Tác Động Độc Hại và Phản Ứng Histopathological của Cá Tilapia Sau Khi Bị Ô Nhiễm Chì (II)-Nitrate

Tài liệu nghiên cứu Luận văn toxicological impact and histopathological response of tilapia after lead ii nitrate pb, tổng hợp lý thuyết và thực hành, cung cấp kiến thức chuyên

• Tác giả: Mendoza, Jimlea Nadezhda A.
• Người hướng dẫn: Krisna Murti, MD
• Trường học: Thai Nguyen University
• Chuyên ngành: Environmental Science and Management
• Đề tài: Tác Động Độc Hại và Phản Ứng Histopathological của Cá Tilapia Sau Khi Bị Ô Nhiễm Chì (II)-Nitrate
• Loại tài liệu: bachelor thesis
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Thai Nguyen

Mục lục chi tiết

• ACKNOWLEDGEMENT
• ABSTRACT
• 1. PART I: BACKGROUND AND RATIONALE
• 1.1. Objectives
• 1.2. Research questions and hypotheses
• 1.3. Lead Compound- Lead (II) Nitrate
• 1.4. Toxic effects of Lead on organisms
• 1.5. Histopathological Effects
• 2. MATERIALS AND METHODS
• 2.1. Time and Place
• 2.2. Histopathological observation of gills
• 2.3. Histopathological observations of heart
• 2.4. Histopathological observations of Dorsal muscle
• 2.5. Histopathological observations of liver
• 3. DISCUSSION AND CONCLUSION
• LIST OF FIGURES
• LIST OF TABLES

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Tác Động Độc Hại Của Chì II Nitrate Lên Cá

Ô nhiễm kim loại nặng, đặc biệt là chì (II)-nitrate, đang trở thành mối lo ngại lớn đối với hệ sinh thái thủy sinh. Các kim loại này có thể tích lũy trong chuỗi thức ăn, gây ra những tác động tiêu cực đến sức khỏe con người và sự bền vững của nguồn cung cấp thực phẩm. Các chất ô nhiễm từ hoạt động công nghiệp, sinh hoạt và nông nghiệp cuối cùng sẽ được hấp thụ bởi thực vật và động vật thủy sinh. Nghiên cứu này tập trung vào đánh giá tác động của chì (II)-nitrate lên cá Tilapia, một loài cá có giá trị kinh tế và sinh thái quan trọng. Mục tiêu là làm sáng tỏ những thay đổi histopathological (mô bệnh học) ở các cơ quan khác nhau của cá sau khi tiếp xúc với ô nhiễm chì (II)-nitrate.

1.1. Tầm Quan Trọng Của Việc Nghiên Cứu Độc Tính Chì Lên Cá

Nghiên cứu về độc tính của chì trên cá là rất quan trọng vì cá là một nguồn protein chính cho con người. Cá đóng vai trò là bio-indicator (chỉ thị sinh học) về ô nhiễm kim loại nặng trong hệ sinh thái thủy sinh. Việc hiểu rõ tác động của chì (II)-nitrate lên cá giúp đánh giá rủi ro tiềm ẩn đối với sức khỏe con người và hệ sinh thái. Nghiên cứu này cung cấp cơ sở khoa học cho việc đưa ra các quyết định và chính sách bảo vệ môi trường và sức khỏe cộng đồng.

1.2. Cá Tilapia Như Một Mô Hình Nghiên Cứu Độc Tính Thủy Sản

Cá Tilapia (Oreochromis niloticus) được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu độc tính học thủy sản do khả năng chịu đựng và thích nghi với nhiều điều kiện môi trường khác nhau. Chúng cũng là một loài cá có giá trị kinh tế quan trọng, được nuôi rộng rãi trên toàn thế giới. Do đó, việc nghiên cứu tác động của chì (II)-nitrate lên cá Tilapia có ý nghĩa thực tiễn lớn trong việc bảo vệ ngành nuôi trồng thủy sản và đảm bảo an toàn thực phẩm.

II. Vấn Đề Ô Nhiễm Chì II Nitrate Thách Thức Cho Cá Tilapia

Ô nhiễm chì (II)-nitrate trong môi trường nước là một vấn đề nghiêm trọng, ảnh hưởng đến sức khỏe của các sinh vật thủy sinh, đặc biệt là cá. Chì có thể xâm nhập vào nguồn nước từ nhiều nguồn khác nhau, bao gồm nước thải công nghiệp, hoạt động khai thác mỏ và sử dụng thuốc trừ sâu. Khi cá tiếp xúc với chì (II)-nitrate, nó có thể gây ra nhiều tác động tiêu cực, bao gồm tổn thương các cơ quan, rối loạn chức năng sinh lý và giảm khả năng sinh sản. Nghiên cứu này tập trung vào việc đánh giá những thay đổi histopathological ở các cơ quan của cá Tilapia sau khi tiếp xúc với ô nhiễm chì (II)-nitrate.

2.1. Các Nguồn Gây Ô Nhiễm Chì II Nitrate Trong Môi Trường Nước

Ô nhiễm chì (II)-nitrate có thể bắt nguồn từ nhiều nguồn khác nhau, bao gồm nước thải công nghiệp, hoạt động khai thác mỏ, sử dụng thuốc trừ sâu và các hoạt động nông nghiệp. Các hoạt động này có thể giải phóng chì (II)-nitrate vào môi trường nước, gây ra ảnh hưởng của kim loại nặng lên hệ sinh thái nước ngọt. Việc xác định và kiểm soát các nguồn gây ô nhiễm này là rất quan trọng để bảo vệ sức khỏe của các sinh vật thủy sinh.

2.2. Cơ Chế Độc Tính Của Chì II Nitrate Đối Với Cá

Cơ chế độc tính của chì đối với cá rất phức tạp và có thể khác nhau tùy thuộc vào loài cá, nồng độ chì và thời gian phơi nhiễm. Chì có thể xâm nhập vào cơ thể cá thông qua mang, da và đường tiêu hóa. Sau khi xâm nhập, chì có thể tích lũy trong các cơ quan khác nhau, gây ra tổn thương tế bào và rối loạn chức năng sinh lý. Chì cũng có thể gây ra stress oxy hóa ở cá, dẫn đến tổn thương DNA và protein.

