BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO TP.HCM TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO BÁO CÁO NGHIỆM THU TÊN TÀI: NGHIÊN CỨU T NG H P D N UẤT AR -CHITOO IGOSACCHARIDE VÀ ÁNH GIÁ HO T T NH HÁNG VI SINH V T GÂ BỆNH CÂ TR NG TRONG I U IỆN IN VITRO CHỦ NHIỆM TÀI Ê S NGỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 12/2015 i TÓM TẮT Chitooligosacchride (COS) và các dẫn xuất của nó là những chất có khả năng kháng vi sinh vật, kháng nấm bệnh, kháng viêm, kháng ung thư, kích thích miễn dịch, ức chế enzyme và chống oxi hóa. Mỗi loại dẫn xuất của COS có khả năng kháng vi sinh vật khác nhau. Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành tổng hợp 02 loại dẫn xuất của COS và đánh giá khả năng kháng trên các chủng vi khuẩn (Ralstonia sp., Erwinia carotovora) và chủng nấm (Fusarium oxysporum, Sclerotium sp. Các thí nghiệm được tiến hành ở Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Nông nghiệp Công nghệ cao.
Kết quả đã tổng hợp được 02 loại dẫn xuất gồm: dẫn xuất N-Vanilyl-COS (VCOS) ở điều kiện thích hợp là pH 5,5 nhiệt độ 30oC và nồng độ Vanilyl là 2% được tổng hợp trong 2 gi và dẫn xuất N-Ben zyl COS (BCOS) ở điều kiện là pH 5,5 nhiệt độ 30oC và nồng độ Benzyl là 2% được tổng hợp trong 2 gi. Đã xác định được cấu trúc đặc trưng của các dẫn xuất thông qua các phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng từ proton (1H-NMR). Hai dẫn xuất VCOS và BCOS đều có khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh tốt hơn COS. Nồng độ ức chế tối thiểu của VCOS và BCOS đối với vi khuẩn Erwinia carotovora là 20 ppm, vi khuẩn Ralstonia sp là 30 ppm.
ii ABSTRACT Chitooligosaccharide (COS) and its derivatives are substances that are resistant to microbial, anti-fungal, anti-inflammatory, anti-cancer, immune stimulation, enzyme inhibition and antioxidant. Each of COS’s derivative resistant various microorganisms. In this study, we prepared 02 categories of derivatives COS and evaluated resistance in bacteria (Ralstonia sp., Erwinia carotovora) and fungi strains (Fusarium oxysporum, Sclerotium sp. The experiments were performed at Research and Development Center for High-Tech Agriculture.
Results were synthesized 02 kinds of derivatives include: derivatives N-Vanilyl-COS (VCOs) in appropriate conditions are pH 5,5, 30°C and 2% Vanilyl concentration that was synthesized in 12 hours and N-benzyl COS (bcos) derivative at pH 5,5, 30°C and the concentration of Benzyl was 2% that was synthesized in 12 hours. The structure of derivatives was identified through infrared spectroscopy (IR), proton magnetic resonance spectrum (1H-NMR). VCOS and BCOS derivatives are resistant pathogenic microorganisms better COS. The minimum inhibitory concentration of VCOS and BCOS against Erwinia carotovora is 20 ppm, Ralstonia sp.
iii MỤC ỤC Trang TÓM TẮT. iii MỤC LỤC. iv DANH S CH C C CHỮ VIẾT TẮT .vii DANH SÁCH BẢNG. viii DANH SÁCH HÌNH.
x THÔNG TIN ĐỀ TÀI. 2 Chương : TỔNG QUAN TÀI LIỆU. Tổng quan về chitosan, chitooligosaccharide. Vài nét lịch sử nghiên cứu chitosan.
Cấu tạo chitosan. Độ deacetyl hóa của chitosan. Giới thiệu về chitooligosaccharide. Các phương pháp thu nhận chitooligosaccharide từ chitosan.
Một số dẫn xuất của chitosan và chitooligosaccharide. Dẫn xuất N-alkyl chitosan. Dẫn xuất mang điện tích dương cao. Dẫn xuất acyl chitosan.
Dẫn xuất chitosan-sulfate. Dẫn xuất carboxyl chitooligosaccharide. 15 Chương 2: N I DUNG NGHI N CỨU. Th i gian và địa điểm nghiên cứu.
Vật liệu nghiên cứu. Đối tượng nghiên cứu. Hóa chất thí nghiệm. Thiết bị thí nghiệm.
