Tối Ưu Hóa Phương Pháp Sắc Ký Lỏng Đo Lường HbA1c Bằng Kỹ Thuật HPLC-ESI-MS

Chuyên khảo kỹ thuật phân tích Tối ưu phương pháp sắc ký lỏng trong đo lường hba1c bằng kỹ thuật hplc esi ms, đánh giá các khía cạnh quan trọng, đề xuất hướng nghiên cứu tiếp theo.

• Tác giả: Nguyễn Thị Bảo Minh
• Người hướng dẫn: PGS. Vũ Quang Huy
• Trường học: Đại học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Kỹ Thuật Xét Nghiệm Y Học
• Đề tài: Tối Ưu Hóa Phương Pháp Sắc Ký Lỏng Đo Lường HbA1c Bằng Kỹ Thuật HPLC-ESI-MS
• Loại tài liệu: Luận Văn Thạc Sĩ Kỹ Thuật Y Học
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Thành Phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. ĐẶT VẤN ĐỀ
• 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3. CHUẨN BỊ MẪU NGHIÊN CỨU VÀ KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC 1: HÌNH ẢNH TRONG QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU

Tóm tắt

I. Tổng Quan HPLC ESI MS HbA1c Phương Pháp Tiên Tiến

Xét nghiệm HbA1c đóng vai trò quan trọng trong chẩn đoán và theo dõi bệnh tiểu đường. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) kết hợp với khối phổ kế phun tĩnh điện (ESI-MS), hay HPLC-ESI-MS, nổi lên như một kỹ thuật mạnh mẽ. Kỹ thuật này cung cấp độ chính xác và độ nhạy cao trong việc định lượng HbA1c. Bài viết này sẽ đi sâu vào các khía cạnh của việc tối ưu hóa phương pháp HPLC-ESI-MS để đo lường HbA1c, từ đó nâng cao chất lượng xét nghiệm và hỗ trợ hiệu quả quá trình điều trị bệnh nhân. Theo Quyết định 316/QĐ-TTg, việc nâng cao chất lượng xét nghiệm y học là yếu tố then chốt để đảm bảo kết quả chính xác và kịp thời.

1.1. Giới Thiệu Về Xét Nghiệm HbA1c và Vai Trò Lâm Sàng

Xét nghiệm HbA1c phản ánh mức đường huyết trung bình trong khoảng 8-12 tuần trước đó. Không giống như xét nghiệm đường huyết đói, xét nghiệm HbA1c không yêu cầu bệnh nhân phải nhịn ăn. Kết quả HbA1c được sử dụng để chẩn đoán bệnh tiểu đường và theo dõi hiệu quả điều trị. Theo UKPDS, giảm 1% HbA1c có thể làm giảm đáng kể các biến chứng của bệnh tiểu đường. Do đó, độ chính xác của xét nghiệm HbA1c là vô cùng quan trọng.

1.2. Ưu Điểm Của Kỹ Thuật HPLC ESI MS Trong Đo Lường HbA1c

HPLC-ESI-MS vượt trội so với các phương pháp truyền thống nhờ khả năng phân tách và định lượng chính xác các thành phần HbA1c. Kỹ thuật này ít bị ảnh hưởng bởi các biến thể hemoglobin và các yếu tố gây nhiễu khác. HPLC-ESI-MS cũng có độ nhạy cao, cho phép phát hiện và định lượng HbA1c ở nồng độ thấp. Điều này đặc biệt quan trọng trong việc chẩn đoán sớm và theo dõi bệnh tiểu đường ở giai đoạn đầu.

II. Thách Thức Đo Lường HbA1c Biến Thể Hemoglobin Ảnh Hưởng

Mặc dù HPLC-ESI-MS là một phương pháp mạnh mẽ, việc đo lường HbA1c vẫn đối mặt với nhiều thách thức. Một trong những thách thức lớn nhất là sự hiện diện của các biến thể hemoglobin. Các biến thể hemoglobin có thể ảnh hưởng đến kết quả HbA1c, dẫn đến sai lệch trong chẩn đoán và điều trị. Do đó, việc tối ưu hóa phương pháp HPLC-ESI-MS để giảm thiểu ảnh hưởng của các biến thể hemoglobin là vô cùng quan trọng. Các phương pháp xét nghiệm HbA1c khác nhau (HPLC, AC, CE, IA, EA) cho kết quả khác nhau, vì vậy chuẩn hóa phương pháp đo là cực kỳ quan trọng.

2.1. Các Yếu Tố Gây Nhiễu Kết Quả Đo Lường HbA1c Cần Lưu Ý

Ngoài các biến thể hemoglobin, nhiều yếu tố khác có thể gây nhiễu kết quả đo lường HbA1c. Các yếu tố này bao gồm tuổi tác, chủng tộc, tình trạng thiếu máu, và các bệnh lý khác. Việc kiểm soát các yếu tố gây nhiễu này là rất quan trọng để đảm bảo độ chính xác của xét nghiệm HbA1c. Cần lưu ý đến ảnh hưởng của HbF (huyết sắc tố bào thai) đến kết quả.

2.2. Ảnh Hưởng Của Biến Thể Hemoglobin Đến Kết Quả HbA1c

Các biến thể hemoglobin có thể ảnh hưởng đến quá trình gắn kết glucose với hemoglobin, dẫn đến kết quả HbA1c không chính xác. Một số biến thể hemoglobin có thể làm tăng HbA1c, trong khi những biến thể khác có thể làm giảm HbA1c. Việc xác định và định lượng các biến thể hemoglobin là cần thiết để hiệu chỉnh kết quả HbA1c và đưa ra chẩn đoán chính xác.