III. Phản Ứng Histopathological Của Cá Tilapia Với Chì II Nitrate

Nghiên cứu này tập trung vào việc đánh giá phản ứng histopathological của cá Tilapia sau khi tiếp xúc với chì (II)-nitrate. Các mẫu mô từ mang, tim, gan và cơ lưng của cá được kiểm tra dưới kính hiển vi để xác định những thay đổi về cấu trúc tế bào. Kết quả cho thấy rằng chì (II)-nitrate gây ra những tổn thương đáng kể cho các cơ quan này, bao gồm viêm, hoại tử và thoái hóa. Mức độ tổn thương tăng lên khi nồng độ chì (II)-nitrate tăng lên.

3.1. Tổn Thương Mô Bệnh Học Ở Mang Cá Tilapia

Mang là cơ quan chính chịu trách nhiệm cho việc trao đổi khí ở cá, và do đó, rất dễ bị tổn thương bởi các chất ô nhiễm trong nước. Nghiên cứu này cho thấy rằng chì (II)-nitrate gây ra những tổn thương đáng kể cho mang cá Tilapia, bao gồm disintegration of secondary lamellae (phân hủy phiến thứ cấp), atrophy (teo), curling and shortening of secondary lamellae (cuộn và ngắn phiến thứ cấp), swelling/inflammation (sưng/viêm), desquamation (bong tróc), epithelial lifting (nâng biểu mô), curling bend of secondary lamellae (uốn cong phiến thứ cấp) và necrosis (hoại tử). Những tổn thương này có thể làm giảm khả năng trao đổi khí của cá, dẫn đến suy hô hấp và tử vong.

3.2. Ảnh Hưởng Của Chì II Nitrate Lên Tim Gan Và Cơ Lưng Cá

Ngoài mang, chì (II)-nitrate cũng gây ra những tổn thương đáng kể cho tim, gan và cơ lưng của cá Tilapia. Ở tim, các nhà nghiên cứu quan sát thấy atrophy and splitting of muscle fibers (teo và tách sợi cơ). Ở gan, họ quan sát thấy sinusoidal dilatation (giãn xoang) và leukocyte infiltration (xâm nhập bạch cầu). Ở cơ lưng, họ quan sát thấy atrophy in dorsal muscles (teo cơ lưng) và splitting of dorsal muscle fibers (tách sợi cơ lưng), necrotic damage (tổn thương hoại tử) và degradation of muscle fibers (thoái hóa sợi cơ). Những tổn thương này có thể ảnh hưởng đến chức năng của các cơ quan này, dẫn đến suy giảm sức khỏe và khả năng sinh tồn của cá.

IV. Ứng Dụng Nghiên Cứu Đánh Giá Rủi Ro Ô Nhiễm Chì Cho Thủy Sản

Nghiên cứu này cung cấp thông tin quan trọng để đánh giá rủi ro ô nhiễm chì đối với thủy sản. Kết quả cho thấy rằng chì (II)-nitrate có thể gây ra những tổn thương nghiêm trọng cho các cơ quan của cá Tilapia, ngay cả ở nồng độ thấp. Điều này cho thấy rằng cần có các biện pháp để giảm thiểu ô nhiễm chì trong môi trường nước để bảo vệ sức khỏe của các sinh vật thủy sinh và đảm bảo an toàn thực phẩm cho con người. Cá có thể được sử dụng như biomarker ô nhiễm chì ở cá Tilapia.

4.1. Sử Dụng Histopathology Cá Làm Chỉ Thị Sinh Học Ô Nhiễm

Histopathology cá có thể được sử dụng như một dấu ấn sinh học ô nhiễm chì hiệu quả. Những thay đổi về cấu trúc tế bào ở các cơ quan của cá có thể phản ánh mức độ phơi nhiễm với chì và mức độ tổn thương mà chì gây ra. Việc sử dụng histopathology có thể giúp các nhà khoa học và nhà quản lý môi trường đánh giá mức độ ô nhiễm chì trong môi trường nước và đưa ra các biện pháp bảo vệ phù hợp.

4.2. Phương Pháp Giảm Thiểu Ô Nhiễm Chì Trong Nuôi Trồng Thủy Sản

Có nhiều phương pháp giảm thiểu ô nhiễm chì trong nuôi trồng thủy sản, bao gồm kiểm soát nguồn gây ô nhiễm, xử lý nước thải và sử dụng các biện pháp sinh học để loại bỏ chì khỏi môi trường nước. Việc áp dụng các phương pháp này có thể giúp giảm thiểu tác động tiêu cực của ô nhiễm chì đối với sức khỏe của cá và đảm bảo an toàn thực phẩm cho con người.

V. Kết Luận Tác Động Độc Hại Chì II Nitrate Và Hướng Nghiên Cứu

Nghiên cứu này đã chứng minh rằng chì (II)-nitrate có tác động độc hại đến cá Tilapia, gây ra những tổn thương histopathological đáng kể cho các cơ quan quan trọng. Kết quả này nhấn mạnh tầm quan trọng của việc kiểm soát ô nhiễm chì trong môi trường nước để bảo vệ sức khỏe của các sinh vật thủy sinh và đảm bảo an toàn thực phẩm cho con người. Các nghiên cứu trong tương lai nên tập trung vào việc đánh giá tác động của chì (II)-nitrate lên các loài cá khác và tìm kiếm các phương pháp hiệu quả để giảm thiểu ô nhiễm chì trong môi trường nước.

5.1. So Sánh Độc Tính Của Các Hợp Chất Chì Khác Nhau

Các nghiên cứu trong tương lai nên so sánh độc tính của các hợp chất chì khác nhau đối với cá. Điều này có thể giúp xác định các hợp chất chì nào gây ra tác động độc hại nhất và đưa ra các biện pháp kiểm soát phù hợp. Ví dụ, so sánh độc tính cấp tính và mãn tính của chì đối với cá Tilapia.

