • Đối với nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên ngành Vi sinh vật học, Công nghệ Sinh học và Khoa học Môi trường: Luận án cung cấp quy trình thực nghiệm chuẩn mực về phân lập vi sinh vật từ các nguồn cơ chất phức tạp (rác thải và ruột động vật không xương sống), quy trình kiểm tra hoạt tính enzyme ngoại bào (phương pháp đục giếng thạch, định lượng cellulase/amylase bằng Nelson-Somogyi và protease bằng Cupp-Enyard), và kỹ thuật định danh phân tử đoạn gen 16S rRNA sử dụng cặp mồi 27F - 1492R.
  • Đối với giảng viên và cơ sở đào tạo đại học: Cung cấp tư liệu dẫn chứng cụ thể về vi sinh vật học ứng dụng, công nghệ sinh học môi trường và quản lý chất thải rắn tại Đồng bằng sông Cửu Long.
  • Đối với cán bộ quản lý môi trường và các đơn vị dịch vụ đô thị tại địa phương: Dữ liệu phân tích thành phần rác thải tại các chợ (Sóc Trăng, Mỹ Xuyên, Trần Đề) và quy trình ủ phân hiếu khí quy mô bồn 100 kg là cơ sở khoa học trực tiếp để xây dựng các phương án xử lý rác hữu cơ tại nguồn, giảm tải cho các bãi chôn lấp.
  • Đối với kỹ sư nông nghiệp và nhà vườn: Công thức phối trộn 50% phân hữu cơ vi sinh sản xuất từ rác phân hủy kết hợp 50% phân hóa học cung cấp giải pháp canh tác giảm thiểu chi phí vật tư đầu vào cho cây họ bầu bí.

Câu hỏi thường gặp

1. Luận án đã phân lập được bao nhiêu dòng vi khuẩn và bao nhiêu dòng được chọn để định danh sinh học phân tử? Tác giả đã phân lập được 213 dòng vi khuẩn bản địa có khả năng phân hủy cellulose, tinh bột và protein từ rác thải, nước rỉ rác và ruột của sùng đất (Holotrichia parallela), trùn đất (Lumbricus terrestris). Trong đó, 20 dòng có hoạt tính enzyme ngoại bào (cellulase, amylase, protease) mạnh nhất được chọn để giải trình tự gen 16S rRNA.

2. Kết quả định danh sinh học phân tử của 20 dòng vi khuẩn triển vọng cho thấy chúng thuộc những loài nào? Tất cả 20 dòng vi khuẩn triển vọng đều thuộc chi Bacillus, bao gồm 8 nhóm loài: Bacillus subtilis (6 dòng), Bacillus megaterium (5 dòng), Bacillus cereus (2 dòng), Bacillus flexus (2 dòng), Bacillus aquimaris (2 dòng), Bacillus aryabhattai (1 dòng), Bacillus licheniformis (1 dòng) và Bacillus sp. (1 dòng).

3. Hiệu quả xử lý rác hữu cơ của các dòng vi khuẩn bản địa so với các chế phẩm sinh học thương mại như thế nào? Tại bãi rác Đại Ngãi (huyện Long Phú), mẻ ủ bổ sung vi khuẩn của luận án (NT5) cho thấy sự biến động về mật số vi khuẩn hiếu khí, nhiệt độ đống ủ (đạt pha ưa nhiệt), pH và tỷ lệ C/N tương đương với các nghiệm thức sử dụng chế phẩm EcoClean (nhập khẩu từ Mỹ), SEMSR và EM. Sản phẩm phân hữu cơ vi sinh sau 35 ngày ủ đáp ứng các chỉ tiêu về Carbon, Nitơ, Kali và tỷ lệ C/N theo tiêu chuẩn TCVN 7185:2002.

4. Khi sử dụng phân hữu cơ vi sinh của luận án bón cho cây dưa leo, kết quả sinh trưởng và năng suất đạt được ra sao? Thực nghiệm tại huyện Trần Đề trên cây dưa leo (Cucumis sativus L.) chứng minh rằng công thức bón 50% phân hữu cơ vi sinh của luận án kết hợp 50% phân hóa học (NT4) giúp giảm 50% lượng phân hóa học mà các chỉ tiêu nông học gồm chiều dài trái, đường kính trái, trọng lượng trái, số trái/cây, ngày ra hoa và ngày thu hoạch khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) so với công thức bón 100% phân bón hóa học truyền thống (NT2).

5. Luận án sử dụng những phương pháp nào để định lượng hoạt tính các enzyme cellulase, amylase và protease? Hoạt tính enzyme endoglucanase, exoglucanase (hệ cellulase) và amylase được định lượng dựa trên hàm lượng đường khử sinh ra theo phương pháp Nelson-Somogyi (Nelson, 1944) đo mật độ quang ở bước sóng 520 nm. Hoạt tính enzyme protease được xác định thông qua hàm lượng tyrosine giải phóng từ cơ chất casein phản ứng với thuốc thử Folin theo phương pháp Cupp-Enyard (2008) đo ở bước sóng 660 nm.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Mai Thi đã giải quyết trọn vẹn chuỗi nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học trong xử lý rác thải hữu cơ tại tỉnh Sóc Trăng, từ khâu phân lập 213 dòng vi khuẩn bản địa đến việc tuyển chọn và định danh 20 dòng vi khuẩn thuộc chi Bacillus có hoạt tính enzyme ngoại bào cao. Thực nghiệm tại bãi rác Đại Ngãi khẳng định chế phẩm vi khuẩn bản địa có khả năng chuyển hóa chất thải rắn sinh hoạt thành phân hữu cơ vi sinh đạt tiêu chuẩn TCVN 7185:2002 với hiệu quả tương đương các chế phẩm thương phẩm ngoại nhập. Việc ứng dụng nguồn phân hữu cơ này trên đồng ruộng cho phép cắt giảm 50% lượng phân bón hóa học trong canh tác dưa leo mà vẫn duy trì năng suất và phẩm chất trái, đóng góp giải pháp thiết thực cho công tác bảo vệ môi trường và phát triển nông nghiệp bền vững tại địa phương.