ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, với sự tiến bộ của con ngƣời cùng với sự phát triển vƣợt bậc của ngành khoa học công nghệ đã tạo ra hàng loạt các dƣợc phẩm có nguồn gốc nhân tạo với tính năng chữa bệnh rất công hiệu và mang lại kết quả rất nhanh chóng. Nhƣng đằng sau đó còn có những hạn chế, tác dụng phụ… gây ảnh hƣởng đến sức khỏe con ngƣời. Do vậy khuynh hƣớng quay về với thiên nhiên sử dụng những loài thực vật vừa có giá trị dinh dƣỡng và dƣợc tính chữa bệnh đang ngày càng đƣợc quan tâm. Trong đó tỏi đen đƣợc xem là những loại thực vật hội đủ các nhu cầu thiết yếu của con ngƣời hơn hẳn các loại thực vật khác trong tự nhiên.
Các nghiên cứu về thành phần hóa học của tỏi đen [8, 9, 10, 15, 50] cho thấy: sau khi lên men, các hợp chất hữu cơ lƣu huỳnh tan trong nƣớc nhƣ S-allyl-L- cystein (SALC), alliin, isoalliin, methiin… và các hợp chất hữu cơ lƣu huỳnh không tan trong các dung môi không phân cực nhƣ diallyl disulfide, diallyl trisulfide… Điều này làm cải thiện một số hoạt tính sinh học của tỏi đen nhƣ khả năng chống oxy hóa, tăng cƣờng miễn dịch, ức chế tế bào ung thƣ [7, 8, 22, 23,24]. Trong số các hợp chất chứa lƣu huỳnh, S-allyl-L-cystein và diallyl disulfide là hoạt chất đƣợc chú ý nhiều nhất vì có nhiều hoạt tính có lợi cho sức khỏe con ngƣời. Với mục đích và ý nghĩa thực tiễn nhƣ thế thì việc kiểm soát chất lƣợng tỏi đen và các sản phẩm từ tỏi đen sẽ giúp mọi ngƣời có đƣợc nguồn dinh dƣỡng hợp lý, đủ về số lƣợng và đảm bảo về chất lƣợng. Trên thế giới có rất nhiều phƣơng pháp xác định SALC và DADS trong tỏi đen, do SALC là hợp chất có khả năng hấp thụ quang cũng nhƣ phát xạ quang, vì thế các phƣơng pháp thƣờng đƣợc sử dụng để xác định SALC là HPLC-detector PDA, detector huỳnh quang (FLD), detector khối phổ (MS) và detector UV [15, 35, 41, 42, 43]; còn đối với hợp chất DADS, do tính chất dễ bay hơi và hàm lƣợng chất trong mẫu thấp nên phƣơng pháp phân tích sử dụng phổ biến sắc ký khí khối phổ (GC-MS).
Ở Việt Nam, các nghiên cứu về SALC từ tỏi đen vẫn còn nhiều hạn chế, tại Học viện quân y 103 [1] đã có công trình công bố, tuy nhiên, nghiên cứu này còn Nguyễn Thị Thu 1 Trường ĐHKH Tự Luận văn thạc Chuyên ngành: Hóa phân nhiều thiếu sót do còn ảnh hƣởng khá nhiều của nền mẫu; còn đối với DADS chƣa có nghiên cứu cụ thể nào để phân tích hàm lƣợng DADS trong tỏi đen. Do đó, vấn đề đặt ra là tìm quy trình nghiên cứu để xác định hàm lƣợng SALC và DADS trong tỏi đen. Từ những lý do trên, chúng tôi đã chọn đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình xác định hàm lƣợng S-allyl-L-cystein (SALC), Diallyl disulfide (DADS) trong tỏi đen” với hai mục tiêu nhƣ sau: 1. Xây dựng quy trình định lƣợng S-allyl-L-cystein (SALC) trong tỏi đen bằng HPLC-PDA.
Xây dựng quy trình định lƣợng Diallyl disulfide (DADS) trong tỏi đen bằng GC-MS. Nguyễn Thị Thu 2 Trường ĐHKH Tự Luận văn thạc Chuyên ngành: Hóa phân CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN 1. TỔNG QUAN VỀ TỎI ĐEN 1. Khái quát chung về tỏi trắng Tỏi (danh pháp hai phần: Allium sativum) là một loài thực vật thuộc họ Hành Alliaceae [2], nghĩa là có họ hàng với hành tây, hành ta, hành tím, tỏi tây, v.