5.2. Nghiên Cứu Ảnh Hưởng Của Chì Lên Sinh Trưởng Và Sinh Sản Cá

Các nghiên cứu trong tương lai nên tập trung vào việc đánh giá ảnh hưởng của chì lên sinh trưởng và sinh sản của cá Tilapia. Chì có thể ảnh hưởng đến khả năng sinh sản của cá, dẫn đến giảm số lượng cá thể và ảnh hưởng đến quần thể cá. Việc hiểu rõ tác động của chì lên sinh trưởng và sinh sản của cá là rất quan trọng để bảo vệ các quần thể cá trong môi trường bị ô nhiễm.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Sự ô nhiễm kim loại nặng trong các thủy vực tự nhiên là một trong những thách thức môi trường nghiêm trọng toàn cầu, đặc biệt tại các quốc gia đang phát triển nơi tốc độ công nghiệp hóa, đô thị hóa và thâm canh nông nghiệp diễn ra nhanh chóng. Kim loại nặng từ nước thải công nghiệp, sinh hoạt và dòng chảy tràn nông nghiệp khi xâm nhập vào môi trường nước không chỉ gây suy thoái hệ sinh thái thủy sinh mà còn tích tụ sinh học và khuếch đại sinh học (biomagnification) qua chuỗi thức ăn, đe dọa trực tiếp đến an toàn thực phẩm và sức khỏe con người. Trong số các chất ô nhiễm độc hại, chì ($\text{Pb}$) và hợp chất Chì(II) nitrat ($\text{Pb(NO}_3\text{)}_2$) có độ bền vững cao, tồn lưu từ 100 đến 1.000 năm trong hệ thống thủy sinh và gây ra những tổn thương nghiêm trọng lên hệ thần kinh, hệ bài tiết, hệ sinh sản cũng như chức năng tế bào máu của sinh vật.

Cá là nguồn cung cấp protein chủ yếu cho con người và đóng vai trò sinh vật chỉ thị sinh học (bio-indicator) nhạy cảm để theo dõi ô nhiễm môi trường nước. Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Mendoza, Jimlea Nadezhda A. thực hiện nghiên cứu đánh giá tác động độc học và phản ứng mô bệnh học của cá rô phi (Oreochromis niloticus) khi bị phơi nhiễm Chì(II) nitrat trong điều kiện phòng thí nghiệm.

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài gồm:

1. Đánh giá tác động độc học của hợp chất $\text{Pb(NO}_3\text{)}_2$ lên cá rô phi (Oreochromis niloticus).
2. Xác định các biến đổi mô bệnh học trên bốn cơ quan đích gồm mang (gills), tim (heart), gan (liver) và cơ lưng (dorsal muscles) dưới các nồng độ phơi nhiễm khác nhau.

Đề tài đặt ra 4 câu hỏi nghiên cứu:

1. Hợp chất $\text{Pb(NO}_3\text{)}_2$ tác động như thế nào đến mô mang của cá rô phi?
2. Hợp chất $\text{Pb(NO}_3\text{)}_2$ tác động như thế nào đến mô gan của cá rô phi?
3. Hợp chất $\text{Pb(NO}_3\text{)}_2$ tác động như thế nào đến mô tim của cá rô phi?
4. Hợp chất $\text{Pb(NO}_3\text{)}_2$ tác động như thế nào đến mô cơ lưng của cá rô phi?

Tương ứng với các câu hỏi là 4 cặp giả thuyết kiểm định ($H_0$ và $H_A$) đối với từng cơ quan: giả thuyết không ($H_0$) cho rằng phơi nhiễm $\text{Pb(NO}_3\text{)}_2$ không gây ra biến đổi mô bệnh học, và giả thuyết đối ($H_A$) cho rằng phơi nhiễm $\text{Pb(NO}_3\text{)}_2$ dẫn đến sự thay đổi cấu trúc mô của cơ quan khảo sát.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Cá rô phi sông Nile (Oreochromis niloticus, Linnaeus 1758) và hóa chất Chì(II) nitrat ($\text{Pb(NO}_3\text{)}_2$).
• Phạm vi không gian: Thí nghiệm độc học được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Nuôi trồng Thủy sản, Khoa Nông nghiệp, Đại học Sriwijaya; phân tích mô bệnh học được tiến hành tại Bộ môn Giải phẫu bệnh, Khoa Y, Đại học Sriwijaya / Bệnh viện Đa khoa Dr. Mohammad Hoesin (Palembang, Indonesia).
• Phạm vi thời gian: Nghiên cứu thực nghiệm diễn ra trong 2 tháng (từ tháng 3/2016 đến tháng 4/2016); khóa luận hoàn thành và nộp vào tháng 9/2016.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Cơ sở lý thuyết và độc chất học chì

Nghiên cứu dựa trên nguyên lý độc chất học môi trường và kỹ thuật mô bệnh học như một dấu ấn sinh học (biomarker) nhạy cảm nhằm phát hiện sớm các tổn thương tế bào trước khi các triệu chứng nhiễm độc lâm sàng xuất hiện trên quy mô quần thể.

Chất thử nghiệm là Chì(II) nitrat ($\text{Pb(NO}_3\text{)}_2$), một tinh thể màu trắng có các đặc tính hóa lý sau:

Thuộc tính hóa lý	Giá trị / Đặc điểm
Danh pháp hóa học	Lead(II) nitrate / Plumbous nitrate
Công thức phân tử	$\text{Pb(NO}_3\text{)}_2$
Mã số CAS	10099-74-8
Khối lượng phân tử	331,53 g/mol
Điểm nóng chảy	470 °C (878 °F)
Độ tan trong nước	37,65 g/100 mL (0°C); 52 g/100 mL (20°C); 127 g/100 mL (100°C)
Độ tan trong dung môi khác	Không tan trong axit nitric; tan 0,04 g/100 mL (ethanol); 1,3 g/100 mL (methanol)
Áp suất hơi	Không đáng kể (Negligible)
Độ pH	3 - 4 (dung dịch nước 20%)

Về cơ chế phơi nhiễm, chì xâm nhập vào cơ thể cá chủ yếu qua hai con đường: hấp thu trực tiếp qua biểu mô mang/da và qua đường tiêu hóa (nước và thức ăn). Sau khi liên kết với lớp chất nhầy bề mặt, ion chì xâm nhập vào máu và phân bố đến các cơ quan chuyển hóa hoặc cơ quan dự trữ (gan, cơ, xương, tim). Khi hàm lượng chì vượt ngưỡng chịu đựng, nó gây rối loạn điều hòa thẩm thấu, ức chế enzyme, mất cân bằng oxy hóa và phá hủy cấu trúc tế bào.

