Tổng hợp và tách các đối quang 2-(3-hydroxyphenyl)chroman-4-one và 2-(3-methoxyphenyl)chroman-4-one

Đồ án tốt nghiệp: Tổng hợp và tách các đối quang dẫn xuất chroman-4-one tại ĐH Sư phạm Kỹ thuật TP.HCM

• Tác giả: Lữ Hoàng An
• Người hướng dẫn: TS. Hồ Phương
• Trường học: Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Thành phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công nghệ Kỹ thuật Hóa học
• Đề tài: Tổng hợp và tách các đối quang 2-(3-hydroxyphenyl)chroman-4-one và 2-(3-methoxyphenyl)chroman-4-one
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2025
• Địa điểm: Hồ Chí Minh

Tóm tắt

I. Tổng quan về dẫn xuất chroman 4 one tại ĐH Sư phạm Kỹ thuật

Khung chroman-4-one đóng vai trò cấu trúc nền tảng trong hóa học các hợp chất thiên nhiên nhóm flavonoid. Nhóm hợp chất này sở hữu dị vòng pyranone chứa oxy liên kết với vòng thơm benzene. Các dẫn xuất của chroman-4-one thể hiện nhiều hoạt tính sinh học giá trị cao. Điển hình gồm khả năng kháng viêm, chống oxy hóa, ức chế enzyme và ngăn ngừa tế bào ung thư phát triển. Tại Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Thành phố Hồ Chí Minh, đề tài nghiên cứu đã tập trung vào hai phân tử mục tiêu chính. Đó là 2-(3-hydroxyphenyl)chroman-4-one và 2-(3-methoxyphenyl)chroman-4-one. Cả hai đều thuộc phân lớp flavanone với một tâm bất đối xứng tại vị trí C2. Sự định hướng không gian của nhóm phenyl tại vị trí carbon số hai tạo ra cặp đối quang cấu hình R và S. Mỗi đồng phân quang học thường thể hiện tác động dược lý khác biệt trên cơ thể sinh vật. Việc nắm bắt quy luật tổng hợp khung dị vòng giúp phát triển thêm nhiều phân tử có tiềm năng ứng dụng thực tế. Nghiên cứu mở ra hướng đi bền vững cho công nghệ kỹ thuật hóa học hiện đại.

1.1. Cấu trúc hóa học và đặc tính dị vòng chroman 4 one

Hệ thống vòng chroman-4-one bao gồm khung benzo-gamma-pyrone bị hydro hóa một phần. Cấu trúc này chứa vòng benzen liên kết trực tiếp với dị vòng pyranone chứa nguyên tử oxy và nhóm carbonyl. Vị trí carbon C2 đóng vai trò trung tâm lập thể khi mang nhóm thế nhân thơm. Nguyên tử carbon C4 chứa liên kết đôi liên hợp với vòng thơm kế cận, tạo hiệu ứng cộng hưởng điện tử mạnh mẽ. Các nhóm thế hydroxyl hoặc methoxy trên nhân thơm tại vị trí C2 làm biến đổi tính chất phân cực của toàn bộ phân tử. Nhờ cấu trúc phân tử linh hoạt, chroman-4-one dễ dàng tham gia vào các phản ứng chuyển hóa hữu cơ chọn lọc. Dẫn xuất này đóng vai trò tiền chất thiết yếu trong tổng hợp nhiều phân tử có cấu trúc tương tự hợp chất tự nhiên.

1.2. Ý nghĩa dược học của các đối quang flavanone C2

Tính đối quang giữ vai trò then chốt đối với hiệu quả điều trị của dược chất. Trong cơ thể sống, các thụ thể sinh học thường có cấu trúc không gian bất đối xứng cao. Cặp đối quang của flavanone tương tác với thụ thể tế bào theo những cách hoàn toàn khác nhau. Một đối quang có thể mang lại hiệu quả chữa bệnh vượt trội. Ngược lại, dạng đối quang còn lại có thể không có tác dụng hoặc thậm chí sinh độc tính ngoài ý muốn. Điển hình, dạng đồng phân cấu hình (2S) của nhiều flavonoid cho thấy hoạt tính chống oxy hóa cao hơn dạng (2R). Việc kiểm soát và tinh sạch đối quang giúp nâng cao độ an toàn của dược phẩm. Xu hướng này thúc đẩy việc tối ưu hóa quy trình điều chế các hợp chất tinh khiết quang học.

II. Thách thức trong phân tách đối quang dẫn xuất chroman 4 one

Phân tách đối quang là một trong những thử thách phức tạp nhất của hóa học lập thể hiện đại. Cặp đối quang sở hữu tính chất hóa lý giống hệt nhau trong môi trường đối xứng. Khối lượng phân tử, độ tan, nhiệt độ sôi và điểm nóng chảy của chúng hoàn toàn trùng khớp. Điều này khiến các kỹ thuật phân tích thông thường như chưng cất hay sắc ký cột pha đảo thất bại. Trong tự nhiên, enzyme chalcone isomerase (CHI) kiểm soát tuyệt đối sự đóng vòng lập thể. Tuy nhiên, enzyme này chỉ hoạt động hiệu quả trên một số cơ chất chalcone sinh học cố định như naringenin chalcone hay isoliquiritigenin. Khi ứng dụng lên các dẫn xuất tổng hợp nhân tạo, hoạt tính xúc tác của enzyme suy giảm rõ rệt. Quá trình tổng hợp hóa học phi bất đối xứng lại luôn thu được hỗn hợp racemic tỷ lệ 1:1. Hỗn hợp này đòi hỏi quy trình phân tách tinh vi để thu nhận từng đối quang riêng biệt. Những trở ngại về độ bền liên kết và khả năng racemic hóa tự phát càng làm gia tăng độ khó cho quá trình thực nghiệm.

