MỞ ĐẦU Trong những năm gần đây, nhu cầu về nguồn chất màu tự nhiên ngày càng tăng cao, do nhận thức được lợi ích tích cực từ các hợp chất tự nhiên mang lại cho sức khỏe. Vì vậy, đòi hỏi phải tìm kiếm các nguồn chất màu thực phẩm tự nhiên và phát triển tiềm năng sử dụng của chúng. Trong đó, crocin là chất màu đang được quan tâm. Crocin là một thành phần có màu vàng đặc trưng có trong nhụy nghệ tây (Crocus sativus) và hạt dành dành (Gardenia jasminoides Ellis).
Nhụy hoa nghệ tây được biết là một loại gia vị đắt tiền nhất trên thế giới và là một loại cây có tính “khan hiếm” được mệnh danh là “vàng đỏ” phương Đông nên tính kinh tế cho việc điều chế chất màu từ nguồn nguyên liệu này sẽ không thể hiệu quả như hạt dành dành. Cây dành dành là một loài cây phổ biến ở Việt Nam với sản lượng thu hoạch quả nhiều, giá thành thấp nên chọn cây dành dành là đối tượng nghiên cứu để trích ly crocin. Bên cạnh crocin, geniposide là thành phần chính trong nhóm hợp chất glycoside iridoid, cũng là một thành phần chiếm hàm lượng khá cao trong hạt dành dành. Geniposide đã được chứng minh có nhiều tác dụng trong y học như bảo vệ mật, gan, và hệ thần kinh; kháng viêm, kháng oxy hoá; và chống đái tháo đường, chống ung thư,… Tuy nhiên, một số nghiên cứu về độc học cũng đã chỉ ra rằng việc sử dụng quá liều geniposide có thể dẫn đến gây độc gan.
Với các phương pháp truyền thống thì việc tách chiết chất màu crocin và geniposide chưa được hiệu quả, tốn nhiều chi phí, thời gian dài không mang lại tính kinh tế. Trong khóa luận này, tôi chọn phương pháp trích ly hai pha nước để trích ly chất màu crocin và geniposide, đây là phương pháp tiềm năng có nhiều ưu điểm hơn so với các phương pháp truyền thống như tính chọn lọc cao, chi phí thấp, các dung môi được sử dụng thân thiện với môi trường, có khả năng thu hồi được các chất đã sử dụng để hình thành hệ. Với hy vọng có thể phát huy tối đa lợi ích và nâng cao giá trị của các chất có trong hạt dành dành cùng với việc nghiên cứu và phát triển thêm về hướng trích ly bằng phương pháp trích ly hai pha nước nên tôi quyết định nghiên cứu đề tài “Trích ly chất màu từ hạt dành dành (Gardenia jasminoides Ellis) bằng phương pháp trích ly hai pha nước”. xi CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về crocin 1.1 Đặc điểm và nguồn gốc của crocin Crocin là một trong số ít carotenoid tan trong nước, màu đỏ đậm ở dạng khô, cho màu sắc từ màu vàng đến màu cam trong dịch chiết từ hoa nghệ tây, Crocus sativus (C.
Crocin được tìm thấy trong hạt dành dành, Gardenia jasminoides Ellis (G. jasminoides), thuộc chi Gardenia, họ Rubiaceae [2]. Một số bộ phận của cây dành dành được thể hiện trong Hình 1.1 Hoa và quả dành dành Crocin là các ester glycosyl hoặc gentiobiosyl của polyene dicarboxylic acid (8,8- diapocarotene-8,8-dioic acid hay còn gọi là crocetin) [3]. Phân tử crocin bao gồm chuỗi 16 carbon, có 7 liên kết đôi liên hợp, 4 nhóm methyl và một nhóm ester ở mỗi đầu.
Trong đó gốc R1, R2 có thể là các gốc gentiobiosyl (Gen) hoặc glucosyl (Glu). Cấu trúc của crocetin và các dẫn xuất crocin được trình bày lần lượt trong Hình 1.2 Cấu trúc của crocetin 1 Gentiobiosyl (Gen) Glucosyl (Glu) Hình 1.3 Công thức tổng quát của crocin Crocin-1: R1=R2=Gen Crocin-3: R1=Gen; R2=H Crocin-2: R1=Gen; R2=Glu Crocin-4: R1=Glu; R2=H Cis crocin-1: R1=R2=Gen Crocin là thành phần chính tạo màu vàng cho hạt dành dành. Bên cạnh nhóm hợp chất crocin, một số thành phần hóa học của hạt dành dành đã được phân lập gồm các hợp chất thuộc nhóm iridoid, iridoid glycoside, triterpenoid, acid hữu cơ, dẫn xuất phenol và các hợp chất dễ bay hơi khác. Các chất thuộc nhóm iridoid và iridoid glycoside rất giàu trong hạt dành dành bao gồm geniposide (1), genipin (2) và gardenoside (3).