Phương pháp nghiên cứu và quy trình thực nghiệm

Nghiên cứu sử dụng phương pháp thực nghiệm có đối chứng kết hợp kỹ thuật cắt lát mô học và nhuộm Hematoxylin & Eosin (H&E):

1. Bố trí thí nghiệm độc học: Tổng cộng 6 cá thể cá rô phi được chọn ngẫu nhiên, phân chia vào 3 bể chứa (mỗi bể chứa 10 lít nước và 2 con cá), bao gồm 1 lô đối chứng (0,0 mg/L $\text{Pb(NO}_3\text{)}_2$) và 2 lô xử lý ở các nồng độ 0,2 mg/L và 1,0 mg/L $\text{Pb(NO}_3\text{)}_2$, mỗi nồng độ có 2 lần lặp lại. Thời gian phơi nhiễm kéo dài 48 giờ (2 ngày) trong điều kiện không cho cá ăn.
2. Thu mẫu và cố định mô: Cá sau phơi nhiễm được mổ giải phẫu để bóc tách 4 cơ quan đích (mang, tim, cơ lưng, gan). Các mẫu mô được đặt vào cassette và cố định ngay trong dung dịch formaldehyde đệm trung tính 10% (pH 7,0) với thể tích gấp 10-20 lần thể tích mô, thời gian cố định trên 24 giờ.
3. Xử lý mô (Tissue Processing): Thực hiện tự động bằng máy xử lý mô (Histokinet/Automatic tissue processor) qua các giai đoạn:
   • Khử nước (Dehydration): Ngâm rửa qua chuỗi cồn ethanol tăng dần (1 giờ cho mỗi nồng độ).
   • Làm trong (Clearing): Ngâm trong xylen trong 1 giờ.
   • Ngấm sáp (Impregnation): Ngâm trong parafin nóng chảy ở nhiệt độ 54-60°C (thể tích sáp gấp 25-30 lần mẫu mô) trong khoảng 4 giờ.
   • Đúc khối (Embedding): Đúc mẫu trong khuôn chứa parafin nóng chảy ở 60-62°C, sau đó làm lạnh nhanh trong nước lạnh.
4. Cắt lát (Sectioning): Cắt tiêu bản mỏng 5 µm bằng máy cắt vi thể (Shandon Finesse 325 microtome). Lát cắt được trải trên bể nước ấm (~45°C), vớt lên lam kính có phủ lòng trắng trứng Mayer (Mayer's egg albumin), sau đó sấy khô trên bàn ấm (Slide Warmer LAB Line Barnstead 26025) ở 50°C trong 30 phút.
5. Kỹ thuật nhuộm H&E:
   • Tẩy sáp và hồi nước qua xylen và chuỗi cồn giảm dần (95%, 90%, 80%, 70%, 50%, 30%, mỗi bước 5 phút), rửa nước chảy 5 phút.
   • Nhuộm nhân tế bào bằng dung dịch Hematoxylin trong 10 phút, rửa nước chảy 10 phút.
   • Nhuộm bào tương bằng dung dịch Eosin từ 15 giây đến 5 phút.
   • Khử nước lại qua chuỗi cồn tăng dần (30% đến 100%), ngâm acetone (2 lần x 3 phút), làm trong bằng xylen (2 lần x 3 phút).
   • Gắn lá kính (coverslip) bằng chất gắn DPX (Dibutyl Phthalate Xylene) và để khô qua đêm.
6. Quan sát và chụp ảnh: Tiêu bản được soi dưới kính hiển vi quang học OLYMPUS BX51 có gắn camera ở các độ phóng đại 40x, 100x, 200x và 400x. Nhân tế bào bắt màu xanh lam và tế bào chất bắt màu hồng.

Nội dung chính theo từng chương

Phần I: Đặt vấn đề và Tổng quan tài liệu (Background and rationale)

Chương này phân tích tính cấp thiết của vấn đề ô nhiễm kim loại nặng trong nuôi trồng thủy sản và quản lý nguồn nước. Tác giả tổng quan chi tiết các nghiên cứu trước đây về:

• Độc tính của chì đối với hệ thần kinh trung ương (CNS), hành vi bơi lội và chức năng điều hòa áp suất thẩm thấu của cá.
• Các con đường phơi nhiễm chính của chì gồm đường tiêu hóa (thức ăn, nước uống), hô hấp qua mang, hấp thu qua da và phơi nhiễm nội sinh (giải phóng từ mô khoáng hóa như xương, răng khi thiếu hụt canxi).
• Tổng quan biến đổi mô bệnh học từ các nghiên cứu trên các loài cá khác: thoái hóa mang ở Cirrhinus mrigala, tích lũy chì ở Catla catla, teo cầu thận và hoại tử gan ở Carassius auratus gibelio, thoái hóa không bào gan ở Channa striatus.
• Phân loại học và đặc tính sinh học của loài cá rô phi (Oreochromis niloticus).

Phần II: Vật liệu và Phương pháp nghiên cứu (Materials and Methods)

Chương này mô tả chi tiết toàn bộ điều kiện thí nghiệm, danh mục hóa chất, dụng cụ phòng thí nghiệm và máy móc chuyên dụng (OLYMPUS BX51, Shandon Finesse 325, LAB Line Barnstead 26025). Tác giả trình bày chuẩn hóa quy trình 6 bước chuẩn bị tiêu bản giải phẫu bệnh từ khâu cố định mẫu, xử lý mô tự động, đúc khối parafin, cắt lát 5 µm, nhuộm kép H&E đến cố định tiêu bản bằng DPX.