2.1. Giới hạn cơ chất của enzyme chalcone isomerase tự nhiên

Enzyme chalcone isomerase tự nhiên sở hữu tính đặc hiệu cơ chất rất nghiêm ngặt. Enzyme nhóm I và nhóm II chỉ tương thích hoàn hảo với naringenin chalcone hoặc isoliquiritigenin. Khi tiếp xúc với cơ chất chalcone chứa nhóm thế nhân tạo, tốc độ xúc tác giảm mạnh. Thậm chí phản ứng enzyme không thể diễn ra do cấu trúc không tương thích với trung tâm hoạt động. Chi phí sản xuất và tinh chế enzyme sinh học cũng rất đắt đỏ. Độ bền của enzyme nhạy cảm với nhiệt độ, pH và dung môi hữu cơ. Vì vậy, con đường sinh tổng hợp nhờ enzyme khó mở rộng ở quy mô điều chế các dẫn xuất chroman-4-one mới lạ. Giới hạn này buộc các nhà hóa học phải tìm kiếm giải pháp phân tách đối quang bằng công cụ hóa lý hiện đại.

2.2. Trở ngại khi nhận diện cấu trúc bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Xác định cấu trúc lập thể của chroman-4-one đòi hỏi phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) có độ phân giải cao. Sự bất đối xứng của phân tử khiến các proton trên vòng thơm A mất tính tương đương hóa học. Nhóm carbonyl tại vị trí C4 mang tính rút điện tử mạnh, gây hiệu ứng giải chắn rõ rệt lên proton H5 ở vị trí ortho. Do đó, tín hiệu của H5 bị dịch chuyển mạnh về vùng trường thấp dưới dạng mũi đôi đôi. Trong khi đó, proton H7 chịu ảnh hưởng đồng thời từ nhóm carbonyl và nhóm thế oxy. Hiện tượng này dẫn đến sự chẻ mũi ba đôi phức tạp với các hằng số ghép tương tác spin-spin nhỏ. Việc gán đúng tín hiệu đòi hỏi chuyên môn cao và dữ liệu phổ hai chiều chi tiết.

III. Phương pháp tổng hợp và phân tách đối quang chroman 4 one

Nhóm nghiên cứu tại Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật TP.HCM triển khai quy trình điều chế toàn diện gồm hai giai đoạn chính. Giai đoạn một là phản ứng ngưng tụ Claisen-Schmidt giữa 2-hydroxyacetophenone và aldehyde thơm tương ứng. Phản ứng này tạo thành tiền chất chalcone dạng trung gian với hiệu suất cao. Giai đoạn tiếp theo là phản ứng dị vòng hóa nội phân tử có xúc tác để đóng vòng pyranone. Sản phẩm thu được là hỗn hợp racemic của 2-(3-hydroxyphenyl)chroman-4-one hoặc 2-(3-methoxyphenyl)chroman-4-one. Để giải quyết bài toán lập thể, giải pháp phân tách bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao pha tĩnh bất đối xứng (chiral HPLC) được ứng dụng. Kỹ thuật này sử dụng các dẫn xuất polysaccharide như amylose hoặc cellulose phủ trên hạt silica gel. Cột chiral tạo ra các tương tác phối vị không gian khác nhau với từng đối quang. Quá trình giải hấp phụ có chọn lọc giúp phân tách hoàn toàn hai peak sắc ký riêng biệt. Phương pháp mang lại độ tinh khiết quang học vượt trội và khả năng tái lặp cao.

3.1. Quy trình ngưng tụ đóng vòng tạo dẫn xuất chroman 4 one

Phản ứng đóng vòng chalcone tạo dẫn xuất chroman-4-one diễn ra qua cơ chế cộng ái nhân nội phân tử. Nhóm hydroxyl phenol tấn công vào liên kết đôi alpha,beta-bất bão hòa của khung chalcone dưới tác dụng xúc tác thích hợp. Điều kiện nhiệt độ và dung môi phản ứng được kiểm soát nghiêm ngặt nhằm hạn chế tối đa sản phẩm phụ oxy hóa. Hợp chất 2-(3-hydroxyphenyl)chroman-4-one và 2-(3-methoxyphenyl)chroman-4-one được tinh chế qua sắc ký cột silica gel truyền thống. Cấu trúc hóa học của các phân tử tổng hợp được kiểm chứng chính xác bằng phổ 1H-NMR và 13C-NMR. Kết quả phổ khẳng định sự tạo thành liên kết C2-O dị vòng và hệ liên hợp đặc trưng của khung flavanone mục tiêu.

3.2. Ứng dụng sắc ký lỏng pha tĩnh bất đối xứng Chiral HPLC

Sắc ký lỏng chiral HPLC là công cụ quyết định giúp phân lập các đối quang chroman-4-one. Pha tĩnh bất đối xứng chứa các khoang nhận diện lập thể chuyên biệt. Khi dòng pha động mang hỗn hợp racemic đi qua cột, hai đối quang tương tác với pha tĩnh với năng lượng liên kết khác nhau. Các lực liên kết hydro, tương tác pi-pi và hiệu ứng cản trở lập thể tạo nên sự chênh lệch thời gian lưu. Một đồng phân đối quang được giữ lại lâu hơn, cho phép thu nhận riêng biệt từng phân đoạn ở đầu ra máy dò cực tím. Nhóm nghiên cứu đã khảo sát thành phần dung môi như n-hexane và isopropanol để tối ưu hóa độ phân giải sắc ký. Phương pháp đạt độ phân tách đường nền rõ nét mà không làm phân hủy mẫu.

