ĐẶT VẤN ĐỀ Trong mục tiêu chung của Quyết định 316 – QĐ/TTg về việc Phê duyệt Đề án Tăng cường năng lực hệ thống quản lý chất lượng xét nghiệm y học giai đoạn 2016 – 2025 [8] có nêu rõ: Nâng cao chất lượng xét nghiệm y học để đảm bảo kết quả xét nghiệm chính xác, kịp thời, chuẩn hóa, làm cơ sở cho việc liên thông, công nhận kết quả xét nghiệm giữa các cơ sở khám bệnh, chữa bệnh, cơ sở y tế có thực hiện xét nghiệm (sau đây gọi chung là các phòng xét nghiệm), nhằm giảm phiền hà, chi phí cho người bệnh, tiết kiệm nguồn lực của xã hội, đồng thời hội nhập mạng lưới kiểm chuẩn chất lượng xét nghiệm trong khu vực và trên thế giới. Với mục tiêu cụ thể hơn là nâng cao năng lực hệ thống kiểm chuẩn chất lượng xét nghiệm của các phòng xét nghiệm và đặt mục tiêu đến năm 2020, phải hình thành và phát triển mạng lưới phòng xét nghiệm tham chiếu có đủ năng lực thực hiện hoạt động tham chiếu cho 90% các xét nghiệm thông thường. Nghiên cứu sẽ góp phần mang lại một quy trình đo lường tham chiếu được tối ưu hóa cho việc định lượng HbA1c. Việc ứng dụng quy trình này trong chương trình ngoại kiểm HbA1c sẽ giúp xác định giá trị ấn định của chương trình một cách chính xác hơn, đồng thời với khả năng truy nguyên nguồn gốc kết quả xét nghiệm sẽ đem lại sự tin cậy từ các phòng xét nghiệm tham gia ngoại kiểm tại Trung tâm.
Bên cạnh đó, việc phân tích trên quy trình đo lường tham chiếu đạt tiêu chuẩn quốc tế tại Việt Nam sẽ giúp cho các phòng xét nghiệm kiểm soát chất lượng, tăng mức độ tin cậy của các xét nghiệm tại các cơ sở thực hiện xét nghiệm này. Nghiên cứu xây dựng quy trình xét nghiệm tham chiếu đạt chuẩn quốc tế ISO 15193:2009 [21] cũng là một trong những yêu cầu tiên quyết trong việc xây dựng mạng lưới phòng xét nghiệm tham chiếu mà Trung tâm Kiểm chuẩn chất lượng Xét nghiệm Y học. – Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh hướng đến và cũng là đơn vị đầu tiên triển khai thực hiện mô hình này. Bước đầu xây dựng phòng xét nghiệm tham chiếu, chúng tôi lựa chọn xét nghiệm HbA1c để tiến hành nghiên cứu.
Với lý do: Phương pháp định lượng HbA1c trong mẫu máu toàn phần đã được JCTLM công nhận năm 2013 là phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò khối phổ ion hóa tia điện (HPLC/ESI-MS) là một phương pháp khá mới mẻ và được khuyến khích ứng dụng trên những thiết bị phân tích HbA1c. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Tối ưu hóa phương pháp sắc ký lỏng trong đo lường HbA1c bằng kỹ thuật HPLC- ESI-MS” tại Trung tâm Kiểm chuẩn chất lượng xét nghiệm y học – trực thuộc Bộ Y tế - Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh năm 2020. CÂU HỎI NGHIÊN CỨU Để đảm bảo kết quả xét nghiệm HbA1c phải tin cậy và nhanh chóng, việc tối ưu hóa phương pháp sắc ký lỏng trong đo lường HbA1c được thực hiện như thế nào? MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Khảo sát điều kiện tối ưu hóa phương pháp sắc ký lỏng trong đo lường HbA1c bằng kỹ thuật HPLC-ESI-MS.1 Xét nghiệm HbA1c 1.1 Nguyên lý xét nghiệm HbA1c Trong hồng cầu có chứa hemoglobin có khả năng vận chuyển oxy đến mọi nơi trong cơ thể. Trong bệnh ĐTĐ, glucose tích tụ lại trong máu và kết hợp với hemoglobin tạo thành dạng phức hợp glucose-hemoglobin.
