CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Tổng quan về cellulose vi khuẩn 1. Cellulose vi khuẩn là gì? Năm 1838, cellulose được phát hiện là một loại polysaccharide thẳng không bị hòa tan trong nước và thể hiện tính ưa nước. Khi được xử lý qua acid đặc tại nhiệt độ cao cấu trúc phân tử đối xứng của cellulose bị thủy phân thành các đơn phân glucose [9].
Cellulose ngày nay được biết đến là thành phần chính cấu tạo nên thành tế bào của thực vật, những nguồn cung cấp cellulose chủ yếu bao gồm sợi bông, cây gai dầu khô, và gỗ chứa lần lượt 90%, 40–50% và 60% cellulose. Cellulose có vai trò quan trọng trong các ngành công nghiệp giấy, dệt may và trong sản xuất bột giấy cho nhiều mục đích khác nhau [22, 48, 113]. Ngoài nguồn gốc thực vật, cellulose ngày nay còn được biết tới là sản phẩm của một số vi sinh vật như nấm men, vi khuẩn và tảo. Năm 1886, Brown đã lần đầu phát hiện ra một loại cellulose được sinh ra bởi vi khuẩn Acetobacter xylinum [14].
Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng cellulose có thể được tổng hợp bởi nhiều loại vi khuẩn khác nhau bao gồm cả vi khuẩn gram âm như Acetobacter, Azotobacter, Rhizobium, Agrobacterium, Pseudomonas, Salmonella, Alcaligenes và vi khuẩn gram dương như Sarcina ventriculi [44]. Cellulose được tổng hợp bởi các vi khuẩn khác nhau thì có cấu trúc, hình thái và tính chất khác nhau và chúng cũng được sử dụng với các mục đích khác nhau. Cấu trúc cellulose vi khuẩn Giống như cellulose thực vật, phân tử cellulose vi khuẩn (BC) là một chuỗi các đơn phân b-D-glucose được trùng hợp với nhau thông qua liên kết b-1,4- glucan, nghĩa là liên kết giữa nhóm OH tại C4 của đơn phân này liên kết với carbon C1 của đơn phân liền kề. BC được cấu tạo bởi cấu trúc vi sợi độc đáo, mỗi vi sợi này lại được cấu tạo bởi nhiều vi sợi nhỏ hơn xoắn vào nhau [15].
Kích thước của vi sợi phụ thuộc vào kích thước tinh thể của từng vi sợi được đo đạc bằng nhiễu xạ tia X [65]. BC còn có một tính chất tinh thể độc đáo khi mà chúng được kết tinh thành hai 4 Luận văn thạc sĩ Đào Quang Khải dạng tinh thể riêng biệt là cellulose Ia và cellulose Ib [7, 97]. Trong cấu trúc cellulose Ia có tồn tại liên kết hydro nội phân tử O3-H®O5’ và liên kết hydro liên phân tử O6- H®O3’, trong cấu trúc cellulose Ib thì liên kết hydro nội và liên phân tử đều là O6’- H®O3’ [16]. Năm 1991 Sugiyama và nhóm nghiên cứu đã đề xuất rằng các ô tinh thể ba nghiêng được cấu tạo bởi một chuỗi cellulose Ia trong khi đó các ô tinh thể đơn nghiêng được cấu tạo bởi hai chuỗi cellulose Ib [88].1: Cấu trúc cellulose vi khuẩn.
a) cấu tạo phân tử của cellulose, b) liên kết hydro trong cấu trúc cellulose Ia (đỏ-liên kết liên phân tử, xanh-liên kết nội phân tử), c) cấu trúc tinh thể ba nghiêng của cellulose Ia, d) liên kết hydro trong cấu trúc cellulose Ib, e) cấu trúc tinh thể đơn nghiêng của cellulose Ib [88] Thành phần cellulose Ia trong BC chiếm tới gần 60% và phần còn lại là cellulose Ib. Trong khi đó cellulose thực vật chỉ chứa khoảng 30% là cellulose Ia [7, 5 Luận văn thạc sĩ Đào Quang Khải 97]. Sợi bông, sợi gai và gỗ có thành phần chủ yếu là cellulose Ib. Dù sự chiếm ưu thế của cellulose Ia trong BC đã được khẳng định qua các nghiên cứu, tuy nhiên có rất ít báo cáo về sự liên hệ giữa cấu trúc tinh thể và tính chất của BC.