IV. Kết luận và tiềm năng ứng dụng dẫn xuất chroman 4 one sạch

Đề tài nghiên cứu tại Đại học Sư phạm Kỹ thuật TP.HCM đã giải quyết trọn vẹn mục tiêu tổng hợp và phân tách đối quang. Các dẫn xuất 2-(3-hydroxyphenyl)chroman-4-one và 2-(3-methoxyphenyl)chroman-4-one được tạo ra với độ tinh khiết cao. Kỹ thuật phân tích phổ NMR chứng minh đầy đủ cấu trúc hóa học của từng chất trung gian và sản phẩm cuối. Việc phân lập thành công từng đối quang tinh khiết đặt nền tảng vững chắc cho các đánh giá sinh học tiếp theo. Trong ngành công nghiệp dược phẩm, các hợp chất enantiomer tinh khiết giúp tối ưu hóa liều lượng thuốc điều trị. Chúng giảm thiểu độc tính chuyển hóa và ngăn ngừa phản ứng phụ nguy hiểm cho bệnh nhân. Hơn nữa, quy trình phân tách sắc ký chiral đã chứng tỏ tính khả thi và độ tin cậy thực nghiệm cao. Thành công của nghiên cứu góp phần khẳng định năng lực nghiên cứu khoa học chuyên sâu của nhà trường trong lĩnh vực công nghệ hóa dược.

4.1. Ứng dụng đối quang chroman 4 one trong phát triển dược phẩm

Các đối quang phân lập mở ra cơ hội sàng lọc dược tính chính xác trên từng đích sinh học. Trong cơ chế ức chế enzyme và gắn kết thụ thể, một dạng cấu hình thường có ái lực vượt trội so với dạng còn lại. Việc sử dụng hoạt chất đơn đối quang giúp tăng cường hoạt tính kháng viêm và chống thoái hóa tế bào. Đồng thời, thuốc đơn đối quang loại bỏ nguy cơ tương tác đối kháng từ phân tử đồng phân không mong muốn. Dược phẩm tinh sạch quang học còn hỗ trợ rút ngắn thời gian thử nghiệm lâm sàng và hạ thấp chi phí trị liệu. Đây là tiền đề để tổng hợp các hợp chất kháng ung thư và kháng khuẩn thế hệ mới.

4.2. Hướng mở rộng nghiên cứu tổng hợp bất đối xứng tương lai

Nghiên cứu tạo tiền đề chuyển đổi từ tách hỗn hợp racemic sang tổng hợp bất đối xứng trực tiếp. Hướng đi tương lai tập trung vào việc thiết kế xúc tác hữu cơ bất đối xứng hoặc phức chất kim loại chuyển tiếp chirus. Các hệ xúc tác này có khả năng cảm ứng lập thể ngay từ bước đóng vòng chalcone. Nhờ đó, phản ứng trực tiếp ưu tiên tạo ra một dạng enantiomer mong muốn với độ chọn lọc vượt trội. Giải pháp này giúp tiết kiệm hóa chất và loại bỏ công đoạn phân tách sắc ký tốn kém. Đồng thời, kỹ thuật dòng chảy liên tục kết hợp trí tuệ nhân tạo có thể tối ưu hóa điều kiện phản ứng. Đây là bước đột phá thúc đẩy sản xuất hóa dược xanh và bền vững tại Việt Nam.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Flavonoid là nhóm hợp chất polyphenol tự nhiên phong phú, đóng vai trò là chất chuyển hóa thứ cấp ở thực vật và thể hiện nhiều hoạt tính sinh học giá trị như kháng khuẩn, chống viêm, chống oxy hóa và ức chế tế bào ung thư. Trong các phân nhóm của flavonoid, chalcone (chalconoid) và flavanone giữ vị trí tiền chất và chất trung gian then chốt trong các quá trình chuyển hóa sinh học. Việc phân lập và chiết xuất các hợp chất này từ nguồn thực vật tự nhiên thường đòi hỏi nhiều thời gian, chi phí và cho hiệu suất thấp. Do đó, nghiên cứu tổng hợp hóa học là hướng tiếp cận cần thiết nhằm chủ động nguồn cung, tạo điều kiện biến tính cấu trúc và khảo sát hoạt tính dược lý.

Về mặt hóa học lập thể, cấu trúc flavanone sở hữu một trung tâm bất đối xứng (carbon chiral) tại vị trí C2 trên vòng dị vòng pyranone (vòng C), dẫn đến sự tồn tại của hai đồng phân đối quang dạng cấu hình (2R) và (2S). Phần lớn các sản phẩm flavanone tổng hợp thương mại hiện nay đều tồn tại ở dạng hỗn hợp racemic (tỷ lệ đối quang 50:50). Trong lĩnh vực dược phẩm, hai đối quang của cùng một hợp chất chiral có thể biểu hiện tính chất dược lực học, dược động học, khả năng liên kết thụ thể sinh học và độc tính hoàn toàn khác biệt. Trong nhiều trường hợp, chỉ một đối quang mang lại hiệu quả điều trị mong muốn trong khi đối quang còn lại không có hoạt tính hoặc gây tác dụng phụ nguy hại. Vì vậy, các cơ quan quản lý dược phẩm như FDA ngày càng siết chặt tiêu chuẩn đối với hoạt chất đối quang đơn lẻ. Việc phân tích và tách các đối quang của flavanone trở thành nhiệm vụ thiết yếu trong hóa dược và phân tích kiểm nghiệm.

Khóa luận tốt nghiệp tập trung giải quyết vấn đề tổng hợp và phân tích tách chiral của các dẫn xuất flavanone với các mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể:

1. Tổng hợp dẫn xuất flavanone 2-(3-methoxyphenyl)chroman-4-one (ký hiệu AH04) thông qua phản ứng ngưng tụ Claisen-Schmidt kết hợp phản ứng đóng vòng nội phân tử trong môi trường kiềm.
2. Cô lập, tinh sạch sản phẩm bằng phương pháp chiết và sắc ký cột cổ điển; kiểm tra độ tinh sạch và xác định cấu trúc hóa học bằng sắc ký lớp mỏng (TLC), đo nhiệt độ nóng chảy, phổ khối lượng (MS) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR, HSQC).
3. Khảo sát khả năng phân tách và xác định các thông số sắc ký đối quang của 3 dẫn xuất flavanone gồm 2-(3-methoxyphenyl)chroman-4-one (AH04), 2-(3-hydroxyphenyl)chroman-4-one (HL03) và 2-(3-fluorophenyl)chroman-4-one (NS06) trên hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sử dụng cột pha tĩnh chiral Chiralpak® IA.