Phần III: Thảo luận và Kết luận (Discussion and Conclusion)

Chương này đối chiếu các phát hiện thực nghiệm với các công trình công bố quốc tế:

• Biến đổi hành vi: Cá ở lô xử lý xuất hiện hiện tượng vận động chậm chạp (slowness of motion), thường xuyên ngoi lên mặt nước (surfacing activity) và tăng tiết chất nhầy bao phủ cơ thể sau 24-48 giờ. Tác giả giải thích sự tăng tiết nhầy là phản ứng thích nghi/tự vệ nhằm ngăn chặn sự hấp thu kim loại qua bề mặt cơ thể, đồng thời chịu sự kích thích của trục nội tiết/tuyến yên dưới áp lực độc chất.
• Cơ chế tổn thương mô học:
  • Ở mang: Sự nâng biểu mô (epithelial lifting) và tăng sinh tế bào là cơ chế phòng vệ nhằm kéo dài khoảng cách khuếch tán từ môi trường nước vào máu; tuy nhiên, hoại tử và dính phiến mang thứ cấp làm suy giảm nghiêm trọng khả năng trao đổi khí và cân bằng ion.
  • Ở tim: Sự phân tách sợi cơ và teo cơ tim có liên quan đến việc tích tụ canxi quá mức hoặc tăng giải phóng catecholamine khi kim loại theo tuần hoàn máu tấn công mô cơ tim.
  • Ở cơ lưng: Sự phân tách bó cơ và thoái hóa sợi cơ dẫn đến tích tụ axit lactic và gây mỏi cơ, phù hợp với triệu chứng bơi lội kém.
  • Ở gan: Sự giãn nở xoang mạch (sinusoidal dilatation) và tắc nghẽn tĩnh mạch trung tâm là phản ứng khi lưu lượng máu dồn về gan lớn để giải độc; sự xâm nhập của bạch cầu phản ánh phản ứng viêm cấp tính; hoại tử tế bào gan xảy ra khi protein liên kết kim loại (metallothionein) bị quá tải.

Kết quả và đóng góp

Kết quả mô bệnh học chi tiết trên 4 cơ quan đích

Kết quả quan sát dưới kính hiển vi quang học cho thấy mức độ tổn thương mô học tỷ lệ thuận trực tiếp với nồng độ phơi nhiễm $\text{Pb(NO}_3\text{)}_2$:

Cơ quan	Lô đối chứng (0,0 ppm)	Lô phơi nhiễm 0,2 ppm $\text{Pb(NO}_3\text{)}_2$	Lô phơi nhiễm 1,0 ppm $\text{Pb(NO}_3\text{)}_2$
Mang (Gills)	Cấu trúc phiến mang nguyên vẹn; phiến mang sơ cấp (PL) và thứ cấp (SL) rõ nét; tế bào biểu mô (EC) và tế bào tiết nhầy (MC) phân bố bình thường.	Bắt đầu thoái hóa và phân rã phiến mang thứ cấp; teo nhỏ, uốn cong và co ngắn phiến mang thứ cấp.	Viêm sưng phù nề (swelling/inflammation), bong tróc biểu mô (desquamation), nâng lớp biểu mô (epithelial lifting), biến dạng uốn cong gập phiến mang và hoại tử biểu mô (necrosis).
Tim (Heart)	Cơ tim (cm) có cấu trúc sợi bình thường; nhân tế bào cơ tim phân bố đồng đều gần trung tâm.	Xuất hiện hiện tượng teo cơ tim nhẹ và phân tách các sợi cơ tim (splitting of muscle fibers) cục bộ ở vùng ngoại vi.	Teo cơ tim nghiêm trọng trên diện rộng; phân tách rõ rệt giữa các bó cơ tim; giảm đường kính sợi cơ tim; xuất hiện các ổ hoại tử.
Cơ lưng (Dorsal muscles)	Các bó sợi cơ (mf) và mô liên kết đệm (stroma) xếp chặt chẽ, không có tổn thương bệnh lý.	Teo cơ cục bộ; xuất hiện sự phân tách sợi cơ ở phạm vi hẹp.	Phân tách nghiêm trọng các bó sợi cơ; giảm mạnh đường kính sợi cơ; hoại tử mô cơ (necrotic damage) và thoái hóa sợi cơ (degradation of muscle fibers) lan rộng.
Gan (Liver)	Tế bào gan (H) dạng dây đồng nhất quanh tĩnh mạch trung tâm (cv); hệ thống xoang mạch (s) thông thoáng chứa hồng cầu.	Teo nhẹ tế bào gan dẫn đến hoại tử sớm; xuất hiện thâm nhiễm bạch cầu nhẹ ở vùng ngoại vi.	Giãn nở xoang mạch diện rộng (sinusoidal dilatation); thâm nhiễm bạch cầu dày đặc (leukocyte infiltration) ở cả tĩnh mạch trung tâm lẫn vùng ngoại vi; hoại tử tế bào gan từng ổ (foci of necrosis) và cấu trúc bè gan bị xáo trộn hoàn toàn.

Đóng góp của nghiên cứu

1. Cung cấp dữ liệu thực nghiệm chuẩn hóa: Xác lập bộ dữ liệu mô bệnh học chi tiết có hình ảnh đối chứng trực quan trên 4 cơ quan đích của cá rô phi phơi nhiễm Chì(II) nitrat ở nồng độ thấp (0,2 - 1,0 ppm).
2. Khẳng định giá trị của dấu ấn sinh học: Chứng minh phân tích mô bệnh học là công cụ nhạy bén, đáng tin cậy để đánh giá độc tính kim loại nặng trước khi xuất hiện tỷ lệ tử vong hàng loạt.
3. Cơ sở khoa học cho quản lý: Cung cấp dẫn chứng thực nghiệm cho các nhà quản lý môi trường trong việc thiết lập quy chuẩn kiểm soát nước thải công nghiệp và bảo vệ nguồn lợi thủy sản.

