MỞ ĐẦU Trong quá trình cố định vi sinh vật, vật liệu và phƣơng pháp cố định là hai yếu tố mang tính chất quyết định đến hiệu quả của việc cố định vi sinh vật. Trong đó, đặc biệt tính chất của vật liệu cố định (hay còn gọi là chất mang) là cơ sở cho sự lựa chọn phƣơng pháp cố định. Trên thế giới, chất mang có tính chất là polymer tổng hợp đã đƣợc nghiên cứu và sử dụng trong những thập niên 70 – 80 đa dạng với các vật liệu nhƣ: Sephadex, polyacrylamid, polyvinylacetat, polystyren, polyetylen, polyhydroxyetyl metacrylat… Tuy nhiên, ngoài những ƣu điểm là bền, độ trƣơng và khả năng cố định tốt thì nhƣợc điểm của những chất mang này là giá thành cao, không tƣơng hợp sinh học và không phân hủy sinh học đƣợc cho nên ít đƣợc sử dụng [3]. Từ những nhƣợc điểm polymer tổng hợp mang lại, polymer sinh học đã đƣợc chú ý nghiên cứu và sử dụng với các sản phẩm nhƣ: chitin, chitosan, alginate… Đây là những sản phẩm tự nhiên, phong phú, rẻ tiền và có khả năng phân hủy sinh học nên thân thiện với môi trƣờng.
Bên cạnh đó, nhƣợc điểm mắc phải của loại chất mang này là độ trƣơng thấp, tính chất cơ lý kém bền và không đồng nhất. Chính vì những lý do trên, việc nghiên cứu và tìm kiếm chất mang thay thế có những ƣu điểm ƣu việt, đồng thời khắc phục những nhƣợc điểm của những chất mang trên là cần thiết. Cellulose vi sinh vật (hay còn gọi là microbial cellulose - MC) hay cụ thể hơn cellulose vi khuẩn (bacterial cellulose - BC) là một loại polymer sinh học đƣợc xem là nguồn nguyên liệu tiềm năng và đã đƣợc ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau nhƣ y học, thực phẩm [4],[25], công nghiệp dệt [26], mỹ phẩm…[27]. Các nghiên cứu về tính chất hóa lý, cơ lý của BC cho thấy BC đáp ứng đƣợc các yêu cầu lý tƣởng của vật liệu cố định [17],[18],[50].
Đề tài này nhằm tìm hiểu và mở ra một hƣớng ứng dụng mới của BC: ―Nghiên cứu thu nhận cellulose vi khuẩn làm chất mang trong kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật‖. CHƢƠNG 2 – TỔNG QUAN 2.1 Giới thiệu về cellulose vi khuẩn (BC) và Acetobacter xylinum.1 Các vi sinh vật sản sinh BC Ngoài thực vật, nấm và tảo có cellulose là thành phần cấu trúc cơ bản hình thành nên vách tế bào, cellulose còn đƣợc tổng hợp bởi một số loài vi khuẩn, đƣợc gọi là cellulose vi khuẩn (bacterial cellulose – BC) (bảng 2. Con đƣờng tổng hợp và cơ chế điều hòa tổng hợp BC ở các loài giống nhau, nhƣng cấu trúc BC ở mỗi loài thì khác nhau [18]. Có các điểm khác biệt đáng kể về thuộc tính vật lý của các sản phẩm cellulose, chủ yếu là chiều dài của chuỗi glucan (đƣợc đặc trƣng bởi mức độ polymer hóa), tính kết tinh và trạng thái kết tinh của nó.
Tùy thuộc vào mỗi loại mà trạng thái kết tinh của cellulose khác nhau. Từ đó tính chất vật lý của sản phẩm nhƣ độ bền, độ hòa tan trong các dung môi, tính chịu ảnh hƣởng của các tác nhân biến tính cũng khác nhau [43]. Cấu trúc BC ở một số loài vi khuẩn. Giống Cấu trúc cellulose Acetobacter Lớp sợi ngoại bào tạo thành các dãy.
Achromobacter Sợi Aerobacter Sợi Agrobacterium Sợi ngắn. Alcaligen Sợi Pseudomonas Các sợi không tách biệt. Rhizobium Sợi ngắn. Sarcina Cellulose dị hình.