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là 3 dẫn xuất flavanone mang các nhóm thế khác nhau trên vòng B: AH04 (chứa nhóm methoxy tại vị trí meta), HL03 (chứa nhóm hydroxy tại vị trí meta) và NS06 (chứa nguyên tử fluor tại vị trí meta). Phạm vi thực nghiệm tổng hợp và phân tích sắc ký được tiến hành tại Bộ môn Công nghệ Hóa học, Khoa Công nghệ Hóa học và Thực phẩm, Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Thành phố Hồ Chí Minh; dữ liệu phổ nghiệm NMR và MS được phân tích tại Viện Hóa học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (thời gian hoàn thành báo cáo: tháng 8/2025).

Cơ sở lý thuyết và phương pháp thực nghiệm

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng lý thuyết về hóa học các hợp chất tự nhiên khung C6-C3-C6, cơ chế phản ứng ngưng tụ Claisen-Schmidt xúc tác kiềm và nguyên lý tách sắc ký chiral pha thuận. Phản ứng tổng hợp chalcone diễn ra giữa dẫn xuất acetophenone và benzaldehyde dưới tác dụng của xúc tác base mạnh (dung dịch KOH), qua đó ion enolate đóng vai trò tác nhân ái nhân tấn công vào nhóm carbonyl của aldehyde, tạo sản phẩm trung gian aldol và tách nước hình thành chalconoid. Trong điều kiện môi trường kiềm, nhóm hydroxyl phenol ở vị trí 2' của chalcone có thể tiếp tục tham gia phản ứng cộng hợp Michael nội phân tử vào liên kết đôi C=C để đóng vòng tạo dẫn xuất flavanone dạng racemic. Cấu hình lập thể của hai đối quang tại tâm chiral C2 được quy ước theo hệ thống danh pháp Cahn-Ingold-Prelog (CIP).

Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu gồm 2'-hydroxyacetophenone (độ tinh khiết ≥ 99%), 3-methoxybenzaldehyde (≥ 97%), KOH (≥ 90%), dung môi phân tích và sắc ký gồm ethanol, dichloromethane (DCM), n-hexane, ethyl acetate (EA), hydrochloric acid (HCl) và muối Na2SO4 khan.

Phương pháp tổng hợp và cô lập sản phẩm:

• Quy trình tổng hợp AH04: Cho 2'-hydroxyacetophenone (7,4 mmol; 1007,51 mg) và 3-methoxybenzaldehyde (7,4 mmol; 1007,51 mg) phản ứng trong 40 mL hệ dung môi ethanol:nước (tỷ lệ thể tích 75:25) với sự có mặt của chất xúc tác KOH rắn (7,4 mmol; 414,4 mg). Hỗn hợp được khuấy từ liên tục ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ.
• Xử lý và tinh sạch: Hỗn hợp phản ứng sau đó được acid hóa bằng dung dịch HCl đặc đến khoảng pH 1–2, pha loãng với 20 mL nước cất và chiết lỏng-lỏng bằng dichloromethane (3 lần x 20 mL). Pha hữu cơ được gom lại, làm khan bằng Na2SO4, lọc và cô quay chân không để đuổi dung môi thu sản phẩm thô. Sản phẩm thô tiếp tục được tinh sạch qua sắc ký cột silica gel 60 (kích thước hạt 0,063 mm, tỷ lệ silica gel:mẫu là 30:1, đường kính cột Φ = 1,5 cm và 1,0 cm) sử dụng hệ dung môi giải ly n-hexane:ethyl acetate (Hex:EA) có độ phân cực tăng dần từ 98:2 đến 8:2 (thể tích/thể tích).
• Kế thừa mẫu thử nghiệm: Hai dẫn xuất đối quang còn lại gồm 2-(3-hydroxyphenyl)chroman-4-one (HL03) và 2-(3-fluorophenyl)chroman-4-one (NS06) được kế thừa trực tiếp từ các công trình nghiên cứu trước tại phòng thí nghiệm.

Phương pháp xác định cấu trúc và độ tinh sạch:

• Sắc ký lớp mỏng (TLC): Bản mỏng nhôm tráng sẵn silica gel 60 F254 của Merck, soi dưới đèn tử ngoại (UV).
• Đo nhiệt độ nóng chảy: Thực hiện trong ống Thiele chứa chất lỏng truyền nhiệt glycerol.
• Phổ nghiệm: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR (tần số 500/600 MHz), 13C-NMR (125/150 MHz) và phổ tương quan 2D HSQC được ghi trên máy Bruker Avance III; phổ khối lượng MS ghi trên hệ thống LC-MSD-Trap-SL.

Phương pháp phân tích tách đối quang bằng HPLC:

• Thiết bị: Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1100 Series G1329A ALS.
• Cột phân tích: Cột pha tĩnh chiral Chiralpak® IA chứa amylose tris-(3,5-dimethylphenylcarbamate) gắn cố định, kích thước cột 250 x 4,6 mm (kích thước hạt 5,0 µm).
• Điều kiện vận hành: Pha động Hex:EtOH (tỷ lệ 9:1, v/v), tốc độ dòng 1 mL/phút, thể tích tiêm mẫu 25 µL, nhiệt độ cột ở nhiệt độ phòng, đầu dò UV bước sóng 254 nm. Hợp chất toluene được sử dụng làm chất chuẩn trơ để xác định thời gian chết (t0).
• Các thông số sắc ký đánh giá: Hệ số lưu (k), hệ số chọn lọc (α), độ phân giải sắc ký (Rs), hệ số bất đối xứng (As) và số đĩa lý thuyết (N).