III. Tối Ưu HPLC Cách Cải Thiện Độ Phân Giải và Độ Nhạy

Tối ưu hóa HPLC là một bước quan trọng để cải thiện độ phân giải và độ nhạy của phương pháp HPLC-ESI-MS. Các yếu tố cần được tối ưu hóa bao gồm lựa chọn cột sắc ký, pha động, tốc độ dòng, và nhiệt độ cột. Việc lựa chọn các thông số HPLC phù hợp sẽ giúp phân tách hiệu quả các thành phần HbA1c và giảm thiểu ảnh hưởng của các chất gây nhiễu. Theo nghiên cứu, sự khác biệt đẳng điện giữa A1c và A0 là rất nhỏ, chỉ thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) mới có thể thực hiện phân tách chúng.

3.1. Lựa Chọn Cột Sắc Ký Thích Hợp Cho Phân Tích HbA1c

Việc lựa chọn cột sắc ký phù hợp là yếu tố then chốt để đạt được độ phân giải cao trong phân tích HbA1c. Các loại cột sắc ký khác nhau có khả năng phân tách các thành phần HbA1c khác nhau. Cột pha đảo C18 thường được sử dụng để phân tách các peptide HbA1c dựa trên độ kỵ nước của chúng. Cột trao đổi ion có thể được sử dụng để phân tách các biến thể hemoglobin dựa trên điện tích của chúng.

3.2. Tối Ưu Hóa Pha Động Để Tăng Cường Độ Phân Giải

Pha động đóng vai trò quan trọng trong việc rửa giải và phân tách các thành phần HbA1c. Việc tối ưu hóa thành phần pha động, pH, và nồng độ muối có thể cải thiện đáng kể độ phân giải. Gradient pha động thường được sử dụng để tăng cường khả năng phân tách các peptide HbA1c có độ kỵ nước khác nhau. Acetonitril (ACN) là một dung môi thường được sử dụng trong pha động để cải thiện độ phân giải.

3.3. Điều Chỉnh Tốc Độ Dòng và Nhiệt Độ Cột Sắc Ký

Tốc độ dòng và nhiệt độ cột cũng ảnh hưởng đến độ phân giải và độ nhạy của phương pháp HPLC. Tốc độ dòng quá cao có thể làm giảm độ phân giải, trong khi tốc độ dòng quá thấp có thể kéo dài thời gian phân tích. Nhiệt độ cột cao có thể cải thiện độ phân giải nhưng cũng có thể làm giảm độ ổn định của cột. Việc điều chỉnh tốc độ dòng và nhiệt độ cột một cách cẩn thận là cần thiết để đạt được hiệu suất tối ưu.

IV. Tối Ưu ESI MS Bí Quyết Nâng Cao Độ Nhạy và Độ Đặc Hiệu

Tối ưu hóa ESI-MS là một bước quan trọng khác để nâng cao độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp HPLC-ESI-MS. Các yếu tố cần được tối ưu hóa bao gồm điện áp phun, nhiệt độ nguồn ion, và các thông số khối phổ. Việc lựa chọn các thông số ESI-MS phù hợp sẽ giúp ion hóa hiệu quả các peptide HbA1c và giảm thiểu nhiễu nền. Phương pháp HPLC/ESI-MS được JCTLM công nhận năm 2013 là phương pháp định lượng HbA1c trong mẫu máu toàn phần.

4.1. Điều Chỉnh Điện Áp Phun và Nhiệt Độ Nguồn Ion

Điện áp phun và nhiệt độ nguồn ion ảnh hưởng đến hiệu quả ion hóa của các peptide HbA1c. Điện áp phun quá cao có thể gây ra sự phân mảnh của các ion, trong khi điện áp phun quá thấp có thể làm giảm hiệu quả ion hóa. Nhiệt độ nguồn ion quá cao có thể làm giảm độ ổn định của các ion, trong khi nhiệt độ nguồn ion quá thấp có thể làm giảm hiệu quả ion hóa. Việc điều chỉnh điện áp phun và nhiệt độ nguồn ion một cách cẩn thận là cần thiết để đạt được hiệu suất tối ưu.

4.2. Lựa Chọn Các Thông Số Khối Phổ Phù Hợp

Các thông số khối phổ, chẳng hạn như chế độ quét, độ phân giải, và năng lượng va chạm, ảnh hưởng đến độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp ESI-MS. Chế độ quét MRM (Multiple Reaction Monitoring) thường được sử dụng để tăng cường độ nhạy và độ đặc hiệu bằng cách theo dõi các ion đặc trưng cho các peptide HbA1c. Độ phân giải cao có thể giúp phân biệt các ion có khối lượng tương tự nhau. Năng lượng va chạm được sử dụng để phân mảnh các ion và tạo ra các ion con đặc trưng.

V. Ứng Dụng Thực Tiễn HPLC ESI MS Trong Kiểm Soát Chất Lượng HbA1c

HPLC-ESI-MS không chỉ là một phương pháp nghiên cứu mà còn là một công cụ mạnh mẽ trong kiểm soát chất lượng xét nghiệm HbA1c. Phương pháp này có thể được sử dụng để xác định giá trị ấn định của các mẫu chuẩn và mẫu kiểm tra chất lượng. HPLC-ESI-MS cũng có thể được sử dụng để đánh giá độ chính xác và độ tin cậy của các phương pháp xét nghiệm HbA1c khác. Việc ứng dụng quy trình đo lường tham chiếu được tối ưu hóa cho việc định lượng HbA1c sẽ giúp xác định giá trị ấn định của chương trình ngoại kiểm một cách chính xác hơn.

5.1. Đánh Giá Độ Chính Xác và Độ Tin Cậy Của Phương Pháp

HPLC-ESI-MS có thể được sử dụng để đánh giá độ chính xác và độ tin cậy của phương pháp bằng cách so sánh kết quả với các phương pháp tham chiếu khác. Độ chính xác được đánh giá bằng cách xác định độ lệch giữa kết quả đo được và giá trị thực. Độ tin cậy được đánh giá bằng cách xác định độ lặp lại và độ tái lập của kết quả.

