Phương pháp định lượng chất kích thích tăng trưởng trong rau quả bằng sắc ký

Nghiên cứu phương pháp sàng lọc và định lượng chất kích thích tăng trưởng trong rau quả bằng sắc ký lỏng khối phổ để đảm bảo an toàn thực phẩm.

• Tác giả: Vũ Ngọc Tú
• Người hướng dẫn: TS. Trần Cao Sơn
• Trường học: Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Hóa phân tích
• Đề tài: Sàng lọc và Định lượng Đồng thời Một số Chất Kích thích Tăng trưởng Thực vật Tổng hợp trong Rau, Quả bằng Sắc ký Lỏng Khối Phổ
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Sàng lọc và định lượng chất kích thích tăng trưởng thực vật

Sàng lọc và định lượng chất kích thích tăng trưởng là các quy trình phân tích quan trọng trong kiểm soát chất lượng nông sản. Các chất kích thích tăng trưởng tổng hợp như Auxin, Cytokinin, và Gibberellin được sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp để tăng năng suất cây trồng. Tuy nhiên, việc lạm dụng các chất này có thể gây hại cho sức khỏe người tiêu dùng. Do đó, phát triển phương pháp sàng lọc định lượng chính xác trong rau, quả là cần thiết. Sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) là kỹ thuật tiên tiến cho phép phát hiện và định lượng đồng thời nhiều loại chất kích thích với độ nhạy cao.

1.1. Khái niệm chất kích thích tăng trưởng thực vật

Chất kích thích tăng trưởng là những hợp chất tổng hợp giúp điều hòa sinh trưởng của cây trồng. Các loại chính bao gồm Auxin tổng hợp, Cytokinin, và Gibberellin. Chúng được sử dụng để tăng kích thước quả, tạo hình thái đẹp, và cải thiện năng suất. Tuy nhiên, việc sử dụng quá mức có thể tích tụ độc chất trong thực phẩm, ảnh hưởng đến an toàn vệ sinh thực phẩm.

1.2. Tầm quan trọng của sàng lọc và định lượng

Sàng lọc giúp phát hiện sự hiện diện của chất kích thích tăng trưởng trong mẫu. Công việc này cần thiết để kiểm soát dư lượng hóa chất theo các quy định quốc tế. Định lượng chính xác cho phép xác định nồng độ chính xác, so sánh với giới hạn an toàn được quy định. Kỹ thuật LC-MS/MS mang lại độ chuyên sâu cao, giảm thiểu dương tính giả.

II. Phương pháp phân tích bằng sắc ký lỏng khối phổ

Sắc ký lỏng khối phổ là công nghệ tiên tiến để sàng lọc và định lượng chất kích thích trong rau, quả. Phương pháp này kết hợp tách chiết lỏng với phát hiện khối phổ, cho phép phát hiện đồng thời nhiều chất trong một lần phân tích. Quá trình bắt đầu từ xử lý mẫu, tiếp theo là chiết pha rắn phân tán (d-SPE) để loại bỏ tạp chất. Mẫu sau đó đưa qua cột làm sạch để tăng độ tinh khiết. Điều kiện MS/MS được tối ưu để đạt độ nhạy cao nhất, cho phép phát hiện nồng độ thấp của các chất kích thích tăng trưởng.

2.1. Xử lý mẫu và chiết chất

Xử lý mẫu là bước quan trọng quyết định độ chính xác của phân tích. Mẫu rau, quả được cắt nhỏ, đồng nhất, sau đó chiết bằng dung môi thích hợp. Phương pháp chiết siêu âm hoặc khuấy lắng được áp dụng để chiết đầy đủ chất kích thích. Dung dịch chiết sau đó qua lọc để loại bỏ hạt rắn. Quy trình này ảnh hưởng trực tiếp đến độ thu hồi của phương pháp.

2.2. Điều kiện phân tích LC MS MS tối ưu

Điều kiện MS/MS được tối ưu hóa để đạt độ nhạy cao. Các thông số như năng lượng va chạm (CE), điện áp ion được điều chỉnh cho từng chất. Pha động gradient được lập trình để phân tách hiệu quả. Giới hạn phát hiện đạt mức µg/kg, cho phép phát hiện dù nồng độ rất thấp trong thực phẩm tươi.

III. Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp

Xác nhận giá trị sử dụng là bước thiết yếu để đảm bảo độ tin cây của phương pháp phân tích. Phương pháp phải được đánh giá qua các tiêu chí: độ lặp lại, độ tái tạo lập, độ chính xác (thu hồi), giới hạn phát hiện và định lượng. Độ lặp lại được kiểm tra bằng cách phân tích cùng một mẫu nhiều lần. Đường chuẩn được xây dựng từ mẫu chuẩn ở các nồng độ khác nhau để xác định khoảng tuyến tính phù hợp. Thu hồi được kiểm tra bằng cách thêm chuẩn vào mẫu và so sánh nồng độ lý thuyết với kết quả thực. Những chỉ số này phải đáp ứng tiêu chuẩn AOAC để phương pháp được công nhận.

3.1. Độ lặp lại và độ chính xác của phương pháp

Độ lặp lại được xác định bằng hệ số biến thiên (RSD %) từ phân tích lặp lại. Kết quả tốt là RSD < 15%. Độ chính xác (thu hồi) được tính từ tỷ lệ nồng độ tìm được / nồng độ thêm vào × 100%. Thu hồi lý tưởng là 80-120%. Phương pháp với các chỉ số này được coi là đáng tin cây cho phân tích mẫu thực.

3.2. Giới hạn phát hiện và khoảng tuyến tính

Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ tối thiểu có thể phát hiện với tỷ lệ tín hiệu/nhiễu ≥ 3. Giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ tối thiểu có thể định lượng chính xác với S/N ≥ 10. Khoảng tuyến tính là dải nồng độ mà phương pháp duy trì mối quan hệ tuyến tính giữa nồng độ và tín hiệu phát hiện.

IV. Ứng dụng phân tích mẫu thực tế

Ứng dụng phân tích mẫu thực cho phép phát hiện chất kích thích tăng trưởng trong các loại rau, quả được tiêu thụ hàng ngày. Phương pháp sàng lọc được áp dụng đầu tiên để phát hiện sự hiện diện của chất kích thích tổng hợp. Các mẫu dương tính được định lượng để xác định nồng độ chính xác. Kết quả được so sánh với quy định của Thông tư 50/2016/TT-BYT của Bộ Y tế Việt Nam. Mẫu vượt giới hạn được báo cáo cho cơ quan quản lý để xử lý vi phạm. Dữ liệu từ nhiều mẫu khác nhau cho phép đánh giá tình hình lạm dụng chất kích thích trên thị trường, góp phần bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng.

4.1. Kết quả sàng lọc trên mẫu thực

Sàng lọc mẫu thực từ các chợ, siêu thị cho thấy tỷ lệ dương tính khá cao. Các chất kích thích được phát hiện phổ biến là 6-BAP, CPPU, GA3. Những mẫu dương tính thường là rau lá, quả mâm xôi, nho. Sàng lọc nhanh giúp lọc ra mẫu cần định lượng, tiết kiệm thời gian và chi phí phân tích.

4.2. Kết quả định lượng và đánh giá rủi ro

Định lượng chính xác cho phép xác định nồng độ từng chất kích thích trong mẫu. Một số mẫu được phát hiện vượt giới hạn quy định. Nồng độ cao của chất kích thích có thể gây ảnh hưởng sức khỏe nếu tiêu thụ lâu dài. Kết quả được ghi nhận, lưu trữ và báo cáo cho các cơ quan chức năng để thực hiện biện pháp kiểm soát.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1 - TỔNG QUAN 1. Tổng quan về các chất tăng trưởng thực vật 1. Khái quát về một số chất tăng trưởng thực vật Chất kích thích tăng trưởng là một trong hai nhóm chất điều hòa tăng trưởng thực vật. Các chất kích thích tăng trưởng thực vật bao gồm 3 nhóm: Auxins, Cytokinins và Gibberellins.

Chúng hoạt động làm thay đổi các quá trình sinh trưởng của cây (kích thích rễ, kéo dài thân, ngọn, làm nhanh sự hình thành lá, hoa và quả). Hiện nay, các nhóm chất kích thích tăng trưởng thực vật đang được sử dụng ở dạng tự nhiên và tổng hợp. Nhóm Auxin Auxins là nhóm chất kích thích tăng trưởng được phát hiện đầu tiên. Ngay từ những năm 1920, vai trò của Auxins đối với sự phát triển của thực vật đã được nghiên cứu và trình bày bởi nhà sinh học người Hà Lan Frits Warmolt Went.