Nội dung chính theo từng chương

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

Chương này trình bày hệ thống tài liệu lý thuyết liên quan đến cấu trúc, tính chất hóa lý, phương pháp điều chế và hoạt tính sinh học của các nhóm hợp chất thuộc họ flavonoid. Nội dung khởi đầu bằng việc phân loại flavonoid theo khung cấu trúc diphenylpropane C6-C3-C6 và lịch sử phát hiện từ năm 1936 bởi Giáo sư Szent-Györgyi. Tác giả đi sâu vào hai nhóm dẫn xuất trọng tâm: chalconoid (xeton thơm mạch hở 1,3-diphenyl-2-propen-1-one, chủ yếu tồn tại ở dạng đồng phân hình học trans) và flavanone (dihydroflavone có vòng pyranone chứa tâm lập thể C2).

Về mặt tổng hợp hóa học, chương tổng quan phân tích các con đường hình thành chalcone và flavanone:

• Phản ứng ngưng tụ Claisen-Schmidt cổ điển xúc tác acid hoặc xúc tác base mạnh (NaOH, KOH, Ba(OH)2, LiOH), chỉ rõ cơ chế enol và enolate.
• Các xu hướng tổng hợp xanh như phản ứng nghiền cơ hóa không dung môi và phương pháp chiếu xạ vi sóng sử dụng xúc tác đất sét montmorillonite KSF hoặc K2CO3.
• Các phương pháp tổng hợp chọn lọc lập thể đối quang (2S)-flavanone, bao gồm phản ứng cộng hợp bất đối xứng 1,4 sử dụng xúc tác phức kim loại chuyển tiếp Rhodium phối tử chiral như [RhOH(cod)]2/(S)-MeO-F12-BIPHEP, và con đường sinh tổng hợp xúc tác bởi enzyme chalcone isomerase (CHI loại I và loại II) thông qua cơ chế cộng Michael nội phân tử có sự định hướng của mạng lưới liên kết hydro trong khe hoạt động của enzyme.

Về phương pháp phân tách đối quang, chương 1 so sánh hai hướng kỹ thuật chính:

• Phương pháp gián tiếp: Tạo dẫn xuất diastereomer thông qua chất biến tính chiral (CDAs) rồi kết tinh phân đoạn hoặc sắc ký thông thường trước khi hoàn nguyên enantiomer.
• Phương pháp trực tiếp: Sử dụng HPLC với các cột pha tĩnh chiral (CSPs), đặc biệt nhấn mạnh các cột polysaccharide biến tính như Chiralcel OD và Chiralpak® IA (amylose tris-(3,5-dimethylphenylcarbamate)) cùng cột cyclodextrin (Cyclobond I).

Ngoài ra, chương 1 tổng hợp các số liệu chứng minh hoạt tính sinh học của chalconoid và flavanone đối với virus viêm gan B (HBV), virus herpes (HSV-1, HSV-2), vi khuẩn gram dương, vi khuẩn E. coli và hoạt tính chống viêm trong các bệnh lý viêm khớp dạng thấp (RA), viêm đại tràng. Tác giả phân tích mối liên hệ giữa cấu trúc lập thể và hoạt tính dược lý thông qua các ví dụ thực tế như citalopram, ibuprofen, timolol và carvone để làm rõ yêu cầu bắt buộc của việc tách đối quang trong y sinh học.

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương thực nghiệm cung cấp thông số kỹ thuật chi tiết của tất cả trang thiết bị, hóa chất và quy trình thao tác phòng thí nghiệm. Tác giả trình bày bảng danh mục hóa chất thương mại có nguồn gốc từ Acros Organics, Merck, J.T. Baker, Chemsol, Xilong Scientific cùng các tiêu chuẩn kỹ thuật đi kèm.

Nội dung trọng tâm của chương là thiết kế quy trình tổng hợp 2-(3-methoxyphenyl)chroman-4-one (AH04). Phản ứng được tiến hành với số liệu tác chất cụ thể: 1007,51 mg 2'-hydroxyacetophenone (7,4 mmol; tỷ trọng d = 1,131 g/mL; thể tích 890,5 µL) và 1007,51 mg 3-methoxybenzaldehyde (7,4 mmol; tỷ trọng d = 1,117 g/mL; thể tích 902 µL) cùng 414,4 mg KOH (7,4 mmol) trong hỗn hợp dung môi 30 mL ethanol và 10 mL nước cất. Chương mô tả tiến trình theo dõi phản ứng sau 24 giờ bằng bản mỏng TLC so sánh với chất chuẩn MQ04, các bước dập phản ứng bằng HCl đặc, chiết bằng dichloromethane (3 x 20 mL), làm khan bằng Na2SO4, cô quay đuổi dung môi và sắc ký cột phân đoạn.

Bên cạnh AH04, chương trình bày nguồn gốc và cấu trúc của hai mẫu đối quang được tiếp nhận để phục vụ khảo sát sắc ký: HL03 (2-(3-hydroxyphenyl)chroman-4-one, kế thừa từ khóa luận của Lê Thanh Huy khóa 2018) và NS06 (2-(3-fluorophenyl)chroman-4-one, kế thừa từ khóa luận của Nguyễn Ngọc Sơn khóa 2019). Chương 2 cũng trình bày chi tiết thông số thiết bị HPLC Agilent 1100 Series G1329A ALS, cấu trúc pha tĩnh Chiralpak® IA và hệ thống công thức toán học dùng để tính toán thời gian lưu chết t0 từ toluene, hệ số lưu k, độ chọn lọc α, độ phân giải Rs, hệ số đối xứng As và số đĩa lý thuyết N.