5.2. Sử Dụng HPLC ESI MS Trong Chương Trình Ngoại Kiểm HbA1c

Việc sử dụng HPLC-ESI-MS trong chương trình ngoại kiểm HbA1c giúp đảm bảo chất lượng xét nghiệm HbA1c trên toàn quốc. Các phòng xét nghiệm tham gia chương trình ngoại kiểm sẽ gửi mẫu HbA1c đến một phòng thí nghiệm tham chiếu, nơi mẫu sẽ được phân tích bằng HPLC-ESI-MS. Kết quả sẽ được sử dụng để đánh giá hiệu suất của các phòng xét nghiệm tham gia và cung cấp phản hồi để cải thiện chất lượng xét nghiệm.

VI. Kết Luận Triển Vọng Phát Triển HPLC ESI MS Đo HbA1c

Tối ưu hóa phương pháp sắc ký lỏng trong đo lường HbA1c bằng kỹ thuật HPLC-ESI-MS là một lĩnh vực nghiên cứu đầy tiềm năng. Việc tiếp tục nghiên cứu và phát triển các kỹ thuật mới sẽ giúp nâng cao độ chính xác, độ nhạy, và độ đặc hiệu của phương pháp, từ đó cải thiện chất lượng xét nghiệm HbA1c và hỗ trợ hiệu quả quá trình điều trị bệnh nhân tiểu đường. Nghiên cứu xây dựng quy trình xét nghiệm tham chiếu đạt chuẩn quốc tế ISO 15193:2009 cũng là một trong những yêu cầu tiên quyết trong việc xây dựng mạng lưới phòng xét nghiệm tham chiếu.

6.1. Hướng Nghiên Cứu Phát Triển Phương Pháp HPLC ESI MS

Các hướng nghiên cứu phát triển phương pháp HPLC-ESI-MS bao gồm việc phát triển các cột sắc ký mới, pha động mới, và các kỹ thuật ion hóa mới. Nghiên cứu cũng tập trung vào việc giảm thiểu ảnh hưởng của các biến thể hemoglobin và các chất gây nhiễu khác. Ngoài ra, việc phát triển các phương pháp chuẩn hóa và kiểm soát chất lượng cũng là một ưu tiên.

6.2. Ứng Dụng Lâm Sàng Tiềm Năng Của HPLC ESI MS Trong Tương Lai

Trong tương lai, HPLC-ESI-MS có thể được sử dụng để phát triển các xét nghiệm HbA1c nhanh chóng và chính xác tại điểm chăm sóc (point-of-care testing). Phương pháp này cũng có thể được sử dụng để phát hiện sớm các biến chứng của bệnh tiểu đường và theo dõi hiệu quả điều trị bằng các loại thuốc mới. HPLC-ESI-MS cũng có thể đóng vai trò quan trọng trong việc cá nhân hóa điều trị bệnh tiểu đường dựa trên đặc điểm di truyền và sinh học của từng bệnh nhân.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Đái tháo đường đang là một trong những thách thức y tế toàn cầu nghiêm trọng nhất hiện nay, đòi hỏi các công cụ kiểm soát đường huyết phải đạt độ chuẩn xác tối đa. Theo các báo cáo dịch tễ học, việc giảm 1% chỉ số HbA1c giúp giảm tới 43% nguy cơ mắc các bệnh mạch máu ngoại vi gây cắt cụt chi dưới, 37% biến chứng vi mạch, 19% bệnh đục thủy tinh thể, 16% suy tim và 14% tỷ lệ nhồi máu cơ tim. Xét nghiệm HbA1c đóng vai trò là tiêu chuẩn vàng phản ánh mức đường huyết trung bình trong khoảng 8 đến 12 tuần của bệnh nhân, với ngưỡng chẩn đoán đái tháo đường được Tổ chức Y tế Thế giới xác định từ mức 6,5% trở lên.

Tuy nhiên, tại Việt Nam, phần lớn các cơ sở y tế đang triển khai đo lường HbA1c trên các hệ thống sắc ký trao đổi ion hoặc miễn dịch tự động, vốn dễ bị ảnh hưởng bởi các biến thể huyết sắc tố như HbE, HbF hoặc HbS. Nhằm hiện thực hóa mục tiêu trong Quyết định 316/QĐ-TTg của Thủ tướng Chính phủ về việc phát triển mạng lưới phòng xét nghiệm tham chiếu có năng lực thực hiện hoạt động tham chiếu cho 90% các xét nghiệm thông thường, việc nghiên cứu xây dựng một quy trình đo lường chuẩn mực là yêu cầu cấp thiết.

Đề tài được thực hiện với mục tiêu cụ thể là khảo sát và thiết lập các điều kiện tối ưu hóa phương pháp sắc ký lỏng trong đo lường HbA1c bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò khối phổ ion hóa tia điện (HPLC-ESI-MS). Nghiên cứu được triển khai tại Trung tâm Kiểm chuẩn chất lượng Xét nghiệm Y học trực thuộc Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh trong giai đoạn từ tháng 10 năm 2020 đến tháng 5 năm 2021. Kết quả nghiên cứu mang lại giá trị thực tiễn to lớn trong việc chuẩn hóa chuỗi liên kết đo lường, thiết lập giá trị ấn định chuẩn xác cho các chương trình ngoại kiểm tra chất lượng, nâng cao độ tin cậy của kết quả xét nghiệm lâm sàng trên toàn quốc.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Cơ sở lý thuyết của nghiên cứu dựa trên động học tạo thành hemoglobin glycate hóa (HbA1c) trong hồng cầu và lý thuyết phân tách khối phổ hiện đại. Phân tử hemoglobin ở người trưởng thành bình thường bao gồm thành phần chính là HbA1 chiếm từ 94% đến 98% và HbA2 chiếm từ 2% đến 3,5%. Phản ứng gắn glucose vào acid amin N-terminal valine của chuỗi beta-globin diễn ra không thuận nghịch trong suốt vòng đời 120 ngày của hồng cầu, tạo nên phức hợp HbA1c bền vững.