Tỏi không chỉ đóng vai trò là một gia vị trong bữa ăn mà còn có tác dụng nhƣ một vị thuốc hữu hiệu với nhiều tác dụng. Hình ảnh củ tỏi trắng Lý Sơn Tỏi đƣợc sử dụng rộng rãi nhƣ là một gia vị dùng cho thực phẩm và dƣợc liệu quan trọng nhất trong nhiều thế kỉ. Nó đã đƣợc trồng từ thời cổ đại, đƣợc sử dụng làm gia vị và hƣơng liệu do các tiềm năng chữa bệnh. Hoạt tính của tỏi phụ thuộc vào các hoạt chất của nó, đặc biệt là các hợp chất lƣu huỳnh hữu cơ – tạo vị cay nồng của tỏi.
Ngoài các hợp chất đó, hoạt tính của tỏi cũng đƣợc đặc trƣng bởi các hoạt chất phenolic – tính dƣợc lý và hàm lƣợng tƣơng đối cao [29]. Phần hay đƣợc sử dụng nhất của cả cây tỏi là củ tỏi, mà ta vẫn dùng làm gia vị. Củ tỏi có nhiều tép. Từng tép tỏi cũng nhƣ cả củ tỏi đều có lớp vỏ mỏng bảo vệ.
Tỏi sinh trƣởng tốt trong môi trƣờng nóng và ẩm. Tác dụng của tỏi: Hành khí, ôn trung, tiêu tích trệ, sát trùng, giải độc, trù trị, cảm cúm, ho gà, viêm phế quản, ăn uống tích trễ, thƣợng vị đau tức do đầy hơi, tiêu chảy, mụn nhót, áp xe viêm tấy, hói trán, trị giun kim [4]. Tại Việt Nam có nhiều vùng đất trồng tỏi nổi tiếng nhƣ: Lý Sơn, Phan Rang. và gần đây nhất là Bắc Giang.
Nguyễn Thị Thu 3 Trường ĐHKH Tự Luận văn thạc Chuyên ngành: Hóa phân Trong những năm gần đây, tỏi đã đƣợc nghiên cứu nhiều bởi lợi ích của nó đối với sức khỏe con ngƣời: các tác dụng chống oxy hóa, kháng khuẩn và chống ung thƣ. Do vậy, tỏi đã trở thành một trong những loại thực phẩm ngăn ngừa bệnh phổ biến nhất. Mặc dù tỏi có rất nhiều lợi ích sức khỏe do hoạt chất allicin và các hoạt chất trong tỏi, nhƣng nó còn hạn chế do đặc trƣng mùi và gây đau bụng với những ngƣời mẫn cảm. Vì vậy, các nghiên cứu gần đây tập trung vào phƣơng pháp chế biến khác nhau nhƣ xử lý nhiệt, lão hóa và lên men để loại bỏ và cải thiện mùi hăng khó chịu của tỏi [40].
Khái quát chung về tỏi đen Tỏi đen (black garlic) là sản phẩm lên men từ tỏi tƣơi (hay còn gọi là tỏi trắng) bằng cách gia nhiệt tỏi tƣơi ở nhiệt độ cao dƣới sự kiểm soát độ ẩm trong hơn một tháng. Hơn nữa, quá trình gia nhiệt thƣờng đƣợc sử dụng trong sản xuất thực phẩm. Một trong những mục tiêu quan trọng nhất của quá trình gia nhiệt để nâng cao chất lƣợng thực phẩm, giúp ngon miệng, thay đổi màu sắc, hƣơng liệu và kết cấu trong thực phẩm. Ngoài ra, quá trình làm nóng dẫn đến sự hình thành các hoạt chất sinh học mới do quá trình chuyển hóa của một số hoạt chất [29].
Tỏi đen có ở Việt Nam cách đây khoảng 3 năm, đầu tiên do tiến sĩ Vũ Bình Dƣơng nghiên cứu đề tài về ứng dụng lên men tỏi đen từ tỏi Lý Sơn, Việt Nam. Và đƣợc sản xuất thử nghiệm thành công. Sau đó đƣợc các trung tâm nghiên cứu, các doanh nghiệp phát triển sản xuất và bán phổ biến rộng rãi trong cả nƣớc, đặc biệt thị trƣờng ở thành phố Hồ Chí Minh và Hà Nội do đƣợc quảng bá rộng về công dụng vƣợt trội cho sức khỏe nên đã đƣợc đón nhận và tiêu thụ khá mạnh [8, 9,10]. Hoạt chất S-allyl cysteine là hoạt chất rất có lợi cho cơ thể chống lại bệnh ung thƣ [43], ngoài ra diallyl disulfide và diallyl trisulfide tác dụng hạ huyết áp, hạ cholesterol [48].