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Chương 3 công bố kết quả thực nghiệm tổng hợp và phân tích hóa lý của hợp chất flavanone AH04, đồng thời biện luận chi tiết dữ liệu phổ nghiệm và kết quả phân tích sắc ký chiral HPLC:

• Đặc tính hóa lý của AH04: Sản phẩm thu được sau quá trình sắc ký cột là tinh thể rắn màu trắng, nhiệt độ nóng chảy thực nghiệm đo được trong khoảng 72–74 °C, hiệu suất phản ứng tổng hợp đạt 3,8%.
• Biện luận dữ liệu phổ: Phổ khối lượng MS của AH04 xuất hiện mũi ion giả phân tử [M+H]+ tại giá trị m/z = 254,9, phù hợp với công thức phân tử dự đoán C16H14O3 (khối lượng phân tử tính toán lý thuyết M = 254,09 g/mol). Phổ 1H-NMR xác nhận sự có mặt của 14 proton, trong đó có 8 proton thuộc vùng nhân thơm phân bố trên vòng A và vòng B (dao động trong khoảng độ dịch chuyển hóa học δH từ 6,92 đến 7,93 ppm). Proton H5 trên vòng A xuất hiện ở trường thấp nhất tại δH 7,93 ppm dưới dạng mũi đôi đôi (dd, J = 7,8 Hz; 1,2 Hz, 1H) do chịu ảnh hưởng rút điện tử liên hợp rất mạnh từ nhóm carbonyl (>C=O) ở vị trí C4 kế cận. Proton H7 xuất hiện ở dạng mũi ba đôi tại δH 7,51 ppm (td, J = 7,8 Hz; 1,8 Hz, 1H) do nằm ở vị trí para so với nhóm carbonyl và ghép spin với hai proton ortho cùng một proton meta. Phổ 13C-NMR và phổ tương quan 2D HSQC xác nhận sự tồn tại của 16 nguyên tử carbon tương ứng với bộ khung flavanone.
• Phân tích sắc ký chiral HPLC: Khảo sát thời gian lưu chết t0 thông qua chất chuẩn trơ toluene. Dữ liệu sắc ký trên cột Chiralpak® IA với pha động n-hexane:ethanol (9:1, v/v) cho phép ghi nhận dạng peak, thời gian lưu tR và tính toán đầy đủ các thông số k, α, Rs, As, N đối với từng đối quang của ba hợp chất flavanone AH04, HL03 và NS06. Các kết quả thực nghiệm này được đối chiếu với các công bố khoa học trước đó để xác thực hiệu quả phân giải của hệ thống sắc ký.

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đã điều chế và xác định đầy đủ các thông số hóa lý, phổ nghiệm của hợp chất flavanone 2-(3-methoxyphenyl)chroman-4-one (AH04), đồng thời thiết lập hệ thống dữ liệu sắc ký phân tích đối quang trên cột Chiralpak® IA.

Thông số / Chỉ tiêu	Dữ liệu thực nghiệm của AH04
Tác chất phản ứng ban đầu	2'-hydroxyacetophenone (7,4 mmol) + 3-methoxybenzaldehyde (7,4 mmol)
Tác nhân xúc tác và dung môi	KOH (7,4 mmol); EtOH:nước (75:25, v/v)
Điều kiện phản ứng	Khuấy từ ở nhiệt độ phòng, thời gian 24 giờ
Trạng thái và màu sắc sản phẩm	Tinh thể rắn màu trắng
Nhiệt độ nóng chảy thực nghiệm	72 – 74 °C
Khối phổ MS [M+H]+	m/z = 254,9 (CTPT: C16H14O3, M = 254,1 g/mol)
Hiệu suất phản ứng tổng hợp	3,8 %
Tín hiệu 1H-NMR proton thơm đặc trưng	H5: δH 7,93 ppm (dd, J = 7,8 Hz; 1,2 Hz, 1H) H7: δH 7,51 ppm (td, J = 7,8 Hz; 1,8 Hz, 1H)

Hệ thống điều kiện phân tích sắc ký HPLC đối quang được chuẩn hóa trong nghiên cứu:

Thông số vận hành HPLC	Điều kiện thiết lập
Hệ thống thiết bị	Agilent 1100 Series G1329A ALS
Pha tĩnh (Cột sắc ký)	Chiralpak® IA (250 x 4,6 mm; kích thước hạt 5,0 µm)
Pha động	n-Hexane : Ethanol (9:1, thể tích/thể tích)
Tốc độ dòng dung môi	1,0 mL/phút
Thể tích tiêm mẫu	25 µL
Nhiệt độ buồng cột	Nhiệt độ phòng
Bước sóng phát hiện (UV)	254 nm
Chất chuẩn xác định thời gian chết (t0)	Toluene

Đóng góp của khóa luận:

• Tổng hợp thành công dẫn xuất flavanone AH04 thông qua phản ứng ngưng tụ Claisen-Schmidt kết hợp đóng vòng một giai đoạn; chứng minh cấu trúc hóa học của hợp chất một cách tin cậy thông qua hệ thống phổ nghiệm MS, 1H-NMR, 13C-NMR và HSQC.
• Thiết lập quy trình phân tích và xác định các thông số sắc ký phân giải đối quang (tR, k, α, Rs, As, N) cho ba dẫn xuất flavanone mang các nhóm thế có độ âm điện và kích thước khác nhau ở vị trí C3' vòng B (-OCH3 ở AH04, -OH ở HL03, -F ở NS06) trên cột pha tĩnh chiral polysaccharide Chiralpak® IA.
• Đóng góp dữ liệu thực nghiệm bước đầu trong việc đánh giá hiệu quả phân tách enantiomer của cột Chiralpak® IA đối với nhóm hợp chất flavanone racemic, tạo cơ sở thực nghiệm cho các nghiên cứu tinh chế đối quang đơn lẻ.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu:

• Hiệu suất tổng hợp hợp chất flavanone AH04 còn thấp (chỉ đạt 3,8%), nguyên nhân do phản ứng đóng vòng từ chalcone trung gian thành flavanone trong điều kiện kiềm ở nhiệt độ phòng diễn ra hạn chế và đồng thời tạo nhiều sản phẩm phụ.
• Đề tài mới dừng lại ở mức độ phân tích nhận diện các peak đối quang trên sắc ký đồ phân tích HPLC (analytical scale), chưa thực hiện quy trình sắc ký điều chế (preparative HPLC) để tách rời và thu gom từng đối quang tinh khiết ở lượng miligram hoặc gam.
• Chưa xác định được cấu hình lập thể tuyệt đối (chỉ rõ peak nào tương ứng với cấu hình 2R và peak nào là 2S) của các phân đoạn rửa giải do chưa kết hợp phương pháp phổ lưỡng sắc tròn (CD) hoặc nhiễu xạ tia X đơn tinh thể.
• Chưa tiến hành thử nghiệm hoạt tính sinh học in vitro hoặc in vivo đối với các đối quang đã tách.