Zoogloea Chƣa xác định rõ cấu trúc. xylinus), là vi sinh vật tạo cellulose hữu hiệu nhất. Gần đây, nó đƣợc xếp vào giống mới Gluconacetobacter, bao gồm các loài là G. Những nghiên cứu về cellulose vi khuẩn tập trung vào đối tƣợng A.
xylinum cả về nghiên cứu cơ bản và các ứng dụng rộng rãi [39].2 Sơ lƣợc về vi khuẩn Acetobacter xylinum 2.1 Phân loại Theo Bergey, A. xylinum thuộc hệ thống phân loại sau: Lớp: Schizomycetes Bộ: Pseudomonadales Bộ phụ: Pseudomonadieae Họ: Pseudomonadaceae Loài: Acetobacter xylinum [14] 2.2 Đặc điểm về hình thái Hình 2. xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, có thể di động hoặc không di động và không sinh bào tử. xylinum đứng riêng lẽ hoặc kết thành chuỗi dài, có khả năng tạo váng dày trên môi trƣờng nuôi cấy [4].3 Đặc điểm sinh lý và sinh hóa của A.
xylinum là vi khuẩn Gram âm, nhƣng đặc điểm Gram của chúng có thể bị biến đổi do tế bào già đi hay do điều kiện môi trƣờng. xylinum thuộc loại vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, nên chúng tăng trƣởng ở bề mặt tiếp xúc giữa môi trƣờng lỏng và môi trƣờng khí [3],[30],[34]. Chúng không sử dụng muối NH4 làm nguồn N duy nhất, đồng thời trên bề mặt môi trƣờng dịch thể tạo thành màng dày nhầy, có chứa cellulose [11]. xylinum có thể sử dụng nhiều nguồn đƣờng khác nhau và tùy thuộc vào chủng mà nguồn đƣờng nào đƣợc sử dụng tốt nhất.
Chúng có thể chuyển glucose thành acid gluconic, điều này làm cho pH môi trƣờng giảm từ 1 đến 2 đơn vị [34]. xylinum phát triển là từ 25 đến 30oC và pH từ 5,4 đến 6,3 [30]. Theo Hestrin (1947), pH tối ƣu của A. xylinum là 5,5 và chúng không phát triển ở nhiệt độ 37oC ngay cả trong môi trƣờng dinh dƣỡng tối ƣu [27].
Khi nuôi trên môi trƣờng đặc, lúc tế bào còn non, khuẩn lạc mọc riêng rẽ, nhầy và trong suốt, xuất hiện sau 3 đến 5 ngày. Khi già, tế bào mọc dính nhau thành từng cụm và khuẩn lạc mọc theo đƣờng nuôi cấy [7].3 Các đặc điểm của cellulose vi khuẩn (bacterial cellulose – BC) 2.1 Đặc điểm về cấu trúc của BC Cellulose là một polymer không phân nhánh bao gồm những gốc glucopyranose nối với nhau bởi nối β-1,4. Các nghiên cứu cơ bản về BC cho thấy, BC có cấu trúc hóa học giống y hệt PC (plant cellulose – cellulose thực vật). Tuy nhiên, cấu trúc đa phân và thuộc tính của BC khác với PC.
Các sợi mới sinh ra của BC kết lại với nhau để hình thành nên các sợi sơ cấp (subfibril), có chiều rộng khoảng 1,5nm, là những sợi mảnh nhất có nguồn gốc tự nhiên. Các sợi cơ bản kết lại thành các vi sợi (microfibril). Các vi sợi nằm trong các bó (bundle), và cuối cùng hình thành các dải (ribbon). Trong khi chiều rộng của các sợi cellulose đƣợc tạo ra từ gỗ thông là 30.000 nm hay gỗ bulô (Betula) là 14.
Những dải vi sợi cellulose mịn có chiều dài thay đổi từ 1 – 9 µm làm hình thành nên cấu trúc lƣới dày đặc, đƣợc ổn định bởi các nối hydrogen [5],[18],[29]. BC khác PC về chỉ số kết chặt, về mức độ polymer hóa. BC có mức độ polymer hóa từ 2.000; một vài trƣờng hợp đạt tới 16.000, trong khi mức polymer hóa ở thực vật là 13. So với PC, BC có độ kết tinh cao hơn, thấm nƣớc tốt hơn, sức bền cơ học ở trạng thái ẩm cao hơn và dễ uốn nắn hơn [5],[18],[29].
BC đƣợc hình thành qua một quá trình phức tạp gồm nhiều giai đoạn, cho sản phẩm có kích thƣớc khác nhau theo sơ đồ sau: Sợi sơ cấp-subfibril vi sợi-microfibril bó-bundle dải-ribbon [37] (rộng 1,5 nm) (rộng 3,0-3,5nm) (rộng 40-60nm) Cấu trúc của BC phụ thuộc chặt chẽ vào điều kiện nuôi cấy. Ở điều kiện nuôi cấy tĩnh. Vi khuẩn tổng hợp những miếng cellulose trên bề mặt của dịch nuôi cấy, tại ranh giới giữa bề mặt dịch lỏng và không khí giàu oxy. Các miếng BC này đƣợc gọi là BC trên môi trƣờng tĩnh (S-BC: Static BC).