Khuyến nghị từ tác giả

• Tăng cường kiểm soát và xử lý triệt để nước thải chứa kim loại nặng từ nguồn công nghiệp, nông nghiệp và sinh hoạt trước khi xả ra thủy vực.
• Đầu tư nghiên cứu phát triển các công nghệ xử lý chất thải kim loại nặng hiệu quả về mặt chi phí.
• Nghiên cứu chọn tạo các giống cá có khả năng kháng hoặc thích ứng với kim loại nặng trong tương lai.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế:
  • Quy mô mẫu nghiên cứu còn nhỏ (tổng số 6 cá thể cá rô phi, 2 cá thể/bể).
  • Thời gian phơi nhiễm thực nghiệm ngắn (48 giờ), chỉ phản ánh độc tính cấp tính, chưa khảo sát tác động phơi nhiễm mãn tính kéo dài.
  • Thí nghiệm khảo sát ở 2 dải nồng độ cố định (0,2 ppm và 1,0 ppm) mà chưa xác định giá trị $LC_{50}$ (96 giờ) cụ thể cho lô cá nghiên cứu.
  • Nghiên cứu tập trung vào quan sát định tính mô học, chưa tiến hành định lượng nồng độ tích lũy sinh học của ion $\text{Pb}^{2+}$ trong từng cơ quan bằng các phương pháp quang phổ (như AAS hoặc ICP-MS).
• Hướng nghiên cứu mở rộng: Khảo sát độc tính trường diễn ở dải nồng độ vết thấp hơn trong thời gian dài; kết hợp phân tích mô bệnh học với định lượng tích lũy kim loại trong mô cơ ăn được; đánh giá hoạt tính các enzyme chống oxy hóa (SOD, CAT) và biểu hiện của gen mã hóa protein metallothionein.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo có giá trị chuyên môn đối với:

• Sinh viên, học viên cao học ngành Khoa học Môi trường, Quản lý Môi trường, Độc học Môi trường và Nuôi trồng Thủy sản đang thực hiện các đề tài về độc học kim loại nặng trên động vật thủy sinh.
• Cán bộ nghiên cứu chuyên ngành Giải phẫu bệnh học động vật: tham khảo quy trình xử lý mô tự động, kỹ thuật cắt lát vi thể 5 µm và phương pháp nhuộm H&E trên các mẫu mô cá (đặc biệt là mô mang và mô gan).
• Cơ quan quản lý chất lượng môi trường nước: sử dụng các biến đổi mô học của cá rô phi làm cơ sở xây dựng chỉ thị sinh học giám sát ô nhiễm nước mặt.

Câu hỏi thường gặp

1. Khóa luận sử dụng loài sinh vật nào và thử nghiệm ở các nồng độ $\text{Pb(NO}_3\text{)}_2$ nào?

Khóa luận sử dụng cá rô phi sông Nile (Oreochromis niloticus). Thí nghiệm phơi nhiễm được tiến hành ở 3 nồng độ trong điều kiện phòng thí nghiệm: lô đối chứng (0,0 mg/L hay 0 ppm), lô 0,2 mg/L (0,2 ppm) và lô 1,0 mg/L (1,0 ppm) $\text{Pb(NO}_3\text{)}_2$, thời gian phơi nhiễm là 48 giờ.

2. Các biến đổi mô bệnh học điển hình quan sát được trên mang cá rô phi là gì?

Ở nồng độ 0,2 ppm, mang cá xuất hiện hiện tượng phân rã, teo nhỏ, uốn cong và co ngắn phiến mang thứ cấp. Khi nồng độ tăng lên 1,0 ppm, mang bị viêm sưng phù nề, bong tróc biểu mô, nâng lớp biểu mô tách khỏi mô nâng đỡ, biến dạng uốn cong gập phiến mang và hoại tử tế bào biểu mô.

3. Phản ứng mô học của gan cá thay đổi như thế nào khi nồng độ chì nitrat tăng từ 0,2 ppm lên 1,0 ppm?

Ở mức 0,2 ppm, gan chỉ bị teo nhẹ tế bào gan (giai đoạn tiền hoại tử) và thâm nhiễm bạch cầu nhẹ ở vùng ngoại vi. Ở mức 1,0 ppm, gan bị tổn thương nghiêm trọng với hiện tượng giãn nở xoang mạch máu diện rộng, thâm nhiễm bạch cầu dày đặc ở cả tĩnh mạch trung tâm lẫn vùng ngoại vi, và xuất hiện nhiều ổ hoại tử tế bào gan làm xáo trộn hoàn toàn cấu trúc bè gan.

4. Tại sao cơ lưng và cơ tim của cá lại xuất hiện hiện tượng phân tách sợi cơ (splitting of muscle fibers)?

Sự phân tách sợi cơ là hậu quả của hiện tượng teo cơ (atrophy) do độc tính của chì khi xâm nhập qua hệ tuần hoàn vào mô cơ. Ở tim, chì kích thích tích tụ canxi quá mức hoặc tăng tiết catecholamine gây phá hủy cấu trúc sợi. Ở cơ lưng, sự kích thích độc chất gây co cứng, giải phóng nhiều axit lactic dẫn đến mỏi cơ, teo cơ và thoái hóa hoại tử các bó cơ.

5. Quy trình kỹ thuật nhuộm mô trong nghiên cứu sử dụng hóa chất và thông số nào?

Quy trình sử dụng kỹ thuật nhuộm kép Hematoxylin và Eosin (H&E). Mô được cố định trong formalin đệm trung tính 10% (pH 7,0), khử nước qua cồn, đúc khối parafin ở 60-62°C, cắt lát mỏng 5 µm, nhuộm nhân bằng Hematoxylin trong 10 phút (bắt màu xanh lam), nhuộm bào tương bằng Eosin từ 15 giây đến 5 phút (bắt màu hồng), làm trong bằng xylen và gắn tiêu bản bằng chất gắn DPX.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của Mendoza, Jimlea Nadezhda A. đã chứng minh thực nghiệm rằng Chì(II) nitrat ($\text{Pb(NO}_3\text{)}_2$) ở các nồng độ 0,2 ppm và 1,0 ppm gây ra những biến đổi hành vi bất thường và tổn thương mô bệnh học nghiêm trọng trên mang, tim, cơ lưng và gan của cá rô phi (Oreochromis niloticus). Mức độ phá hủy cấu trúc tế bào, từ thoái hóa biểu mô, giãn nở xoang mạch đến hoại tử mô, tỷ lệ thuận với nồng độ phơi nhiễm kim loại nặng. Công trình khẳng định giá trị thực tiễn của việc sử dụng cá rô phi và các chỉ thị mô bệnh học trong việc quan trắc, cảnh báo sớm ô nhiễm độc học môi trường nước.