Kỹ thuật phân tích cốt lõi được xây dựng trên nguyên lý sắc ký lỏng ghép khối phổ hai lần liên tiếp (LC-MS/MS) với nguồn ion hóa tia điện (ESI) ở chế độ ion dương dưới điện thế đầu phun 2500V. Phương pháp đo lường sử dụng chế độ ghi phổ theo dõi đa phản ứng (MRM), cho phép cô lập các ion tiền thân và phân mảnh chọn lọc thành các ion sản phẩm đặc thù theo tỷ lệ khối lượng trên điện tích (m/z).

Mô hình nghiên cứu tuân thủ nghiêm ngặt tiêu chuẩn quốc tế ISO 15193:2009 và ISO 15195:2018 về quy trình đo lường tham chiếu trong y học phòng thí nghiệm được Ủy ban Hỗn hợp về Truy xuất Nguồn gốc trong Y học Thí nghiệm (JCTLM) công nhận. Cơ sở liên kết chuẩn đo lường được quy chiếu trực tiếp từ vật liệu tham chiếu chuẩn ERM-AD500/IFCC và bộ chuẩn tinh khiết IRMM/IFCC-466 có giá trị ấn định 934 ± 22 mmol/mol cùng IRMM/IFCC-467 có giá trị 976 mmol/mol. Công thức chuyển đổi chuẩn hóa giữa Liên đoàn Hóa học Lâm sàng Quốc tế (IFCC) tính bằng mmol/mol và Chương trình Tiêu chuẩn hóa Glycohemoglobin Quốc gia (NGSP) tính bằng % được áp dụng chuẩn xác nhằm đồng bộ hóa dữ liệu lâm sàng.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được thiết kế theo mô hình thực nghiệm trong phòng thí nghiệm. Nguồn mẫu nghiên cứu là máu toàn phần thu thập tại Trung tâm Truyền máu Chợ Rẫy thuộc Bệnh viện Chợ Rẫy, được bảo quản bằng chất chống đông CPDA-1 với thể tích từ 250 đến 450 ml, không bị tán huyết, không vón cục và được sản xuất trong thời gian không quá 7 ngày. Tất cả các mẫu đều được sàng lọc âm tính với HIV, HBV, HCV, giang mai và sốt rét.

Cỡ mẫu nghiên cứu được xác định gồm tổng cộng 40 lượt phân tích, trong đó giai đoạn khảo sát điều kiện sắc ký thực hiện trên 20 mẫu chuẩn và 5 mẫu trắng, giai đoạn tối ưu hóa hệ thống sắc ký thực hiện trên 10 mẫu chuẩn và 5 mẫu trắng. Lý do lựa chọn kỹ thuật HPLC-ESI-MS thay vì các phương pháp thông thường là nhờ khả năng phân tách chọn lọc tuyệt đối các hexapeptit của chuỗi beta-globin sau khi phân cắt bằng enzyme đặc hiệu endoproteinase Glu-C (EC 3.4.21.19), loại trừ triệt để hiện tượng dương tính giả hoặc âm tính giả do biến thể huyết sắc tố gây ra.

Quy trình tiền xử lý mẫu bao gồm 3 bước: rửa tế bào hồng cầu 3 lần bằng dung dịch natri clorid 0,9%, làm tán huyết trong hệ đệm MES ở pH 6,2, sau đó ủ phân cắt đặc hiệu bằng enzyme Glu-C để giải phóng hexapeptit glycated đại diện cho HbA1c và hexapeptit non-glycated đại diện cho HbA0. Dữ liệu phổ sắc ký được thu nhận và xử lý bằng phần mềm chuyên dụng, đánh giá độ lặp lại thông qua độ lệch chuẩn (SD) và hệ số biến thiên (CV).

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình khảo sát và tối ưu hóa hệ thống sắc ký lỏng HPLC-ESI-MS đã xác lập được bộ thông số vận hành chuẩn cho phép định lượng chính xác tỷ lệ HbA1c trong mẫu máu. Các phát hiện thực nghiệm nổi bật bao gồm:

Thứ nhất, việc sử dụng cột sắc ký pha đảo C18/C12 với kích thước hạt siêu nhỏ 1,8 đến 1,9 micromet kết hợp chương trình rửa giải gradient dung môi pha động gồm nước tinh khiết và acetonitril bổ sung 0,1% acid formic đã mang lại hiệu quả tách pic xuất sắc. Hệ số đối xứng pic (As) đạt giá trị tối ưu trong khoảng từ 1,05 đến 1,15, giúp loại bỏ hoàn toàn hiện tượng kéo đuôi pic và đảm bảo thời gian phân tích rút ngắn xuống dưới 8 phút cho mỗi chu kỳ chạy mẫu.

Thứ hai, điều kiện ion hóa tia điện ESI ở chế độ ion dương tại điện áp 2500V cùng kỹ thuật phân mảnh MRM cho thấy độ nhạy vượt trội. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của hexapeptit glycated và non-glycated đạt mức nồng độ phần tỷ (ppb), cho phép nhận diện rõ ràng các phân đoạn peptit đặc trưng ngay cả ở nồng độ protein rất thấp mà không bị nhiễu nền.

Thứ ba, đường chuẩn định lượng thể hiện độ tuyến tính tuyệt hảo với hệ số tương quan r² đạt trên 0,999 trong toàn bộ dải đo lâm sàng từ 20 đến 150 mmol/mol theo đơn vị IFCC. Độ chụm của phương pháp đạt hệ số biến thiên CV nội bộ dưới 1,8%, và độ chệch tương đối so với giá trị ấn định của mẫu vật liệu chuẩn ERM-AD500/IFCC duy trì ở mức dưới 1,2%, đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn nghiêm ngặt của mạng lưới IFCC quốc tế.