Với các hoạt chất này, sau khi sử dụng cơ thể chuột đã giảm thiểu ảnh hƣởng của tia xạ tới các cơ quan nhƣ cơ quan miễn dịch, hệ thống võng nội bộ. Mật độ tế bào tại hạch, lách, tuyến ức và tủy xƣơng dày đặc hơn, ít bị tổn thƣơng hơn ở nhóm chuột bị chiếu xạ không uống tỏi hoặc uống tỏi thƣờng. Đây là minh chứng cho khả năng bảo veeh các tế bào miễn dịch của tỏi đen dƣới tác động của tia xạ [10]. Nguyễn Thị Thu 4 Trường ĐHKH Tự Luận văn thạc Chuyên ngành: Hóa phân Hình 1.
Hình ảnh sản phẩm tỏi đen sau khi lên men 1. Quá trình lên men tỏi thành tỏi đen Trong quá trình lên men sẽ xảy ra phản ứng chuyển hoá các hợp chất chứa lƣu huỳnh nhƣ methionin, cystein, methanethiol thành những hợp chất mới chứa lƣu huỳnh tan đƣợc trong nƣớc nhƣ S-allyl-L-cystein alliin, isoalliin, methionin, cycloalliin, các dẫn chất của cysteine, dẫn chất tetrahydro-β-carboline. Đây là những hợp chất quan trọng làm tăng tác dụng của sản phẩm tỏi đen thu đƣợc. Quy trình lên men tự nhiên cũng làm cho hàm lƣợng carbohydrate tăng từ 28,7% (trong tỏi) lên tới 47,9% (trong tỏi đen), nhờ đó tỏi đen có vị ngọt của trái cây.
Vì trong thành phần tỏi có chứa đƣờng và acid amin, sau khi trải qua quá trình lên men sẽ tạo ra melanoidin, một chất có màu sẫm đen. Do đó tỏi sau khi lên men tự nhiên (không dùng hóa chất) lại chuyển thành màu đen, vị ngọt, không còn mùi cay, hăng của tỏi thông thƣờng [45]. Sơ đồ quy trình lên men tỏi tạo tỏi đen nhƣ hình 1. Chọn lọc, Xử lý, Ủ nhiệt, Thu tỏi Tỏi tƣơi phân loại làm sạch lên men đen Đóng gói, Kiểm tra, chất bảo quản lƣợng tỏi Hình 1.
Quy trình lên men tỏi đen Thành phần tỏi có chứa đƣờng và acid amin, sau khi trải qua quá trình lên men sẽ tạo ra melanoidin, một chất có màu sẫm đen làm sản phẩm có màu đen. Nguyễn Thị Thu 5 Trường ĐHKH Tự Luận văn thạc Chuyên ngành: Hóa phân 1. TỔNG QUAN VỀ S-ALLYL-L-CYSTEIN VÀ DIALLYL-DISULFIDE 1. Tổng quan về S-allyl-L-cystein S-allyl-L-cystein (SALC) là một acid amin chứa lƣu huỳnh đƣợc tìm thấy trong dịch chiết tỏi đã lên men [47], hợp chất chiếm hàm lƣợng nhiều nhất.
Nhiều nghiên cứu đã chứng minh các hoạt động chống oxy hóa của tỏi đen và SALC ở thí nghiệm trong ống nghiệm (in vivo) – trong các mô hình thí nghiệm động vật liên quan về mất cân bằng oxi hóa và thí nghiệm trên tế bào (in vitro) – tác giả đã sử dụng một vài phƣơng pháp để loại bỏ một số phản ứng oxi hóa đặc biệt và làm giảm các ảnh hƣởng của quá trình oxy hóa. Xuất phát từ những thực nghiệm đó, tác dụng bảo vệ của tỏi đen và SALC để ngăn ngừa và cải thiện sự mất cân bằng oxy hóa [14]. Cấu trúc và tính chất SALC đƣợc mô tả với các khái niệm khác nhau nhƣ S-allylcystein, L- deoxyalliin. Phần hoạt động mạnh nhất của phân tử SALC là liên kết -C-S- trong phân tử.
Đây là một liên kết hoạt động nó mang đến cho SALC những hoạt tính sinh học cao. Công thức hóa học của S-allyl-L-cystein Danh pháp IUPAC: (R)-3-(Allylthio)-2-aminopropanoic acid. Công thức hóa học: C6H11NO2S. Khối lƣợng phân tử: 161,222.
Khối lƣợng riêng: 1,191. Điểm nóng chảy: 223,3 – 223,70C. SALC đƣợc hình thành bởi quá trình dị hóa của γ-glutamyl-S-allylcysteine (Hình 1. SALC có dạng bột tinh thể màu trắng với mùi đặc trƣng, tan tốt trong nƣớc và không hút ẩm.