Trích đoạn nội dung tài liệu

THAI NGUYEN UNIVERSITY UNIVERSITY OF AGRICULTURE AND FORESTRY MENDOZA, JIMLEA NADEZHDA A. TOXICOLOGICAL IMPACT AND HISTOPATHOLOGICAL RESPONSE OF TILAPIA AFTER LEAD (II)-NITRATE (Pb (NO3)2) CONTAMINATION BACHELOR THESIS Study Mode: Full-time Major : Environmental Science and Management Faculty : International Training and Development Center Batch : 2012-2016 Thai Nguyen, September 2016 i DOCUMENTATION PAGE WITH ABSTRACT Thai Nguyen University of Agriculture and Forestry Degree Program : Bachelor of Environmental Science and Management Student name : Mendoza, Jimlea Nadezhda A. Student ID : DTN1353110555 Thesis Title : TOXICOLOGICAL IMPACT AND HISTOPATHOLOGICAL RESPONSE OF TILAPIA AFTER LEAD (II)-NITRATE (Pb(NO3)2) CONTAMINATION Supervisor (s): Krisna MURTI, MD. Duong Van Thao, Ph.

Abstract: To investigate the effects of environmental contaminants, histopathological response of fish exposed to pollutants have been used as sensitive biomarkers. The present study was conducted to assess the histopathological alterations in the gills, heart, dorsal muscles and liver of tilapia Oreochromis niloticus which were kept in aqueous solution of lead nitrate of two concentrations of 0.0 mg/l for 2 days under laboratory conditions. The resultant histopathological changes in the gills, heart, dorsal muscles and liver were recorded by light microscope. The observed changes in the treated groups were disintegration of secondary lamellae, atrophy, curling and shortening of secondary lamellae, swelling/ inflammation, desquamation, epithelial lifting, curling bend of secondary lamellae and necrosis in gills.

Atrophy and splitting i of muscle fibers are recognized as common changes recorded in the heart of experimental fish. Atrophy in dorsal muscles and splitting of dorsal muscle fibers, necrotic damage and degradation of muscle fibers were an interesting observation in dorsal muscle tissue of experimental fish. Examination of liver sections after exposure showed sinusoidal dilatation and leukocyte infiltration in central veins and in peripheral areas occurred after exposure. The damages in histology of gills, heart, dorsal muscles and liver depend on the exposure concentrations tolead (II)-nitrate (Pb (NO3)2).

As the exposure concentrations increased, the more adverse damage occurred in the organs. Therefore, the present investigation gives a brief account of the toxic effects of heavy metals on fish. The present review illustrates that these histopathological alterations would contribute an important role in assessing the harmful effects of lead nitrate. As such, fish are used as bio-indicators, providing useful purpose in monitoring heavy metals contamination.

Hence, implementation of regulations regarding the conservation of aquatic environments must be taken into consideration. Keywords: LEAD (II)-NITRATE (Pb (NO3)2), histopathology, Oreochromis niloticus. Number of Pages: 56 Date of Submission: September, 2016 Supervisor’s signature ii ACKNOWLEDGEMENT From bottom of my heart, I would like to express my deepest appreciation to all those who provided me the opportunity to complete this research. First and foremost, I would like to express my sincere gratitude and deep regards to my supervisors: Dr.

Arinafril of Sriwijaya University, Indralaya, Indonesia and Krisna MURTI, MD. in the Department of Anatomical Pathology, Faculty of Medicine, Sriwijaya University/Dr. Mohammad Hoesin Public Hospital who kindly assisted me with the histopathological detection in this dissertation and was very patient with my knowledge gaps and in guiding me wholeheartedly when I implemented this research. I also want to express my thanks to Dr.

Duong Van Thao, the second supervisor, for his supervision, encouragement, advice, and guidance in writing this thesis. Besides my supervisors, I would like to thank Ms. Fadila Mutmainnah from Pascasarjana Program Sriwijaya University, Ms. Mirna Fitrani, Ms.

Sefti Heza Dwinanti and Ms. Ade Dwi Sasanti of Aquaculture Laboratory, Faculty of Agriculture, Sriwijaya University, Dr. Imelda Mendoza Moreno, Mrs. Aimee Ciriaco from Laguna State Polytechnic University, Siniloan Campus, Siniloan Laguna for providing me an additional knowledge about Lead nitrate, water quality and fish histology.

In addition, formal thanks should be offered to the Rector of Sriwijaya University, Prof. Badia Perizade, for granting my internship acceptance. iii I would also like to acknowledge with much appreciation to the Dean of Faculty of Medicine in Sriwijaya University, Dr., who gave the permission to use all required equipment and the necessary materials to conduct my research in Department of Anatomical Pathology, Faculty of Medicine, Sriwijaya University/Dr. Mohammad Hoesin Public Hospital.

Special thanks to Mrs. Ana Nyayu, Mr. Mohammad Zainuri, and other staffs and students in Aquaculture Laboratory, Faculty of Agriculture, Sriwijaya University for helping and providing me necessary equipment as well as knowledge for fish anatomy. I wish to thank the technicians who work in Department of Anatomical Pathology, Faculty of Medicine, Sriwijaya University/Dr.

Mohammad Hoesin Public Hospital for their help in tissue preparation namely: Mrs. Fitri Faurianty and Madi Santoso, without them, this research could not be accomplished on time. My sincere thanks also go to Duong Hong Ngoc, Keraia Vince Geronimo, Phonevilay Soukhy, Tran Cong Phong, Nguyen Thi Van and Do Manh Dung, Jose Alberto Dunca for helping me finish this study. Of course, I would like to thank to my Indonesian friends – Rotua Febriani, Hendra Edison and others for their invaluable support and encouragement when I stayed in Palembang.

Finally, special thanks to my family, my friends for their love and moral support throughout my study. Thai Nguyen, 20th September, 2016 Student Mendoza, Jimlea Nadezhda A. iv Table of Contents LIST OF FIGURES. 1 LIST OF TABLES.

Background and rationale. Research questions and hypotheses. Lead Compound- Lead (II) Nitrate. Toxic effects of Lead on organisms.

Test species -Oreochromis niloticus. MATERIALS AND METHODS. Time and Place. Histopathological observation of gills.

Histopathological observations of heart. Histopathological observations of Dorsal muscle. Histopathological observations of liver. DISCUSSION AND CONCLUSION.