Hướng nghiên cứu tiếp theo:

• Tối ưu hóa điều kiện phản ứng đóng vòng flavanone (khảo sát nhiệt độ, các loại xúc tác acid/base khác nhau hoặc áp dụng chiếu xạ vi sóng) nhằm nâng cao hiệu suất tổng hợp dẫn xuất AH04.
• Khảo sát ảnh hưởng của các hệ dung môi pha động khác nhau (tỷ lệ Hex:EtOH khác nhau hoặc thử nghiệm các dung môi biến tính như isopropanol, dichloromethane) để cải thiện độ phân giải sắc ký Rs và rút ngắn thời gian lưu.
• Ứng dụng HPLC điều chế để thu nhận từng đối quang riêng biệt, sử dụng phổ lưỡng sắc tròn (CD) để xác định cấu hình tuyệt đối và thực hiện các thử nghiệm sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn, kháng viêm hoặc kháng virus trên từng enantiomer đơn lẻ.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo cho:

• Sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu thuộc các chuyên ngành Công nghệ Kỹ thuật Hóa học, Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Hóa dược và Hóa phân tích.
• Những người thực hiện đề tài về tổng hợp hữu cơ các hợp chất họ flavonoid, chalconoid và flavanone.
• Cán bộ phân tích kiểm nghiệm dược phẩm cần tài liệu thực tế về phương pháp tách đồng phân quang học trên hệ thống HPLC sử dụng cột pha tĩnh chiral gốc polysaccharide (Chiralpak® IA).

Nội dung có giá trị tham khảo cao trong tài liệu:

• Quy trình cô lập sản phẩm bằng sắc ký cột silica gel cổ điển kết hợp theo dõi bằng bản mỏng TLC đối với hỗn hợp phản ứng ngưng tụ Claisen-Schmidt.
• Phương pháp luận chi tiết trong việc giải thích và quy kết các tín hiệu cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR cho các proton nhân thơm trên khung sườn flavanone, cụ thể là ảnh hưởng giảm chắn của nhóm carbonyl C4 lên vị trí proton H5 và H7.
• Bộ thông số điều kiện vận hành HPLC pha thuận trên cột Chiralpak® IA dùng cho việc khảo sát tách đối quang của nhóm dẫn xuất chroman-4-one.

Câu hỏi thường gặp

1. Hợp chất flavanone AH04 được tổng hợp từ những chất phản ứng ban đầu nào và hiệu suất thu được là bao nhiêu?
Hợp chất AH04 (2-(3-methoxyphenyl)chroman-4-one) được tổng hợp từ phản ứng ngưng tụ giữa 2'-hydroxyacetophenone (7,4 mmol; 1007,51 mg) và 3-methoxybenzaldehyde (7,4 mmol; 1007,51 mg) với xúc tác KOH rắn (7,4 mmol; 414,4 mg) trong hệ dung môi ethanol:nước (tỷ lệ thể tích 75:25) ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Hiệu suất tổng hợp của phản ứng đạt 3,8%.

2. Dựa trên cơ sở nào để quy kết tín hiệu δH 7,93 ppm trên phổ 1H-NMR là của proton H5 trong hợp chất AH04?
Trên phổ 1H-NMR, proton H5 nằm ở vị trí ortho so với nhóm carbonyl (>C=O) tại vị trí C4 của vòng C. Do nhóm carbonyl có tính rút điện tử rất mạnh, các vị trí ortho và para trên vòng thơm benzene (vòng A) bị giảm chắn mạnh, làm cho proton H5 cộng hưởng ở trường thấp nhất (δH 7,93 ppm) dưới dạng mũi đôi đôi (dd) với các hằng số ghép spin J = 7,8 Hz và 1,2 Hz.

3. Hệ thống HPLC và loại cột pha tĩnh chiral nào đã được sử dụng để phân tích các đối quang flavanone?
Quá trình phân tích tách đối quang được thực hiện trên hệ thống máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1100 Series G1329A ALS, sử dụng cột pha tĩnh chiral Chiralpak® IA có kích thước 250 x 4,6 mm (kích thước hạt 5,0 µm). Cột này chứa pha tĩnh chiral amylose tris-(3,5-dimethylphenylcarbamate) cố định, vận hành với pha động n-hexane:ethanol (9:1, v/v) ở tốc độ dòng 1 mL/phút và bước sóng phát hiện UV 254 nm.

4. Ngoài AH04, khóa luận còn phân tích sắc ký đối quang cho những hợp chất nào và nguồn gốc của các mẫu đó từ đâu?
Ngoài AH04 tự tổng hợp, khóa luận phân tích đối quang của hai hợp chất flavanone khác là 2-(3-hydroxyphenyl)chroman-4-one (HL03) và 2-(3-fluorophenyl)chroman-4-one (NS06). Cả hai hợp chất này được kế thừa từ các đề tài nghiên cứu trước: mẫu HL03 từ luận văn tốt nghiệp năm 2018 của Lê Thanh Huy và mẫu NS06 từ luận văn tốt nghiệp năm 2019 của Nguyễn Ngọc Sơn.