Vì hồng cầu có tuổi thọ tầm 3 tháng. Xét nghiệm đo lượng phức hợp này cho biết giá trị đường huyết trung bình trong 3 tháng trước đó. Nếu giá trị đường huyết trong vòng vài tuần qua tăng cao lên. Thì giá trị glucose trong hồng cầu cũng tăng cao.2 Nguồn gốc, sự hình thành của xét nghiệm HbA1c Hemoglobin và quá trình tạo thành HbA1c: Hemoglobin (Hb) là một protein màu (chromoprotein), gồm một phân tử globin gắn với bốn nhân hem.
Sự tổng hợp Hb bắt đầu từ giai đoạn tiền nguyên hồng cầu đến giai đoạn hồng cầu lưới ở trong tủy xương. Quá trình tạo thành Hb gồm có tổng hợp hem và tổng hợp globin. - Hem: Là một sắc tố có màu, chung cho tất cả các loài, gồm một vòng porphylin, trung tâm chứa ion Fe2+ (quyết định màu đỏ của hồng cầu). - Globin: Là một protein đặc trưng cho từng loài, cấu tạo gồm bốn chuỗi polypeptit (α, β, δ, γ) giống nhau từng đôi một, mỗi chuỗi gắn với một hem.
Bình thường ở người trưởng thành có các loại Hb sau: - HbA1: gồm 2 chuỗi α và 2 chuỗi β (α2β2), chiếm tỷ lệ 94 - 98%. - HbA2: gồm 2 chuỗi α và 2 chuỗi δ (α2δ2), chiếm tỷ lệ 2 – 3,5%. - HbF: gồm 2 chuỗi α và 2 chuỗi γ (α2γ2), chiếm tỷ lệ 0 - 1% (còn gọi là huyết sắc tố bào thai vì chiếm tỷ lệ rất cao ở giai đoạn cuối của thai nhi và thời kỳ sơ sinh). Ngoài ra khi có đột biến các gen cấu trúc hay gen điều hòa sẽ tạo ra các Hb bất thường như: HbS, HbE, HbC, HbJ, bệnh thalassemia.
Sự kết hợp giữa glucose với một acid amin ở phần cuối của chuỗi β trong phân tử Hb tạo ra sản phẩm trung gian là Aldimin, sau đó Aldimin sẽ chuyển hóa thành HbA1. Tùy thuộc vào loại đường và vị trí gắn vào HbA, có 4 loại HbA1: HbA1a1, HbA1a2, HbA1b, HbA1c. Trong máu, đường đơn chủ yếu là glucose nên thành phần chủ yếu của HbA1 là HbA1c. Phản ứng này chỉ xảy ra theo một chiều và không cần chất xúc tác.
HbA1c tồn tại cùng với thời gian tồn tại của hồng cầu ở trong máu (khoảng 120 ngày). Vai trò của HbA1c: Năm 1970, lần đầu tiên người ta ghi nhận hemoglobin glycat hóa (HbA1c) như một Hb “bất thường” trên bệnh nhân ĐTĐ. Sau khi được phát hiện, đã có rất nhiều nghiên cứu chứng minh có sự liên quan giữa nồng độ HbA1c và glucose máu. Tiềm năng sử dụng HbA1c trong việc chăm sóc bệnh nhân ĐTĐ lần đầu được đề cập đến vào năm 1985 trong một báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới.
Năm 2005, Tổ chức Y tế Thế giới cùng Liên đoàn Đái tháo đường Thế giới đã xem xét và cập nhật lại các tiêu chí chẩn đoán ĐTĐ. Sau khi cân nhắc các dữ kiện thông tin và bằng chứng sẵn có vào thời điểm hiện tại, Ủy ban các chuyên gia thống nhất chưa nên chấp nhận sử dụng HbA1c như một tiêu chí chẩn đoán ĐTĐ do tính chuẩn xác trong kỹ thuật xét nghiệm còn chưa được chuẩn hóa [6]. Vào tháng 3 năm 2009, Tổ chức Y tế Thế giới tham khảo ý kiến của Ủy ban các chuyên gia đã đưa HbA1c là một trong các tiêu chí chẩn đoán ĐTĐ. Chẩn đoán ĐTĐ khi HbA1c ≥ 6,5%, xét nghiệm phải được thực hiện ở cơ sở xét nghiệm đã được NGSP (National glycohemoglobin standardization program) cấp giấy chứng nhận và chuẩn hóa trong theo kỹ thuật dùng trong nghiên cứu DCCT (Diabetes control and complications trial).