Tỷ trọng của cellulose Ia được tính toán trên một ô mạng đơn vị có giá trị nhỏ hơn của cellulose Ib, cellulose Ia cũng được biết là dạng nửa bền của cellulose, chúng có thể chuyển đổi thành cellulose Ib thông qua xử lý nhiệt [109]. Các tính chất của cellulose vi khuẩn So với cellulose thực vật cellulose vi khuẩn có nhiều ưu điểm vượt trội bao gồm độ trùng hợp cao, độ kết tinh cao, module Young vượt trội, độ bền kéo cao, độ tinh khiết cao (không chứa linhin và hemicellulose) và tính tương thích sinh học cao khi không có độc tính lên các tế bào sống. Đặc biệt, BC thân thiện với môi trường khi được sinh tổng hợp cũng như dễ dàng phân hủy sinh học nhanh trong đất, dễ dàng bị thủy phân nhờ sự hoạt động của các vi sinh vật và enzyme phân hủy cellulose. Tính chất độc đáo nhất của cellulose vi khuẩn so với các nguồn cellulose khác là tính siêu xốp.
Các vi sợi cellulose có cấu trúc nano trong BC đan chéo ngẫu nhiên vào nhau tạo thành một cấu trúc khung tinh vi. Điều này biến BC trở thành vật liệu có tính siêu xốp, kết hợp với tính ưa nước vốn có của sợi cellulose khiến BC có khả năng giữ nước cao, đồng nghĩa với độ thấu khí cao ở dạng khô. BC có khả năng giữ một khối lượng nước gấp cả trăm lần khối lượng của chính nó. Điều này làm tăng cường tính tương thích sinh học của BC, khiến BC trở thành giá thế thích hợp để nuôi cấy nấm và các mô tế bào.
Ngoài ra, BC cũng có tổng diện tích bề mặt lớn, nên khung ba chiều BC là dạng đế rất thích hợp cho vật liệu nano. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng các tính chất của BC như độ kết tinh, tính chất cơ học và tính chất điện học thay đổi khi thay đổi chủng vi khuẩn, môi trường nuôi cấy, nguồn carbon và các điều kiện khác trong quá trình sinh tổng hợp [80]. xylinus được nuôi trong môi trường có sự xuất hiện của ethanol khiến BC giảm độ bền cơ học nhưng lại thể hiện tính chất điện môi vượt trội [45]. BC sau khi được đông khô thể hiện tính chất như một aerogel khi có tính xốp, siêu nhẹ và chứa chủ yếu là không khí, vẫn giữ được các 6 Luận văn thạc sĩ Đào Quang Khải đặc tính quý ở dạng ướt.
Nhờ các đặc tính trên mà BC được ưa chuộng hơn cellulose thực vật trong một số ứng dụng đặc thù.1 tổng hợp và so sánh các thông số vật lý của BC và cellulose thực vật Bảng 1.1: So sánh tính chất của BC và cellulose thực vật Cellulose Nguồn tham Tính chất (đơn vị) BC thực vật khảo Độ bền kéo (MPa) 20-300 25-200 [29, 34] Màng: 20.000 Khả năng giữ nước (%) >95 25-35 [12, 74, 94] Kích thước vi sợi (nm) 20-100 Cỡ micro mét [32, 89] Độ kết tinh (%) 74-96 40-85 [71] Tính ưa nước tương đối (%) 40-50 20-30 [10] Độ tinh khiết (%) >99 <80 [48] Độ trùng hợp 14. Các phương pháp sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn Các phương pháp tổng hợp BC bao gồm tổng hợp trong môi trường tĩnh, trong môi trường lắc, và trong bình phản ứng sinh học. Ứng với mỗi phương pháp trên BC thu được có thể có các hình thái, cấu trúc vi mô và các tính chất khác nhau. Các điều kiện môi trường bao gồm chủng vi sinh vật, chất dinh dưỡng, pH, và hàm lượng bổ 7 Luận văn thạc sĩ Đào Quang Khải sung oxi cũng có ảnh hưởng đến tính chất của BC.