Đã có rất nhiều những nghiên cứu trong và ngoài nước cho thấy rằng chúng có nhiều tác dụng tích cực đến sức khỏe của con người. Hàm lượng của iridoid glycoside có thể thay đổi tùy vào các vùng nguyên liệu khác nhau trong khoảng 5-6%. Hiệu suất của geniposide có thể đạt 10,9% trong một số điều kiện chiết xuất nhất định [5].4 Cấu trúc của nhóm iridoid và iridoid glycoside trong hạt dành dành. Terpenoid trong dành dành bao gồm secoiridoid và monoterpenoid.
Một số terpenoid, đặc biệt là một số lượng nhỏ nguyên tử carbon, tồn tại trong dầu dễ bay hơi. Các terpenoid tiêu biểu là 6’-O-trans-Sinapoyljasminoside C (4), Rehmapicrogenin (5) [5].5 Cấu trúc của terpenoid trong hạt dành dành. Một số acid phenolic trong dành dành được xác định là 3,5-di-O-caffeoyl-4-O-(3- hydroxy-3-methyl) glutaroylquinic acid (6), 3,5-di-O-caffeoylquinic aicd (7) và chlorogenic acid (8). Một lignin glucoside mới, (+)-(7S,8R,8′R)- lyoniresinol 9-O-β - D-(600-O-trans-sinapoyl) glucopyranoside (9) đã được tìm thấy trong dành dành [5].6 Cấu trúc của một số acid phenolic trong hạt dành dành.
Các hợp chất dễ bay hơi chính trong tinh dầu của dành dành là acid béo, ketone, aldehyde, ester, alcohol và các dẫn xuất thơm. Do nhiệt độ và thời gian gia nhiệt khác nhau nên tinh dầu từ dành dành sẽ chứa hàm lượng và tỷ lệ các hợp chất dễ bay hơi khác nhau. Ngoài ra các thành phần kém bền như các hợp chất thuộc nhóm iridoid có thể bị biến đổi một phần tạo thành các thành phần dễ bay hơi trong quá trình xử lý ở nhiệt độ cao [5]. Các hợp chất bay hơi chiếm tỷ lệ cao nhất trong dành dành là myristic acid (10) chiếm 15,3%, pentadecane (11) 15,14%, palmitic acid (12) 13,7% [6].7 Cấu trúc của các hợp chất dễ bay hơi trong tinh dầu dành dành.2 Hoạt tính sinh học của crocin Crocetin (Hình 1.2) có nhiều tác dụng dược lý khác nhau như chống viêm, hạn chế xơ vữa động mạch, chống ung thư, bảo vệ thần kinh, tác dụng hạ huyết áp, chống đông máu, ức chế tổn thương võng mạc,… [5].3) là ester digentiobiosyl của crocetin, có hoạt tính sinh học cao, nhiều tác dụng y học như điều trị viêm, vàng da, nhức đầu, phù, sốt, viêm gan, tăng huyết áp [7], chống tăng mỡ trong máu và bảo vệ gan bị tổn thương [8], chống co giật-bảo vệ thần kinh [9], chống trầm cảm [10], kháng u [11], bảo vệ dạ dày [12].
Crocin có đặc tính chống ung thư, được ưu tiên lựa chọn để bổ sung vào những thực phẩm hòa tan trong nước [13]. Ngoài ra, crocin với độ tinh khiết trên 99,6% có hoạt tính chống oxy hóa ở nồng độ từ 40 ppm. Thử nghiệm thiocyanate cho thấy ở nồng độ 40 ppm, sự ức chế quá trình oxy hóa bằng crocin là 80% khi so sánh với mẫu trắng. Ở mức 20 ppm, hoạt động chống oxy hóa của crocin tương đương với hoạt động của butylated hydroxyanisole (BHA) [14].