Nội dung nghiên cứu. Nội dung 1: Nghiên cứu điều kiện tổng hợp dẫn xuất aryl- COS. Thí nghiệm : Khảo sát ảnh hưởng của pH lên sự tổng hợp dẫn xuất aryl-COS28 2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự tổng hợp dẫn xuất aryl- COS.
Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất phản ứng lên sự tổng hợp dẫn xuất aryl-COS. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của th i gian phản ứng lên sự tổng hợp dẫn xuất aryl-COS. Nội dung 2: Xác định các đặc trưng cấu trúc của sản phẩm tổng hợp được. Nội dung 3: Khảo sát khả năng kháng vi sinh vật của COS và dẫn xuất aryl- COS 32 2.
Thí nghiệm : Đánh giá khả năng kháng khuẩn của các COS và aryl-COS. Tính nồng độ ức chế tối thiểu (MIC).Thí nghiệm 2: Đánh giá ảnh hưởng của các COS và aryl-COS lên sự phát triển sợi nấm. Thí nghiệm 3: Đánh giá ảnh hưởng của COS và aryl-COS lên sự phát triển sinh khối nấm trong canh trư ng. Phương pháp nghiên cứu.
34 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. 36 Chương 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ. 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 57 vi DANH SÁCH CÁC CH VI T TẮT VI T TẮT THU T NG cs Cộng sự COS Chitooligosacchride FTIR Fourrier Transformation InfraRed HTCC N-(2-hydroxyl) propyl-3-trimethylammonium chitosan chloride pI điểm đẳng điện DD Deacetylation EDC 1-ethyl-3-dimethylaminopropyl carbodiimide NHS N-hydroxysuccinimide MIC nồng độ ức chế tối thiểu GPC Gel permeation chromatography IR phổ hồng ngoại 1 H-NMR phổ cộng hưởng từ proton VCOS N-Vanilyl-COS BCOS Benzyl chitooligosaccharide H proton vii DANH SÁCH BẢNG S T ả s u Trang Hiệu quả kiểm soát bệnh trên cây trồng của oligochitosan (khảo sát tại 1.1 7 Trung Quốc) (Ying và cs, 2010) Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của pH lên sự tổng hợp dẫn xuất aryl- 2.1 25 COS Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự tổng hợp dẫn xuất 2.2 26 aryl-COS Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất phản ứng lên sự tổng 2.3 27 hợp dẫn xuất aryl-COS Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của th i gian phản ứng lên sự tổng hợp 2.4 28 dẫn xuất aryl-COS 3.1 Hiệu suất thu nhận dẫn xuất VCOS được tổng hợp ở pH khác nhau 32 3.2 Độ thay thế của dẫn xuất VCOS được tổng hợp ở pH khác nhau 33 3.3 Hiệu suất thu nhận dẫn xuất VCOS được tổng hợp ở nhiệt độ khác nhau 34 3.4 Độ thay thế của dẫn xuất VCOS được tổng hợp ở các nhiệt độ khác nhau 34 Hiệu suất thu nhận dẫn xuất VCOS được tổng hợp ở những tỉ lệ 3.5 35 COS:aldehyde khác nhau Độ thay thế của dẫn xuất VCOS được tổng hợp ở các tỉ lệ COS:aldehyde 3.6 35 khác nhau Hiệu suất thu nhận dẫn xuất VCOS được tổng hợp ở các th i gian khác 3.8 Độ thay thế của dẫn xuất VCOS được tổng hợp ở các th i gian khác nhau 36 3.9 Hiệu suất thu nhận dẫn xuất BCOS được tổng hợp ở pH khác nhau 38 viii 3.10 Độ thay thế của dẫn xuất BCOS được tổng hợp ở các pH khác nhau 38 3.11 Hiệu suất thu nhận dẫn xuất BCOS được tổng hợp ở nhiệt độ khác nhau 39 3.12 Độ thay thế của dẫn xuất BCOS được tổng hợp ở các nhiệt độ khác nhau 39 Hiệu suất thu nhận dẫn xuất BCOS được tổng hợp ở những tỉ lệ 3.13 40 COS:aldehyde khác nhau Độ thay thế của dẫn xuất BCOS được tổng hợp ở các tỉ lệ COS:aldehyde 3.14 40 khác nhau Hiệu suất thu nhận dẫn xuất BCOS được tổng hợp với th i gian khác 3.16 Độ thay thế của dẫn xuất BCOS được tổng hợp với th i gian khác nhau 41 Nồng độ ức chế tối thiểu của các COS và aryl-COS lên các chủng vi 3.17 48 khuẩn Erwinia carotovora, Ralstonia sp 3.18 Hiệu suất kháng nấm của COS ở các nồng độ khác nhau 49 3.19 Hiệu suất kháng nấm của N-Benzyl COS ở các nồng độ khác nhau 50 3.20 Hiệu suất kháng nấm của N-Vanilyl-COS ở các nồng độ khác nhau 50 3.21 Ảnh hưởng của COS và aryl-COS lên sự phát triển sinh khối nấm 51 ix DANH SÁCH HÌNH S T ả Trang 1.1 Công thức cấu tạo Chitin và chitosan 5 1.2 Phản ứng tổng hợp dẫn xuất N-aryl chitosan (Mrunal R.3 Phản ứng tổng hợp dẫn xuất amino-chitosan (V.