Vai trò của các chủng vi sinh vật trong các điều kiện dinh dưỡng khác nhau đã được nghiên cứu [73, 111]. Trong tất cả các chủng vi khuẩn tạo BC, A. xylinum có khả năng tổng hợp BC với hiệu suất cao nhất. Chủng vi khuẩn hiếu khí này có thể biến đổi glucose và một số chất hữu cơ khác thành cellulose trong vài ngày nuôi cấy.
Một số nghiên cứu đã quan sát thấy trong một giờ một vi khuẩn có thể chuyển đổi đến 108 phân tử glucose thành cellulose. Ngoài ra, vòng đời của vi khuẩn cũng ảnh hưởng đến năng suất tổng hợp BC. Thông thường trong môi trường nuôi cấy tĩnh, sự phát triển của vi khuẩn được chia thành bốn pha riêng biệt bao gồm pha tiềm phát, pha tăng sinh, pha cân bằng, pha suy thoái. Hiệu suất tổng hợp BC cao nhất ở pha tăng sinh và pha cân bằng.
BC có thể được sinh tổng hợp trong các môi trường khác nhau, tuy nhiên quá trình hình thành BC tương đối giống nhau. Cùng với sự phát triển của quần thể vi khuẩn, hình thái của BC chuyển từ các sợi nhỏ thành tấm màng bằng cách đan xen vào nhau tạo thành một mạng lưới các sợi rất tinh vi. Nguồn dinh dưỡng cơ bản và thiết yếu cho các vi sinh vật tổng hợp BC thường là glucose và acid acetic. Tuy nhiên trong điều kiện nuôi cấy ban đầu lượng glucose thường vượt trội so với acid acetic, nên vi sinh vật trong giai đoạn này thường chuyển đổi glucose thành acid gluconic qua đó làm giảm độ pH.
Độ pH thích hợp để hình thành BC thường có giá trị 4 < pH < 7 [50, 96]. Phương pháp tổng hợp BC từ nuôi cấy tĩnh Phương pháp nuôi cấy tĩnh là cách tiếp cận truyền thống để tổng hợp BC và được sử dụng rộng rãi. Trong phương pháp này, dinh dưỡng và vi sinh vật để trong một bình chứa tại nhiệt độ thích hợp 28-30 ˚C. BC được tổng hợp trong điều kiện môi trường tĩnh sẽ có dạng màng hydrogel.
Màng BC thu được từ quá trình nuôi cấy tĩnh được thể hiện qua hình 1. Sau khi thu hoạch BC sẽ có màu vàng do bên trong BC vẫn còn chứa dung dịch môi trường (Hình 1. Sau khi được làm sạch bằng NaOH và được xử lý qua nước để đạt pH trung tính, BC sẽ có màu trắng như hình 1. Trong môi trường nuôi cấy tĩnh, BC sẽ được hình thành trên giao diện khí-lỏng, 8 Luận văn thạc sĩ Đào Quang Khải nên sẽ giam giữ carbon dioxide được tạo ra từ quá trình trao đổi chất của vi sinh vật.
Cũng vì thế nên năng suất sản sinh BC sẽ phụ thuộc trực tiếp vào tiết diện tiếp xúc giữa môi trường lỏng và không khí. Độ dày của màng BC phụ thuộc vào thời gian nuôi cấy được ghi lại ở đồ thị hình 1. Vì các phân tử cellulose được vi sinh vật sinh ra từ các lỗ nhỏ trên màng tế bào, sau đó được kết tinh lại thành các vi sợi, nên màng BC sau khi hình thành đóng vai trò như một giá thể cho vi sinh vật.2f ta có thể thấy vi khuẩn bị giữ lại trong màng BC.2e thể hiện rõ cấu trúc khung ba chiều tinh vi của BC với độ xốp cao. Phương pháp nuôi cấy tĩnh là phương pháp nuôi cấy đơn giản là chi phí thấp, nên được sử dụng rộng rãi để tổng hợp BC trong phòng thí nghiệm.2: Sự phát triển của vi sinh vật là sự hình thành BC trong phương pháp nuôi cấy tĩnh.