Thảo luận kết quả

Hiệu quả phân tách cao của quy trình bắt nguồn từ việc sử dụng acid formic 0,1% thay thế cho acid trifluoroacetic (TFA), giúp cải thiện đáng kể khả năng bay hơi của các giọt sương ion hóa tại đầu phun ESI mà không gây ra hiện tượng ức chế ion. Việc sử dụng enzyme endoproteinase Glu-C với tính đặc hiệu cao đảm bảo phân cắt chính xác liên kết peptid tại đầu tận cùng của chuỗi beta-globin, tạo ra các hexapeptit đồng nhất để phân tích khối phổ.

So sánh với các nghiên cứu quốc tế, kết quả của đề tài hoàn toàn tương đồng với các công bố của nhóm tác giả Kaiser và cộng sự tại Đức khi sử dụng cột pha đảo và hệ đệm acetonitril/acid formic đạt độ lệch so với giá trị mục tiêu IFCC trong khoảng 0,87% đến 1,00%. Đồng thời, kết quả này cũng tương thích với nghiên cứu của tác giả Zhixin Song tại Trung Quốc trên 89 bệnh viện, nơi phương pháp HPLC-ESI-MS cải tiến giúp duy trì độ chệch dưới 5% tại hơn 67% số phòng xét nghiệm được đánh giá.

Trong các báo cáo khoa học, dữ liệu sắc ký của nghiên cứu được minh họa trực quan thông qua biểu đồ sắc ký đồ 2D thể hiện sự tách biệt rõ ràng giữa pic hexapeptit glycated và pic hexapeptit non-glycated theo thời gian lưu, kết hợp với bảng đối chiếu phân tích hồi quy tuyến tính giữa nồng độ chất chuẩn và diện tích pic tích phân. Nhờ vậy, quy trình chứng minh được tính ổn định dài hạn, độ chọn lọc tuyệt đối và khả năng ứng dụng thực tiễn cao trong phân tích chuẩn đo lường.

Đề xuất và khuyến nghị

Nhằm phát huy tối đa hiệu quả nghiên cứu trong thực tiễn kiểm chuẩn y học, các khuyến nghị cụ thể được đề xuất như sau:

Thứ nhất, Trung tâm Kiểm chuẩn chất lượng Xét nghiệm Y học cần hoàn thiện hồ sơ kỹ thuật và tiến hành đăng ký công nhận năng lực phòng xét nghiệm tham chiếu đạt chuẩn ISO 15195:2018 và ISO/IEC 17025:2017 trong lộ trình 12 tháng tới, khẳng định vị thế đơn vị tiên phong về liên kết chuẩn đo lường tại Việt Nam.

Thứ hai, ứng dụng ngay quy trình HPLC-ESI-MS đã được tối ưu hóa vào việc thiết lập giá trị ấn định cho các bộ mẫu ngoại kiểm (EQA) định kỳ 4 đợt mỗi năm, hướng tới mục tiêu nâng tỷ lệ phòng xét nghiệm đạt tiêu chuẩn ngoại kiểm HbA1c trên toàn quốc lên mức 95% vào năm 2025.

Thứ ba, các bệnh viện hạng đặc biệt và bệnh viện tuyến trung ương cần ưu tiên phân bổ ngân sách để nâng cấp trang thiết bị sắc ký lỏng khối phổ ba tứ cực, đồng thời chuẩn hóa việc sử dụng vật liệu tham chiếu được chứng nhận (CRM) như ERM-AD500/IFCC trong công tác hiệu chuẩn máy định kỳ mỗi quý một lần.

Thứ tư, Bộ Y tế và Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh cần phối hợp xây dựng chương trình đào tạo chuyển giao kỹ thuật chuyên sâu về phân tích proteomics và vận hành LC-MS/MS, đặt mục tiêu tập huấn nâng cao năng lực cho ít nhất 50 cử nhân và thạc sĩ kỹ thuật xét nghiệm y học trong vòng 2 năm tới.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Công trình nghiên cứu mang giá trị học thuật và ứng dụng chuyên sâu, là tài liệu tham khảo thiết yếu cho các nhóm đối tượng sau:

1. Chuyên viên quản lý chất lượng và nhân viên trung tâm kiểm chuẩn xét nghiệm: Sử dụng luận văn như cẩm nang kỹ thuật chuẩn mực để xây dựng quy trình đo lường tham chiếu RMP, triển khai hệ thống quản lý theo ISO 15195 và kiểm soát độ không đảm bảo đo trong chương trình thử nghiệm thành thạo.

2. Bác sĩ chuyên khoa nội tiết và bác sĩ xét nghiệm lâm sàng: Nắm vững cơ chế phân tử của phản ứng glycat hóa, hiểu rõ các yếu tố gây nhiễu từ các biến thể hemoglobin bất thường để biện giải kết quả chính xác, đồng thời thuần thục công thức chuyển đổi giữa các đơn vị đo IFCC, NGSP và nồng độ glucose ước tính trung bình (eAG).

3. Học viên cao học, nghiên cứu sinh ngành Kỹ thuật Y học và Hóa phân tích: Khai thác chi tiết khung lý thuyết về phân tích khối phổ ESI-MS/MS, kỹ thuật cắt peptit bằng enzyme sinh học và phương pháp thiết kế thực nghiệm tối ưu hóa điều kiện sắc ký pha đảo.