43 vi LIST OF FIGURES Figure 1. Normal histological structure of gills. Comparison of the normal and treated gills. Histopathological changes observed in heart of experimental fish.

Comparison of the normal and treated dorsal muscle. Comparison the normal and treated liver. Comparison of the normal and treated liver. 1 LIST OF TABLES Table 1.Physical and Chemical of Lead (II) Nitrate material Table 2.

Important routes of exposure to lead 2 PART I. Background and rationale At present, the major challenge is to find ways to sustain activities, working procedures and management of industries towards economic development to promote human health and environmental protection. The vulnerability of aquatic ecosystems to heavy metal contamination has been recognized as a serious pollution problem. Metals that are deposited in the aquatic environment may accumulate in the food chain and cause ecological damage posing threat to human health and sustainable food supply due to biomagnifications over time.

The anthropogenic pollutants from industrial, domestic and agricultural waste are ultimately absorbed by aquatic plants and animals. Potential damage to ecosystem may originate from exposure to metal pollutants because of extent and location and current ecological services of the lake as well. These contaminants come sources such as from human activities that bring economic developments that deliver benefits to society (Molina, 2011). The heavy metal contamination of water bodies as one of the substantial environmental concerns was reported (Agrahari, 2009) and crucial harmful impacts on environmental quality, ecosystem integrity and health of humans have often been linked with improper management of chemical substances and the removal of hazardous materials.

Although some adverse health impacts of heavy metals have already been well known, heavy metal contamination is increasing in many parts of the world, mostly in developing countries, even though emissions have reduced in most developed countries over the last thousand decades (Järup, 2003). Bio-accumulation in various tissues of aquatic organisms and rising level of heavy metal toxicity poses serious threats to the 3 biodiversity of ecosystems and human health (Adeniyi et al., 2008; Vinodhini and Narayanan, 2008a; George et al. Fishes have been considered as good bio-accumulators of organic and inorganic toxicants. Fishes are primary sources of protein.

They comprise large components of most aquatic environment functioning as bio-indicator of heavy metal contamination in the aquatic ecosystem.These days, a huge segment of the overall eating routine comprises of nourishments from fresh and salt water bodies. This utilization has had a positive effect on job and livelihood for example, in instances of fish production and every year a huge assortment of goods made out of seafood items are becoming commercially available widely.Heavy metals concentrated in water systems and expand through food chain and aquatic organisms especially fishes and being the primary consumers, they are largely influenced. People on the other hand also are affected by eating fishes from those areas where main food is fish (Afshan et al. Terrestrial and aquatic food chains are suitable for accumulating numerous environmental pollutants up to levels that could be toxic to both anthropogenic and aquatic organisms’ health.

The pollution might cause adverse effects on the ecosystem such as the health of aquatic animals (Ashraj, 2005; Vosyliene and Jankaite, 2006; Farombi et al. Lead, like majority of the heavy metals are being discharged into surface waters affecting the health of aquatic organisms such as fishes.Generally, because of its low rate of 4 disposal, lead (Pb) is one of the most crucial toxins in our surroundings which accumulates in the body. As indicated by the results of past investigations, the present work was proposed to investigate the impact of lead nitrate on histological changes of the gills, heart, liver and dorsal muscle of the tilapia, Oreochromis niloticus. This study is an important tool that evaluates the impacts of human activities and weighs the adverse effects to health of the people amidst the contributions of developments economically.

This study aims to evaluate the toxic effects of heavy metals such as lead nitrate on the organs of Oreochromis niloticus (Tilapia) to support of predicting potential health consequences to the human and health of fish which could serve as a scientific basis for decisionmaking and policy development and be able to determine the need for urgent measurements which should be done by concerned authorities to protect health of communities consuming fish products. Objectives This study was designed to assess the toxicological effects of lead (II)-nitrate (Pb (NO3)2) on Oreochromis niloticus (Tilapia) as well as to reveal the histopathological alterations on its gills, heart, liver and dorsal muscle under different concentrations of lead (II)-nitrate (Pb (NO3)2). Research questions and hypotheses 1. Research Questions The research aims to answer the follow questions; - How does lead (II)-nitrate (Pb (NO3)2) affect the gills of Tilapia? 5 - How does lead (II)-nitrate (Pb (NO3)2) affect the liver of Tilapia? - How does lead (II)-nitrate (Pb (NO3)2) affect the heart of Tilapia? - How does lead (II)-nitrate (Pb (NO3)2) affect the dorsal muscle of Tilapia? 1.

Hypotheses Hypothesis 1: HO (Null Hypothesis): Exposure to lead (II)-nitrate (Pb (NO3)2) contamination will not result in changes in gills histology of Oreochromis niloticus. HA (Alternative Hypothesis): Exposure to lead (II)-nitrate (Pb (NO3)2) contamination will result in changes in gills histology of Oreochromis niloticus. Hypothesis 2: HO (Null Hypothesis): Exposure to lead (II)-nitrate (Pb (NO3)2) contamination will not result in changes in liver histology of Oreochromis niloticus. HA (Alternative Hypothesis): Exposure to lead (II)-nitrate (Pb (NO3)2) contamination will result in changes in liver histology of Oreochromis niloticus.

Hypothesis 3: HO: Exposure to lead (II)-nitrate (Pb (NO3)2) contamination will not result in changes in heart histology of Oreochromis niloticus. HA: Exposure to lead (II)-nitrate (Pb (NO3)2) contamination will result in changes in heart histology of Oreochromis niloticus. 6 Hypothesis 4: HO: Exposure to lead (II)-nitrate (Pb (NO3)2) contamination will not result in changes in dorsal muscle histology of Oreochromis niloticus. HA: Exposure to lead (II)-nitrate (Pb (NO3)2) contamination will result in changes in dorsal muscle histology of Oreochromis niloticus.

Lead Compound- Lead (II) Nitrate Table 1. Physical and Chemical of Lead (II) Nitrate material LEAD NITRATE; Lead dinitrate; Lead(II) nitrate; Plumbous nitrate; Lead nitrate (Pb(NO3)2) Chemical Name Product Names Lead(II) nitrate Molecular Formula HNO3.1 or N2O6Pb Chemical Formula Pb(NO₃)₂ Form White crystal discolored CAS Registry Number 10099-74-8 Molecular Weight 331.