Các sợi cellulose sơ cấp liên tục đƣợc đẩy ra từ những lỗ đƣợc xếp dọc trên bề mặt của tế bào vi khuẩn, kết tinh lại thành các vi sợi, và đẩy xuống sâu hơn trong môi trƣờng dinh dƣỡng. Các dải cellulose từ môi trƣờng tĩnh tạo nên các mặt phẳng song song nhƣng không tổ chức, có vai trò chống đỡ cho quần thể tế bào A. Các sợi BC kế nhau đƣợc tạo ra từ môi trƣờng tĩnh nối với nhau và bẻ nhánh ít hơn các sợi BC đƣợc tạo từ môi trƣờng lắc (A-BC: Agitated-BC). A-BC đƣợc tạo ra dƣới dạng các hạt nhỏ, các hạt hình sao và các sợi dài, chúng phân tán rất tốt trong môi trƣờng.
Các sợi đan lƣới với nhau trong môi trƣờng lắc giống nhƣ mô hình kẻ ô, có cả hai hƣớng song song và vuông gốc [5],[18]. Sự khác nhau về cấu trúc không gian ba chiều của hai dạng S-BC và A-BC đƣợc quan sát rõ ràng hơn bằng kính hiển vi điện tử quét (scanning electron microscope). Những sợi S-BC kéo dài và chồng trên các sợi khác theo chiều đan chéo nhau. Những sợi A-BC thì rối rắm và cong (hình 2.
Ngoài ra, bề mặt cắt ngang của sợi A-BC (0,1-0,2µm) lớn hơn sợi S-BC (0. Sự khác nhau về hình thái giữa hai loại BC này làm mức độ kết tinh, kích cỡ kết tinh của chúng khác nhau [5],[17]. A-BC đƣợc tạo ra từ môi trƣờng lắc (a) và S-BC đƣợc tạo ra từ môi trƣờng tĩnh (b) [36]. Hai dạng kết tinh phổ biến của cellulose trong tự nhiên là I và II, đƣợc phân biệt bởi các kỹ thuật phân tích bằng tia X, quang phổ, và tia hồng ngoại.
Cellulose I có thể đƣợc chuyển thành cellulose II, nhƣng cellulose II thì không thể chuyển thành cellulose I. Cellulose I đƣợc tổng hợp bởi đa số thực vật và A. xylinum ở môi trƣờng tĩnh. Các chuỗi β-1,4-glucan ở cellulose I đƣợc sắp xếp song song với nhau theo một trục.
Trong khi đó, các chuỗi β-1,4-glucan ở cellulose II thì xếp một cách ngẫu nhiên, hầu nhƣ không song song và nối với nhau bởi một số lƣợng lớn nối hydrogen, làm cho cellulose II có độ bền về nhiệt. Rất ít tế bào Eukaryota tổng hợp cellulose II. xylinum thì tổng hợp đƣợc cả 2 loại cellulose I và II [18],[19]. Trong phân tử cellulose I có sự hiện diện của Iα và Iβ, do đƣợc cấu tạo bởi glucose dạng α hay dạng β.
Dạng Iβ bền về nhiệt động học hơn [19]. Glucose dạng α và glucose dạng β là hai dạng đồng phân không gian của nhau. Hai dạng đồng phân này chỉ khác nhau ở sự định hƣớng của nhóm hydroxyl [6]. Hai dạng này có ở các cellulose có nguồn gốc từ tảo, vi khuẩn , thực vật.
BC có dạng Iα nhiều hơn PC. S-BC có nhiều dạng Iα hơn A-BC. Sự khác nhau về tỉ lệ Iα giữa hai loại S-BC và A-BC làm phóng đại các chỉ số kết tinh, chỉ số Iα tỉ lệ thuận với kích cỡ kết tinh. A- BC có chỉ số kết tinh thấp hơn và kích cỡ kết tinh nhỏ hơn S-BC [5],[18].
Một phần đáng kể cellulose II có ở A-BC. Trong tự nhiên, cellulose II chỉ đƣợc tổng hợp ở một vài vi sinh vật (một số tảo, mốc, và vi khuẩn nhƣ Sarcina ventriculi, A. Hiện nay, sản phẩm công nghiệp của cellulose II chủ yếu có đƣợc là dựa trên sự biến đổi hóa học cellulose thực vật [18]. (a) (b) Tế bào vi khuẩn Cellulose của thực vật Hình 2.