4. Kỹ sư nghiên cứu và phát triển (R&D) tại các doanh nghiệp thiết bị chẩn đoán in vitro: Ứng dụng các thông số kỹ thuật về cột sắc ký, thành phần pha động và gradient rửa giải để thiết kế, tối ưu hóa các dòng máy xét nghiệm HbA1c tự động thế hệ mới.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao kỹ thuật HPLC-ESI-MS được coi là tiêu chuẩn tham chiếu hàng đầu cho xét nghiệm HbA1c? Kỹ thuật HPLC-ESI-MS kết hợp hoàn hảo giữa khả năng phân tách vật lý của sắc ký lỏng và độ chọn lọc khối lượng siêu nhạy của khối phổ. Phương pháp đo lường trực tiếp tỷ lệ phân tử hexapeptit bị glycat hóa so với dạng không glycat hóa ở mức độ phân tử, loại trừ hoàn toàn các sai số do biến thể huyết sắc tố gây ra mà các kỹ thuật đo quang thông thường gặp phải.

2. Biến thể hemoglobin ảnh hưởng như thế nào đến xét nghiệm HbA1c thường quy và kỹ thuật này xử lý ra sao? Các biến thể như HbE, HbF hoặc CarHb làm thay đổi điện tích hoặc cấu trúc bề mặt của phân tử hemoglobin, dẫn đến sự chồng lấn pic trên sắc ký trao đổi ion hoặc phản ứng chéo trong xét nghiệm miễn dịch. Kỹ thuật HPLC-ESI-MS sử dụng enzyme Glu-C để cắt lấy riêng đoạn 6 acid amin đầu N, vốn có khối lượng m/z cố định, giúp nhận diện chính xác tuyệt đối mà không bị ảnh hưởng bởi đột biến ở các vị trí khác trên chuỗi globin.

3. Vai trò của mẫu vật liệu tham chiếu ERM-AD500/IFCC trong nghiên cứu là gì? Vật liệu tham chiếu chuẩn ERM-AD500/IFCC chứa các mức nồng độ HbA1c đã được chứng nhận quốc tế bởi các phòng xét nghiệm tham chiếu chuẩn mực của Liên đoàn Hóa học Lâm sàng Quốc tế. Mẫu này đóng vai trò chất chuẩn hiệu chuẩn chính để xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp, thiết lập chuỗi truy xuất nguồn gốc đo lường theo đơn vị chuẩn SI và đánh giá độ chính xác thực nghiệm.

4. Công thức chuyển đổi giữa đơn vị IFCC (mmol/mol) và NGSP (%) được tính như thế nào? Mối liên hệ giữa hai hệ đơn vị được chuẩn hóa thông qua phương trình hồi quy tuyến tính: giá trị phần trăm theo NGSP bằng 0,09148 nhân với giá trị IFCC rồi cộng với 2,152. Ví dụ, mức HbA1c chuẩn 42 mmol/mol theo IFCC tương đương với 6,0% theo NGSP, tương ứng mức đường huyết ước tính trung bình eAG là 126 mg/dL (7,0 mmol/L).

5. Việc tối ưu hóa quy trình này hỗ trợ thực hiện Quyết định 316/QĐ-TTg như thế nào? Quy trình HPLC-ESI-MS tối ưu hóa cung cấp năng lực kỹ thuật nền tảng để Trung tâm Kiểm chuẩn chất lượng Xét nghiệm Y học xây dựng phòng xét nghiệm tham chiếu đạt chuẩn quốc tế ISO 15195. Đây là bước đi cốt lõi nhằm thiết lập mạng lưới tham chiếu đạt tỷ lệ 90% xét nghiệm thông thường, phục vụ liên thông và công nhận kết quả xét nghiệm giữa các bệnh viện trên toàn quốc.

Kết luận

• Luận văn đã tối ưu hóa thành công quy trình phân tích HbA1c bằng kỹ thuật HPLC-ESI-MS với thời gian chạy mẫu dưới 8 phút và hệ số đối xứng pic đạt từ 1,05 đến 1,15.
• Thiết lập hoàn chỉnh phương pháp xử lý mẫu thông qua phân cắt enzyme endoproteinase Glu-C, giúp định lượng chọn lọc hexapeptit ở dải đo tuyến tính rộng với hệ số tương quan r² trên 0,999.
• Đạt độ chính xác cao với hệ số biến thiên lặp lại CV dưới 1,8% và độ chệch tương đối so với chuẩn quốc tế ERM-AD500/IFCC duy trì dưới mức 1,2%.
• Đóng góp cơ sở khoa học và thực tiễn vững chắc cho việc xây dựng phòng xét nghiệm tham chiếu đạt chuẩn ISO 15195:2018 đầu tiên tại Việt Nam.
• Trong giai đoạn tiếp theo, quy trình cần được mở rộng áp dụng để ấn định giá trị chuẩn cho các chương trình ngoại kiểm quốc gia và chuyển giao kỹ thuật cho các trung tâm kiểm chuẩn y tế lớn trên toàn quốc.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Trong mục tiêu chung của Quyết định 316 – QĐ/TTg về việc Phê duyệt Đề án Tăng cường năng lực hệ thống quản lý chất lượng xét nghiệm y học giai đoạn 2016 – 2025 [8] có nêu rõ: Nâng cao chất lượng xét nghiệm y học để đảm bảo kết quả xét nghiệm chính xác, kịp thời, chuẩn hóa, làm cơ sở cho việc liên thông, công nhận kết quả xét nghiệm giữa các cơ sở khám bệnh, chữa bệnh, cơ sở y tế có thực hiện xét nghiệm (sau đây gọi chung là các phòng xét nghiệm), nhằm giảm phiền hà, chi phí cho người bệnh, tiết kiệm nguồn lực của xã hội, đồng thời hội nhập mạng lưới kiểm chuẩn chất lượng xét nghiệm trong khu vực và trên thế giới. Với mục tiêu cụ thể hơn là nâng cao năng lực hệ thống kiểm chuẩn chất lượng xét nghiệm của các phòng xét nghiệm và đặt mục tiêu đến năm 2020, phải hình thành và phát triển mạng lưới phòng xét nghiệm tham chiếu có đủ năng lực thực hiện hoạt động tham chiếu cho 90% các xét nghiệm thông thường. Nghiên cứu sẽ góp phần mang lại một quy trình đo lường tham chiếu được tối ưu hóa cho việc định lượng HbA1c. Việc ứng dụng quy trình này trong chương trình ngoại kiểm HbA1c sẽ giúp xác định giá trị ấn định của chương trình một cách chính xác hơn, đồng thời với khả năng truy nguyên nguồn gốc kết quả xét nghiệm sẽ đem lại sự tin cậy từ các phòng xét nghiệm tham gia ngoại kiểm tại Trung tâm.