Auxins trong tiếng Hy Lạp có nghĩa là sinh trưởng. Về cấu trúc, Auxins là các hợp chất dẫn xuất của tryptophan, có cấu trúc nhân indol. Ngày nay, Auxins được biết đến là chất kích thích tăng trưởng thực vật có ảnh hưởng lớn đến các quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào. Vì vậy, Auxins được sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp với các chức năng: kích thích dãn tế bào (kéo dài, phình to); điều chỉnh tính hướng của cây (hướng quang, hướng địa, hướng hoá, hướng thuỷ); điều chỉnh hiện tượng ưu thế ngọn (ngăn chặn sự phát triển của chồi bên); điều chỉnh sự hình thành rễ (nồng độ thấp kích thích sinh trưởng rễ, nồng độ cao ức chế sinh trưởng rễ); tạo quả không hạt; kìm hãm hoặc thúc đẩy sự rụng lá, hoa và quả; tăng tỷ lệ đậu quả và kéo dài thời gian chín của quả.

Sự vận chuyển của Auxins trong cây có tính chất phân cực rất nghiêm ngặt theo hướng gốc. Chính vì vậy càng xa đỉnh ngọn, hàm lượng auxin càng giảm dần. Ngoài đỉnh ngọn, Auxins còn được tổng hợp ở các cơ quan còn non khác như lá non, quả non, phôi hạt đang sinh trưởng, mô phân sinh tầng phát sinh. Quá trình tổng hợp Auxins xảy ra thường xuyên và mạnh mẽ ở trong cây dưới xúc tác của các enzyme đặc hiệu.

 Auxins tự nhiên 3 Trong tự nhiên, Auxins được tổng hợp ở tất cả các thực vật bậc cao, tảo, nấm và vi khuẩn. Một số Auxins tự nhiên được sử dụng phổ biến bao gồm: Indole-3-acetic acid (IAA), Indole-3-butyric acid (IBA), 4-chloro-indole-3-acetic acid (4-Cl-IAA), Phenyl acetic acid (PAA)…  Auxins tổng hợp Auxins được tổng hợp thường không ở dạng tự do, mà liên kết với một acid amin (acid aspartic ở Pisum, acid glutamic ở cây cà chua), hay glucid (AIA-glucoz, AIA-thioglucosid, AIA-inositol). Các dạng liên kết này không có hoạt tính Auxins nhưng dễ dàng phóng thích Auxins theo con đường enzym (bởi sự thuỷ phân trong môi trường), là các dạng dự trữ và vận chuyển của Auxins. Chúng không bị phá huỷ bởi AIA-oxidase.

Một số Auxin tổng hợp và vai trò của chúng đối với sự sinh trưởng của thực vật được đưa ra tại Bảng 1.1: Công thức cấu tạo, công dụng của một số Auxin tổng hợp Các loại Công thức thực vật STT Chất Công dụng cấu tạo thường sử dụng - Làm tăng sự hình thành bó sợi cellulose ở thực vật (sử dụng kết hợp với gibberellic Táo, oliu, 1-Naphthaleneacetic acid). 1 cam, khoai acid (1-NAA) - Kích thích sự hình tây,… thành rễ. - Chống rụng trái sớm và thưa trái. 4 Các loại Công thức thực vật STT Chất Công dụng cấu tạo thường sử dụng β-Naphthyloxyacetic Kích thích sự phát 2 Các loại cây acid (2-NOA) triển tế bào Ức chế nảy mầm, kéo Các loại củ Methyl dài thời gian ngủ (khoai tây, 3 khoai lang, 1-naphthaleneacetate cà rốt.) 2,4,5- Cảm ứng tạo mô sẹo 4 Trichlorophenoxyac và sự phát sinh của cây Các loại cây etic acid (2,4,5-T) một lá mầm Cảm ứng tạo mô sẹo 2,4- và huyền phù tế bào 5 Dichlorophenoxyace Các loại cây (kết hợp với tic acid (2,4-D) cytokinins) 4-Amino-3,5,6- Cảm ứng và duy trì mô Các cây lá 6 trichloropicolinic sẹo hoặc huyền phù tế rộng acid (Picloram) bào.