[35] HbA1c tồn tại cùng với sự tồn tại của hồng cầu trong máu (120 ngày) do đó nồng độ HbA1c phản ánh mức dao động đường máu trung bình trong vòng 8 -. 12 tuần trước. Xét nghiệm này có thể được thực hiện vào bất kỳ thời điểm nào trong ngày mà bệnh nhân không cần nhịn đói. Các nghiên cứu gần đây đều nhấn mạnh vai trò của HbA1c trong việc theo dõi kiểm soát bệnh nhân ĐTĐ và việc đưa HbA1c về càng gần trị số bình thường càng làm giảm có ý nghĩa các biến chứng của bệnh.
Theo UKPDS, một nghiên cứu đa trung tâm theo dõi dài hạn các biến chứng của bệnh ĐTĐ, khẳng định kiểm soát đường máu tích cực làm cải thiện các biến chứng của bệnh. Giảm 1% HbA1c có thể làm giảm 43% các bệnh mạch máu ngoại vi và cắt cụt chi dưới, 37% các bệnh mạch máu nhỏ, 19% đục thủy tinh thể, 16% biến chứng suy tim, 14% biến chứng nhồi máu cơ tim và 12% nguy cơ đột quỵ.2 Các phương pháp xét nghiệm HbA1c hiện nay 1.1 Phương pháp phân tách Hemoglobin được glycate hóa (A1c, gắn glucose) và hemoglobin không glycate (A0, không gắn glucose) có các đặc điểm khác nhau, điều này cho phép phân tách 2 loại và định lượng riêng A1c cũng như tổng A1c + A0. Các kỹ thuật áp dụng phương pháp này, bao gồm: sắc ký trao đổi ion (IEC, ion exchange chromatography), điện di mao quản (CE, cappillary electrophoresis), sắc ký ái lực (AC, affinity chromatography). - Sắc ký trao đổi ion (Ion exchange chromatography) [46] và Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High pressure liquyd chromatography) Do glucose gắn vào vị trí β-valine, nên điểm đẳng điện của A1c khác với A0 là 0,02 pI, sự khác biệt này cho phép phân tách bằng sắc ký trao đổi ion (IEC).
Tuy nhiên, sự khác biệt đẳng điện giữa A1c và A0 là rất nhỏ, chỉ thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC, high pressure liquyd chromatography) mới có thể thực hiện phân tách chúng [4], [16], [40]. Khi phân tích HbA1c bằng thiết bị HPLC, từng mẫu sẽ được phân tích một, điều này buộc các nhà sản xuất phải cân bằng giữa hiệu suất máy và chất lượng phân tích. Ngoài định lượng A1c và A0, các huyết sắc tố bất thường khác có thể được phát hiện trên biểu đồ sắc ký như: HbF (huyết sắc tố bào thai), HbA1a/b (huyết sắc tố phụ), CarHb (carbamylated Hb), HbS (hồng cầu hình liềm). Đây là một ưu điểm vượt trội của phân tích HbA1c bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), bởi khi có mặt các biến thể hemoglobin, kết quả HbA1c không phản ánh đúng mức đường huyết trung bình.
Năm 2010, ADA đã công bố HbA1c xác định bằng HPLC được coi là tiêu chuẩn cho chẩn đoán đái tháo đường. Do các phòng xét nghiệm phân tích HbA1c theo các phương pháp khác nhau (HPLC, AC, CE, IA, EA), nên kết quả thu được sẽ không giống nhau. Vì vậy, việc chuẩn hóa phương pháp đo HbA1c là cực kỳ quan trọng. Theo đó, HPLC được coi là tiêu chuẩn vàng, là phương pháp tham chiếu của các phương pháp khác, được sử dụng trong các nghiên cứu của UKPDS và DCCT.
- Điện di mao quản (Cappilary electrophoresis) [24] Điện di mao quản là một kỹ thuật phân tách dựa trên sự di chuyển khác nhau của các hemoglobin mang điện tích khác nhau trong cột mao quản, dưới ảnh hưởng của điện trường tạo ra bởi điện áp cao thế 10kV. Glucose trong GHb có ái lực với acid boronic, trong khi NGHb thì không. Do đó NGHb chạy tự do qua cột resin phủ acid boronic, trong khi đó GHb bị cản trở rồi sau đó phân tách khỏi NGHb. Điều này khiến sắc ký đồ của AC không giống như IEC và CE, NGHb xuất hiện trước, sau đó là Hb.