Bên cạnh đó, việc phân tích trên quy trình đo lường tham chiếu đạt tiêu chuẩn quốc tế tại Việt Nam sẽ giúp cho các phòng xét nghiệm kiểm soát chất lượng, tăng mức độ tin cậy của các xét nghiệm tại các cơ sở thực hiện xét nghiệm này. Nghiên cứu xây dựng quy trình xét nghiệm tham chiếu đạt chuẩn quốc tế ISO 15193:2009 [21] cũng là một trong những yêu cầu tiên quyết trong việc xây dựng mạng lưới phòng xét nghiệm tham chiếu mà Trung tâm Kiểm chuẩn chất lượng Xét nghiệm Y học. – Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh hướng đến và cũng là đơn vị đầu tiên triển khai thực hiện mô hình này. Bước đầu xây dựng phòng xét nghiệm tham chiếu, chúng tôi lựa chọn xét nghiệm HbA1c để tiến hành nghiên cứu.

Với lý do: Phương pháp định lượng HbA1c trong mẫu máu toàn phần đã được JCTLM công nhận năm 2013 là phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò khối phổ ion hóa tia điện (HPLC/ESI-MS) là một phương pháp khá mới mẻ và được khuyến khích ứng dụng trên những thiết bị phân tích HbA1c. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Tối ưu hóa phương pháp sắc ký lỏng trong đo lường HbA1c bằng kỹ thuật HPLC- ESI-MS” tại Trung tâm Kiểm chuẩn chất lượng xét nghiệm y học – trực thuộc Bộ Y tế - Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh năm 2020. CÂU HỎI NGHIÊN CỨU Để đảm bảo kết quả xét nghiệm HbA1c phải tin cậy và nhanh chóng, việc tối ưu hóa phương pháp sắc ký lỏng trong đo lường HbA1c được thực hiện như thế nào? MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Khảo sát điều kiện tối ưu hóa phương pháp sắc ký lỏng trong đo lường HbA1c bằng kỹ thuật HPLC-ESI-MS.1 Xét nghiệm HbA1c 1.1 Nguyên lý xét nghiệm HbA1c Trong hồng cầu có chứa hemoglobin có khả năng vận chuyển oxy đến mọi nơi trong cơ thể. Trong bệnh ĐTĐ, glucose tích tụ lại trong máu và kết hợp với hemoglobin tạo thành dạng phức hợp glucose-hemoglobin.

Vì hồng cầu có tuổi thọ tầm 3 tháng. Xét nghiệm đo lượng phức hợp này cho biết giá trị đường huyết trung bình trong 3 tháng trước đó. Nếu giá trị đường huyết trong vòng vài tuần qua tăng cao lên. Thì giá trị glucose trong hồng cầu cũng tăng cao.2 Nguồn gốc, sự hình thành của xét nghiệm HbA1c Hemoglobin và quá trình tạo thành HbA1c: Hemoglobin (Hb) là một protein màu (chromoprotein), gồm một phân tử globin gắn với bốn nhân hem.

Sự tổng hợp Hb bắt đầu từ giai đoạn tiền nguyên hồng cầu đến giai đoạn hồng cầu lưới ở trong tủy xương. Quá trình tạo thành Hb gồm có tổng hợp hem và tổng hợp globin. - Hem: Là một sắc tố có màu, chung cho tất cả các loài, gồm một vòng porphylin, trung tâm chứa ion Fe2+ (quyết định màu đỏ của hồng cầu). - Globin: Là một protein đặc trưng cho từng loài, cấu tạo gồm bốn chuỗi polypeptit (α, β, δ, γ) giống nhau từng đôi một, mỗi chuỗi gắn với một hem.

Bình thường ở người trưởng thành có các loại Hb sau: - HbA1: gồm 2 chuỗi α và 2 chuỗi β (α2β2), chiếm tỷ lệ 94 - 98%. - HbA2: gồm 2 chuỗi α và 2 chuỗi δ (α2δ2), chiếm tỷ lệ 2 – 3,5%. - HbF: gồm 2 chuỗi α và 2 chuỗi γ (α2γ2), chiếm tỷ lệ 0 - 1% (còn gọi là huyết sắc tố bào thai vì chiếm tỷ lệ rất cao ở giai đoạn cuối của thai nhi và thời kỳ sơ sinh). Ngoài ra khi có đột biến các gen cấu trúc hay gen điều hòa sẽ tạo ra các Hb bất thường như: HbS, HbE, HbC, HbJ, bệnh thalassemia.

Sự kết hợp giữa glucose với một acid amin ở phần cuối của chuỗi β trong phân tử Hb tạo ra sản phẩm trung gian là Aldimin, sau đó Aldimin sẽ chuyển hóa thành HbA1. Tùy thuộc vào loại đường và vị trí gắn vào HbA, có 4 loại HbA1: HbA1a1, HbA1a2, HbA1b, HbA1c. Trong máu, đường đơn chủ yếu là glucose nên thành phần chủ yếu của HbA1 là HbA1c. Phản ứng này chỉ xảy ra theo một chiều và không cần chất xúc tác.

HbA1c tồn tại cùng với thời gian tồn tại của hồng cầu ở trong máu (khoảng 120 ngày). Vai trò của HbA1c: Năm 1970, lần đầu tiên người ta ghi nhận hemoglobin glycat hóa (HbA1c) như một Hb “bất thường” trên bệnh nhân ĐTĐ. Sau khi được phát hiện, đã có rất nhiều nghiên cứu chứng minh có sự liên quan giữa nồng độ HbA1c và glucose máu. Tiềm năng sử dụng HbA1c trong việc chăm sóc bệnh nhân ĐTĐ lần đầu được đề cập đến vào năm 1985 trong một báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới.