5 Các loại Công thức thực vật STT Chất Công dụng cấu tạo thường sử dụng 2-Methyl-4-chloro Kiểm soát sự phát triển Các cây lá 7 henoxyacetic acid của cỏ dại lá rộng. rộng (MCPA) - Giảm tỷ lệ rụng trái Các loại non, tăng đậu quả. cây ăn trái 4- - Tăng năng suất cây (dưa hấu, cà trồng. chua, cà tím, 8 Chlorophenoxyaceti ớt, bơ, quả c acid (4-CPA) - Tăng trổ bông (lúa).

có múi, nho, - Đồng đều quả (nho). Nhóm Cytokinins Cytokinins là nhóm kích thích tăng trưởng có chức năng kích thích sự phân chia tế bào của thực vật. Hiện nay, Cytokinins gồm hai loại là tự nhiên và nhân tạo [11, 59]. Về cấu trúc hóa học, Cytokinins gồm hai nhóm chất có công thức cấu tạo khác nhau.

Nhóm purine là những dẫn chất thế của adenine tại vị trí N6 (Kinetin, 6-BA…). Nhóm phenylurea được tìm ra sau này gồm có 1,3-diphenylurea, Forchlofenuron (CPP), Thidiazuron (TDZ)… Ở mức độ phân tử, Cytokinins ảnh hưởng lên hoạt động của tế bào thông qua việc thúc đẩy sự tổng hợp một số RNA qua đó tác động lên quá trình tổng hợp protein, hoạt hóa enzym. Ở mức độ tế bào, Cytokinins kích thích sự lớn lên và phân chia của tế bào, hoạt hóa hoặc ức chế một số giai đoạn quan trọng trong chu kì tế bào làm cho Cytokinins có những tác dụng lên mô cơ quan thực vật như: kích thích phát sinh chồi, ra hoa, phá bỏ trạng thái ngủ của hạt, kích thích mọc mầm, tăng kích thước quả, ức chế hình thành và phát triển rễ, làm chậm quá trình già hóa của lá và quả,…. Vì vậy, sử dụng Cytokinins, đặc biệt là loại tổng hợp để kích thích cây ra lá, hoa, tăng sản lượng 6 quả thu hoạch, ngâm bảo quản rau quả cho tác dụng rất mạnh.

Đặc biệt trong việc trồng giá đỗ, với mục đích làm giảm thời gian ngâm hạt và ủ mầm, tăng kích thước tạo ra cọng giá trắng, mập cọng, giảm thiểu ra rễ. Qúa trình hấp thu Cytokinins diễn ra rất nhanh ở hầu hết các loại mô thực vật, trong đó có hạt đậu xanh dùng làm giá đỗ, tốc độ và mức độ hấp thu cao nhất trong vòng 30 phút đến 1 giờ sau khi được sử dụng. Tốc độ chuyển hóa Cytokinins phụ thuộc vào enzym chuyển hóa trong tế bào mô và dạng tồn tại có hoạt tính của Cytokinins. Đối với các tế bào mô thuộc họ đậu, enzym chuyển hóa Cytokinins là cytokinine oxidase.

Chúng chuyển hóa các Cytokinins tự nhiên thành adenine, còn Cytokinins tổng hợp không phải là cơ chất của enzym này nên không chịu tác động trên [4].  Cytokinins tự nhiên Các chất Cytokinin tự nhiên có ở trong tất cả các loại thực vật khác nhau và là một nhóm phytohormone quan trọng ở trong cây. Một số Cytokinin phổ biến bao gồm: Kinetin (KIN), Zeatin (ZEA), 1,3-diphenylurea (DPU), 6-(3-methyl-2-butenyl) aminopurine (2-iP), Adenine (ADE), 3-Benzyladenine (3-BA), Dihydrozeatin Riboside,.  Cytokinin tổng hợp Một số hợp chất tổng hợp thuộc nhóm Cytokinin thường được sử dụng trong công tác nuôi cấy là: - Kinetin: 6-furfurylaminopurine hoặc N-(2-furanylmethyl)-1H-purine-6- amine - BAP (BA): 6-benzylaminopurine hoặc benzyladenine.