Mourya và cs, 2008) 11 Phản ứng tổng hợp dẫn xuất N-acyl chitosan và O-acyl chitosan (V.5 Phản ứng tổng hợp dẫn xuất O-acyl chitosan (Marguerite Rinaudo, 2006) 13 1.6 Phản ứng tổng hợp dẫn xuất chitosan-sulfate (Inmaculada Aranaz, 2010) 15 Phản ứng tổng hợp dẫn xuất carboxyl chitooligosaccharide (Niranjan 1.1 Nguyên liệu COS 24 3.1 Dẫn xuất VCOS 37 3.2 Dẫn xuất BCOS 42 3.3 Phổ hồng ngoại (IR) của COS (a), N-vanillyl-COS(b) 43 1 Phổ cộng hưởng từ proton ( H-NMR) của COS (a), vanillin (b) và N- 3.5 Phổ IR của BCOS 46 1 3.6 Phổ H-NMR của BCOS trong CD3COOD 47 x THÔNG TIN TÀI. Tên đề tài dự án: “Nghiên cứu tổng hợp dẫn xuất aryl-chitooligosaccharide và đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật gây bệnh cây trồng trong điều kiện in vitro”. Chủ nhiệm đề tài dự án: Lê S Ng c 3. Cơ quan chủ trì: Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Nông nghiệp CNC 4.
Th i gian thực hiện: 20 5 – 12/2015 5. Kinh phí được duyệt: 147. Mục tiêu: Xác định được điều kiện tối ưu để tổng hợp dẫn xuất aryl-COS nhằm nâng cao hoạt tính kháng vi sinh vật của COS ban đầu. Sản phẩm của đề tài dự án: Hai dẫn xuất aryl-COS 1 MỞ ẦU Chitosan là hợp chất deacetyl hóa của chitin, một polymer tự nhiên được tạo thành từ các đơn phân N-acetyl glucosamine, hiện diện trong vỏ của các loài giáp xác, côn trùng và trong vách của tế bào nấm.
Chitooligosaccharide (COS) là sản phẩm thủy phân của chitosan bởi các tác nhân vật lý, sinh h c và hóa h c. COS và các dẫn xuất của nó có nhiều đặc tính sinh h c và có khả năng ứng dụng rộng rãi trong nhiều l nh vực khác nhau như là chất kháng vi sinh vật, kháng viêm, kháng ung thư, kích thích miễn dịch, ức chế enzyme và kháng oxi hóa (Ngo và cs, 2008; 2009). Hiện nay, tại Việt Nam và thế giới các nhà khoa h c quan tâm đến các chất có nguồn gốc từ tự nhiên có hoạt tính sinh h c và COS đang là một trong những chất được chú ý vì nó tan trong nước nên dễ dàng ứng dụng vào hệ thống sống. Việt nam là một quốc gia nhiệt đới với b biển dài nên có nguồn tài nguyên sinh vật biển rất phong phú và là nguồn nguyên liệu quý giá đã và đang được con ngư i chú ý lâu nay.
Trong đó, chitin (poly N-acetylglucosamin) được tách chiết từ vỏ tôm, cua, mai mực, vỏ côn trùng, vách tế bào sợi nấm và chitosan (polyglucosamine), sản phẩm deacetyl của chitin làm tăng nhóm amino tự do. Đây là các sản phẩm tự nhiên, không độc, an toàn với môi trư ng và được sử dụng rộng rãi trong y h c, thực phẩm và nông lâm ngư nghiệp.