Năm 2005, Tổ chức Y tế Thế giới cùng Liên đoàn Đái tháo đường Thế giới đã xem xét và cập nhật lại các tiêu chí chẩn đoán ĐTĐ. Sau khi cân nhắc các dữ kiện thông tin và bằng chứng sẵn có vào thời điểm hiện tại, Ủy ban các chuyên gia thống nhất chưa nên chấp nhận sử dụng HbA1c như một tiêu chí chẩn đoán ĐTĐ do tính chuẩn xác trong kỹ thuật xét nghiệm còn chưa được chuẩn hóa [6]. Vào tháng 3 năm 2009, Tổ chức Y tế Thế giới tham khảo ý kiến của Ủy ban các chuyên gia đã đưa HbA1c là một trong các tiêu chí chẩn đoán ĐTĐ. Chẩn đoán ĐTĐ khi HbA1c ≥ 6,5%, xét nghiệm phải được thực hiện ở cơ sở xét nghiệm đã được NGSP (National glycohemoglobin standardization program) cấp giấy chứng nhận và chuẩn hóa trong theo kỹ thuật dùng trong nghiên cứu DCCT (Diabetes control and complications trial).

[35] HbA1c tồn tại cùng với sự tồn tại của hồng cầu trong máu (120 ngày) do đó nồng độ HbA1c phản ánh mức dao động đường máu trung bình trong vòng 8 -. 12 tuần trước. Xét nghiệm này có thể được thực hiện vào bất kỳ thời điểm nào trong ngày mà bệnh nhân không cần nhịn đói. Các nghiên cứu gần đây đều nhấn mạnh vai trò của HbA1c trong việc theo dõi kiểm soát bệnh nhân ĐTĐ và việc đưa HbA1c về càng gần trị số bình thường càng làm giảm có ý nghĩa các biến chứng của bệnh.

Theo UKPDS, một nghiên cứu đa trung tâm theo dõi dài hạn các biến chứng của bệnh ĐTĐ, khẳng định kiểm soát đường máu tích cực làm cải thiện các biến chứng của bệnh. Giảm 1% HbA1c có thể làm giảm 43% các bệnh mạch máu ngoại vi và cắt cụt chi dưới, 37% các bệnh mạch máu nhỏ, 19% đục thủy tinh thể, 16% biến chứng suy tim, 14% biến chứng nhồi máu cơ tim và 12% nguy cơ đột quỵ.2 Các phương pháp xét nghiệm HbA1c hiện nay 1.1 Phương pháp phân tách Hemoglobin được glycate hóa (A1c, gắn glucose) và hemoglobin không glycate (A0, không gắn glucose) có các đặc điểm khác nhau, điều này cho phép phân tách 2 loại và định lượng riêng A1c cũng như tổng A1c + A0. Các kỹ thuật áp dụng phương pháp này, bao gồm: sắc ký trao đổi ion (IEC, ion exchange chromatography), điện di mao quản (CE, cappillary electrophoresis), sắc ký ái lực (AC, affinity chromatography). - Sắc ký trao đổi ion (Ion exchange chromatography) [46] và Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High pressure liquyd chromatography) Do glucose gắn vào vị trí β-valine, nên điểm đẳng điện của A1c khác với A0 là 0,02 pI, sự khác biệt này cho phép phân tách bằng sắc ký trao đổi ion (IEC).

Tuy nhiên, sự khác biệt đẳng điện giữa A1c và A0 là rất nhỏ, chỉ thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC, high pressure liquyd chromatography) mới có thể thực hiện phân tách chúng [4], [16], [40]. Khi phân tích HbA1c bằng thiết bị HPLC, từng mẫu sẽ được phân tích một, điều này buộc các nhà sản xuất phải cân bằng giữa hiệu suất máy và chất lượng phân tích. Ngoài định lượng A1c và A0, các huyết sắc tố bất thường khác có thể được phát hiện trên biểu đồ sắc ký như: HbF (huyết sắc tố bào thai), HbA1a/b (huyết sắc tố phụ), CarHb (carbamylated Hb), HbS (hồng cầu hình liềm). Đây là một ưu điểm vượt trội của phân tích HbA1c bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), bởi khi có mặt các biến thể hemoglobin, kết quả HbA1c không phản ánh đúng mức đường huyết trung bình.

Năm 2010, ADA đã công bố HbA1c xác định bằng HPLC được coi là tiêu chuẩn cho chẩn đoán đái tháo đường. Do các phòng xét nghiệm phân tích HbA1c theo các phương pháp khác nhau (HPLC, AC, CE, IA, EA), nên kết quả thu được sẽ không giống nhau. Vì vậy, việc chuẩn hóa phương pháp đo HbA1c là cực kỳ quan trọng. Theo đó, HPLC được coi là tiêu chuẩn vàng, là phương pháp tham chiếu của các phương pháp khác, được sử dụng trong các nghiên cứu của UKPDS và DCCT.

- Điện di mao quản (Cappilary electrophoresis) [24] Điện di mao quản là một kỹ thuật phân tách dựa trên sự di chuyển khác nhau của các hemoglobin mang điện tích khác nhau trong cột mao quản, dưới ảnh hưởng của điện trường tạo ra bởi điện áp cao thế 10kV. Glucose trong GHb có ái lực với acid boronic, trong khi NGHb thì không. Do đó NGHb chạy tự do qua cột resin phủ acid boronic, trong khi đó GHb bị cản trở rồi sau đó phân tách khỏi NGHb. Điều này khiến sắc ký đồ của AC không giống như IEC và CE, NGHb xuất hiện trước, sau đó là Hb.