Qua kết quả thực nghiệm của Nguyễn Thị Thúy Diễm và cộng sự, dịch trích crocin bằng hệ ATPS ethanol-potassium phosphate với giá trị nồng độ ức chế 50% đối tượng thử half maximal inhibitory concentration (IC50) đối với hoạt tính ức chế 1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là 28,86 μg/mL.3 Các phương pháp trích ly crocin Crocin là một chất màu đang được quan tâm, nên hiện nay có nhiều phương pháp trích ly crocin từ dành dành đã được nghiên cứu như phương pháp trích ly truyền thống với các loại dung môi khác nhau như methanol, ethanol, 1-propanol hoặc 2-propanol [16], phương pháp trích ly với sự hỗ trợ vi sóng [5], phương pháp trích ly nhờ sự hỗ trợ của sóng siêu âm [1], phương pháp trích ly lỏng siêu tới hạn [17]. Bên cạnh đó, phương pháp chiết pha rắn đánh dấu phân tử polymer cho phép chiết xuất chọn lọc crocin với độ thu hồi cao (84%) từ một hỗn hợp phức tạp [18].4 Các phương pháp xác định hàm lượng crocin Phương pháp quang phổ UV-Vis là phương pháp phân tích định lượng dựa vào hiệu ứng hấp thu xảy ra khi phân tử vật chất tương tác với bức xạ điện từ. Các hợp chất 5 khác nhau trong hạt dành dành có đặc tính hấp thu UV-Vis khác nhau. Trong đó, điều kiện phát hiện để xác định geniposidic acid và geniposide là ở bước sóng 240 nm và đối với crocin-1 và crocin-2 là 440 nm [19].
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một kỹ thuật để tách, định tính, định lượng và xác định các thành phần không bay hơi trong hỗn hợp. Năm 2016, Hong-Ping Zhang và cộng sự đã phân tích crocin-1 và geniposide bằng HPLC với cột sắc ký silica gel pha đảo C18 (4,6 mm × 250 mm, 5 μm) và đầu dò mảng diode SPD- M20A với bước sóng lần lượt là 440 nm và 238nm cho crocin-1 và geniposide [20].2 Tổng quan về phương pháp trích ly hai pha nước (ATPE) 1.1 Giới thiệu phương pháp trích ly hai pha nước Vào những năm 1950, Albertson đã phát hiện ra rằng dung dịch nước của polyethylene glycol (PEG) và muối phosphate trong một phạm vi nồng độ nhất định có khả năng phân tách thành hai pha, một pha giàu polymer và một pha giàu muối [21]. Từ đó, kỹ thuật trích ly hai pha nước (aqueous two-phase extraction-ATPE) đã trở thành một công cụ mạnh mẽ để phân tách một loạt các vật liệu sinh học bao gồm tế bào thực vật và động vật, vi sinh vật, nấm và bào tử của chúng, virus, lục lạp, ty thể, túi màng, protein và nucleic acid [22]. Một trong những ưu điểm chính của kỹ thuật này là môi trường tương thích sinh học, cân bằng pha rất nhanh, chi phí thấp, các dung môi được sử dụng để tạo thành pha thường thân thiện với môi trường, có khả năng thu hồi các chất đã sử dụng để hình thành hệ [23].
Tuy ATPE là một phương pháp trích ly đầy ưu điểm nhưng bên cạnh đó vẫn tồn tại những hạn chế như sự chưa hiểu biết rõ ràng về cơ chế tách pha liên quan đến hệ APTS. Với việc ngày càng có nhiều nghiên cứu và có thêm sự hỗ trợ của các phương pháp khác sẽ giúp cho phương pháp ATPE ngày càng phát triển hoàn thiện hơn, sẽ hứa hẹn là một bước đột phá trong việc thu nhận các sản phẩm có giá trị sinh học cao [24].2 Hệ hai pha nước (ATPS) Phương pháp ATPE dần được phát triển với các hệ hai pha nước (aqueous two-phase system-ATPS) khác nhau. Hiện nay, hệ ATPS có thể được phân thành năm nhóm: polymer-polymer, polymer-muối, alcohol-muối, các micellar và các chất lỏng ion. 6 Trong đó, hệ ATPS polymer-polymer và polymer-muối có lợi thế hơn các hệ dung môi hữu cơ thông thường cho sự phân tách các hoạt chất sinh học [25].3 Giản đồ pha Giản đồ pha giống như “dấu vân tay” của hệ ATPS trong một điều kiện xác định.