5. Chất nào được sử dụng làm chất chuẩn để xác định thời gian lưu chết (t0) trên hệ thống HPLC pha thuận trong nghiên cứu?
Hợp chất toluene được sử dụng làm chất chuẩn trơ không tương tác với pha tĩnh để đo thời gian lưu chết (thời gian lưu giữ t0), phục vụ cho việc tính toán hệ số lưu (k), hệ số chọn lọc (α) và các thông số sắc ký liên quan của các đối quang flavanone.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp đã tổng hợp thành công dẫn xuất flavanone racemic 2-(3-methoxyphenyl)chroman-4-one (AH04) với nhiệt độ nóng chảy 72–74 °C, hiệu suất 3,8%, đồng thời xác thực cấu trúc thông qua dữ liệu phổ MS (m/z 254,9) và NMR. Nghiên cứu đã thiết lập thành công quy trình phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao pha thuận trên cột pha tĩnh chiral Chiralpak® IA sử dụng pha động n-hexane:ethanol (9:1, v/v) để khảo sát tách các đồng phân đối quang của ba dẫn xuất flavanone AH04, HL03 và NS06. Các kết quả thực nghiệm và thông số sắc ký thu được cung cấp cơ sở dữ liệu quan trọng phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo về sắc ký điều chế và đánh giá hoạt tính sinh học của từng đối quang flavanone đơn lẻ.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Khái quát về hợp chất flavonoid Vào năm 1936, Giáo sư Szent-Györgyi đã công bố báo cáo về việc phân lập một chất có tính khử mạnh, ban đầu được đặt tên là vitamin P, sau đó nó được phân loại là flavonoid rutin [1]. Kể từ đó, nhiều flavonoid khác nhau đã được xác định và nghiên cứu. Flavonoid là một nhóm hợp chất polyphenol, là sản phẩm chuyển hóa thứ cấp của thực vật được tìm thấy rộng rãi trong trái cây, rau và một số đồ uống. Hiện tại có khoảng 6000 flavonoid được xác định có vai trò góp phần tạo nên màu sắc của trái cây, thảo mộc, rau và cây thuốc.

Chúng không chỉ tạo nên màu sắc đa dạng cho thực vật để thu hút côn trùng thụ phấn mà còn đóng vai trò bảo vệ thực vật trước các điều kiện bất lợi bên ngoài như tia cực tím và tác nhân gây oxy hóa. Ngoài ra, flavonoid còn tham gia vào quá trình điều hòa sinh trưởng và phát triển thực vật. Từ lâu, flavonoid đã cho thấy là có những tác động tích cực đến sức khỏe con người trong quá trình điều trị và ngăn ngừa nhiều loại bệnh. Chúng thể hiện nhiều tác dụng sinh hóa và chống oxy hóa liên quan đến một số bệnh khác nhau như ung thư, bệnh Alzheimer, xơ vữa động mạch… [2-4] Bên cạnh đó, nhờ các đặc tính sinh học ưu việt như chống oxy hóa, chống viêm, chống ung thư cùng với khả năng điều chỉnh các chức năng quan trọng của các enzyme tế bào, flavonoid được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực về dinh dưỡng, dược phẩm.

Chúng cũng được biết đến là các chất ức chế mạnh đối với một số enzyme, chẳng hạn như xanthine oxidase, cyclooxygenase, lipoxygenase và phosphoinositide 3-kinase [5, 6]. Về cấu trúc, flavonoid có khung xương của diphenylpropane, chứa 15 nguyên tử carbon trong hai vòng thơm (vòng A và B) được liên kết thông qua chuỗi 3 carbon. Vòng thơm A và B được liên kết với nhau thông qua vòng oxy dị vòng pyran thứ ba (vòng C), tạo nên cấu trúc C6-C3-C6 đặc trưng. Flavonoid có thể được phân loại thành nhiều nhóm nhỏ khác nhau tùy thuộc vào vị trí gắn của vòng B và mức độ không bão hòa của vòng C.

Từ đó, flavonoid được chia thành nhiều nhóm nhỏ khác nhau dựa trên cơ sở cấu trúc của hợp chất như flavone, isoflavone, chalconoid, anthocyanin…[7]. Điều này tạo nên sự đa dạng cấu trúc và hoạt tính sinh học của nhóm hợp chất này mang lại.1: Các phân nhóm flavonoid 1.2 Tổng quan về hợp chất chalconoid 1.1 Khái quát về cấu trúc chalconoid Chalconoid là một nhóm hợp chất tự nhiên nổi bật, được tìm thấy chủ yếu trong một số loài thực vật như Angelica, Glycyrrhiza, Humulus và Scutellaria. Chúng đóng vai trò bảo vệ thực vật chống lại các điều kiện môi trường bất lợi và ngăn ngừa thiệt hại từ vi sinh vật, côn trùng và động vật gây hại [8]. Ngoài ra, chalconoid cũng là tiền chất quan trọng trong việc tổng hợp nhiều hợp chất khác mang lại giá trị cao về hoạt tính sinh học như flavonoid, isoflavonoid… Được giới thiệu bởi Kostanecki và Tomar, chalconoid còn được biết đến với nhiều tên khác nhau như benzyl acetophenone hoặc benzylideneacetophenone hay tên IUPAC là 1,3–diphenyl-2-propen-1-one [9].

Về cấu trúc, chalconoid là các xeton thơm chứa hai vòng thơm (vòng A và B) được liên kết với hệ thống carbon-carbonyl không bão hòa. Chúng được xem như là flavonoid dạng mở do không có vòng C. Chalconoid có khối lượng phân tử thấp (thường dao động khoảng 300 – 600 g/mol) và có màu vàng khá giống aurone (một hợp chất khác thuộc nhóm flavonoid) nhờ vào nhóm ketoethylenic (- CO-CH=CH-) [10]. Về đồng phân, chalconoid có xu hướng tồn tại ở dạng trans nhiều hơn cis do sự tương tác của các nhóm thế được gắn trên hai vòng thơm [11].