- TDZ: 1-phenyl-3-(1,2,3 thiadiazol-5-yl) Một số Cytokinin tổng hợp và vai trò của chúng đối với sự sinh trưởng của thực vật được đưa ra tại Bảng 1.2: Công thức cấu tạo, công dụng của một số Cytokinin tổng hợp S Bộ phận/loại Chất Công thức cấu tạo Công dụng TT cây tìm thấy 6-Benzylaminopurine 1 1 (6-BAP) Kích thích phát sinh chồi, ra hoa, phá bỏ trạng thái ngủ của hạt, kích thích mọc mầm, Forchlorfenuron 2 tăng kích thước Các loại cây 2 (CPPU) quả, ức chế hình thành và phát triển rễ, làm chậm quá trình già hóa của lá và Thidiazuron 3 quả,… (TDZ) 3 1. Độc tính của một số chất tăng trưởng thực vật Hiện nay, việc sử dụng bừa bãi chất kích thích tăng trưởng đặc biệt là loại tổng hợp sẽ làm cho các sản phẩm nông nghiệp chứa dư lượng chất kích thích, gây ảnh hưởng xấu tới sức khỏe con người và các loài sinh vật.  Nhóm Auxin  Độc tố cấp tính Theo Cơ quan Bảo vệ Môi trường Hoa Kỳ, độc tính của 2,4-D phụ thuộc vào các dạng hóa học của nó, bao gồm muối, este và dạng acid. 2,4-D thường có độc tính thấp đối với con người, ngoại trừ một số acid và muối nhất định có thể gây kích ứng 8 mắt.

Kể từ năm 2005, liều gây chết trung bình hoặc LD50 được xác định ở chuột nhiễm độc cấp tính nghiên cứu là 639 mg/kg.  Nguy cơ gây ung thư Trong một báo cáo trước năm 1987, Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Thế giới (IARC) đã phân loại một số Auxin bao gồm 2,4-D, MCPA, 2,4,5-T là các tác nhân gây ung thứ nhóm 2B – “có khả thăng gây ung thư cho người”. Trong khi đó, Cơ quan Bảo vệ môi trường Hoa Kỳ (EPA) không xếp chúng vào nhóm này. Cho đến tháng 6 năm 2015, IARC một lần nữa xác nhận 2,4-D là một tác nhân có thể gây ung thư.

Tuy nhiên, tháng 8 năm 2007, EPA đã đưa ra phán quyết rằng những dữ liệu hiện có không phản ánh bất cứ mối liên hệ nào giữa ung thư ở người và sự phơi nhiễm 2,4-D.  Chất gây ô nhiễm Tháng 7 năm 2013, một nghiên cứu trên tạp chí Four Corners chỉ rằng nồng độ dioxin tăng cao trong phiên bản chung của 2,4-D, một trong những loại thuốc diệt cỏ được sử dụng rộng rãi nhất ở Úc. Một nhà khoa học đã cho biết sản phẩm được thử nghiệm bởi Four Corners, được nhập khẩu từ Trung Quốc, có "một trong những chỉ số dioxin cao nhất đối với 2,4-D trong 10 đến 20 năm qua và có thể gây ra những rủi ro sức khỏe tiềm ẩn [11].  Nhóm Cytokinin Trong nông nghiệp, phơi nhiễm Cytokinins cũng gây độc cũng tương tự như hóa chất bảo vệ thực vật.

Các báo cáo của Cục Bảo vệ Môi trường Hoa Kỳ (US EPA- United States Environmental Protection Agency) công bố về độc tính cấp của Cytokinins thường là gây ngộ độc khi nuốt phải, kích ứng da và mắt ở mức độ vừa, đặc biệt gây kích ứng hô hấp và tăng nguy cơ viêm phổi ở những người hay tiếp xúc với thuốc. Ngoài ra, nhiễm độc mãn tính gây ra bởi việc tiếp nhận hàng ngày thực phẩm có tồn dư Cytokinins cũng gia tăng các nguy cơ về sức khỏe.  Nguy cơ vô sinh Các nghiên cứu thực hiện trên chuột đã chỉ ra phơi nhiễm lâu ngày (180 ngày) các loại Cytokinins như CPPU, TDZ gây teo tinh hoàn, biến dị ống dẫn mào tinh ở chuột đực, ức chế sự sống trên các tế bào tử cung, buồng trứng, gây rối loạn điều hòa sản xuất các hormon sinh dục nữ như progesteron, estradiol là bằng chứng cho thấy Cytokinins có thể gây ra nguy cơ vô sinh cho cả người và động vật [13].