Xây dựng quy trình phát hiện EHP bằng phương pháp LAMP và PSR - ĐH Nguyễn Tất Thành

Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện EHP trên tôm bằng phương pháp LAMP và PSR. Giải pháp giúp chẩn đoán mầm bệnh nhanh chóng và có độ chính xác cao.

• Tác giả: Trần Hồng Diễm
• Trường học: Đại học Nguyễn Tất Thành
• Đề tài: Xây dựng quy trình phát hiện Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) bằng phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt LAMP và PSR
• Loại tài liệu: Báo cáo tổng kết đề tài NCKH
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• DANH MỤC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG BIỂU, SƠ ĐỒ
• TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• MỞ ĐẦU
• 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tổng quan về bệnh do vi bào tử trùng EHP
• 1.1.1. Khái quát về bệnh EHP
• 1.1.2. Tác nhân gây bệnh
• 1.1.3. Cơ chế gây bệnh
• 1.1.4. Triệu chứng bệnh
• 1.1.5. Biện pháp điều trị bệnh
• 1.1.6. Biện pháp phòng bệnh
• 1.1.7. Phương pháp phát hiện bệnh EHP
• 1.2. Phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt LAMP
• 1.2.1. Tổng quan về phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt
• 1.2.2. Nguyên lí hoạt động của LAMP
• 1.2.3. Ứng dụng phương pháp LAMP
• 1.2.4. Tổng quan về phương pháp PSR
• 1.2.5. Nguyên lí phương pháp PSR
• 1.2.6. Ứng dụng phương pháp PSR
• 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Thời gian và địa điểm
• 2.2. Nội dung nghiên cứu
• 2.3. Vật liệu nghiên cứu
• 2.3.1. Thiết bị, dụng cụ
• 2.3.2. Vật liệu sinh học
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4.1. Phương pháp xác định trình tự các thành phần phản ứng LAMP/PSR
• 2.4.2. Phương pháp phát hiện trình tự đặc trưng của EHP bằng LAMP/PSR
• 2.4.3. Phương pháp đọc kết quả LAMP/PSR
• 2.4.4. Khảo sát điều kiện phản ứng
• 2.4.4.1. Phương pháp khảo sát nhiệt độ tối ưu cho phản ứng LAMP/PSR
• 2.4.4.2. Phương pháp khảo sát thời gian của phản ứng LAMP/PSR
• 2.4.4.3. Phương pháp khảo sát giới hạn phát hiện của phản ứng LAMP/PSR
• 2.4.4.4. Khảo sát tính đặc hiệu của mồi phản ứng LAMP/PSR
• 2.4.5. Phương pháp LAMP/PSR trực tiếp với thực phẩm nhiễm bệnh
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả kiểm tra mồi và các thành phần phản ứng LAMP/PSR
• 3.2. Kết quả khảo sát thời gian cho phản ứng LAMP/PSR
• 3.3. Kết quả khảo sát nhiệt độ
• 3.4. Giới hạn phát hiện của phương pháp LAMP/PSR
• 3.5. Tính đặc hiệu của bộ mồi thiết kế đối với EHP
• 3.6. Hoạt động của LAMP/PSR đối với DNA tách chiết từ mẫu tôm nhiễm EHP
• 3.7. Hoạt động của LAMP/PSR đối với DNA hiện diện trong mẫu bệnh phẩm - mẫu tôm bệnh
• 3.8. Khảo sát độ pha loãng mẫu khi dùng mẫu trực tiếp không tách chiết DNA cho phản ứng LAMP/PSR
• 3.9. Khả năng phát hiện của phản ứng LAMP/PSR với mẫu tôm bệnh trực tiếp, không qua tách chiết
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan phương pháp phát hiện EHP trên tôm bằng LAMP PSR

Việc phát hiện sớm vi bào tử trùng EHP (Enterocytozoon hepatopenaei) là yếu tố then chốt để quản lý sức khỏe tôm và giảm thiểu thiệt hại kinh tế. Bệnh EHP trên tôm gây ra hội chứng chậm lớn, ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất của cả tôm thẻ chân trắng và tôm sú. Các phương pháp chẩn đoán truyền thống như PCR, dù chính xác, nhưng đòi hỏi thiết bị phức tạp và thời gian dài. Để giải quyết vấn đề này, các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại đã được phát triển, nổi bật là phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt LAMP (Loop-mediated Isothermal Amplification) và PSR (Polymerase Spiral Reaction). Hai phương pháp này mang lại nhiều ưu điểm vượt trội: tốc độ nhanh, độ nhạy và độ đặc hiệu cao, không yêu cầu máy luân nhiệt đắt tiền. Đặc biệt, nghiên cứu “Xây dựng quy trình phát hiện Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) bằng phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt LAMP và PSR” đã chứng minh tiềm năng to lớn của chúng trong việc sàng lọc mầm bệnh tại ao nuôi. Quy trình này cho phép phát hiện EHP trực tiếp từ mẫu tôm xét nghiệm mà không cần qua bước tách chiết DNA phức tạp, mở ra hướng đi mới cho việc phát triển các bộ kit test nhanh EHP tiện lợi, góp phần vào an toàn sinh học trong nuôi tôm.

1.1. EHP là gì và tác hại của bệnh chậm lớn trên tôm

Enterocytozoon hepatopenaei, hay còn gọi là vi bào tử trùng EHP, là một loài ký sinh nội bào bắt buộc, tấn công chủ yếu vào gan tụy tôm. Mặc dù không gây chết hàng loạt như các bệnh do virus, EHP là nguyên nhân chính gây ra bệnh chậm lớn trên tôm. Tôm bị nhiễm bệnh có biểu hiện tăng trưởng không đồng đều, còi cọc, giảm sức đề kháng và dễ mắc các bệnh cơ hội khác. Tác động kinh tế của EHP rất nặng nề, làm giảm kích cỡ tôm thương phẩm, kéo dài thời gian nuôi và tăng chi phí sản xuất. Việc chẩn đoán bệnh tôm liên quan đến EHP sớm là cực kỳ quan trọng để áp dụng các biện pháp phòng trị bệnh EHP kịp thời, tránh lây lan ra toàn bộ ao nuôi. Việc không kiểm soát được EHP có thể dẫn đến thất bại cả vụ nuôi.

1.2. Giới thiệu kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt LAMP và PSR

Khác với PCR truyền thống yêu cầu chu kỳ nhiệt thay đổi, khuếch đại đẳng nhiệt là kỹ thuật nhân bản DNA hoặc RNA ở một nhiệt độ không đổi. Phương pháp LAMP sử dụng từ 4 đến 6 mồi đặc hiệu để nhận biết 6-8 vùng riêng biệt trên gen mục tiêu, tạo ra các cấu trúc vòng lặp (loop) giúp quá trình khuếch đại diễn ra cực nhanh và hiệu quả. Tương tự, phương pháp PSR (Polymerase Spiral Reaction) cũng hoạt động ở nhiệt độ không đổi, sử dụng một cặp mồi đặc biệt để tạo ra cấu trúc xoắn ốc DNA. Cả hai kỹ thuật này đều sử dụng enzyme Bst DNA polymerase có hoạt tính dịch chuyển mạch mạnh. Ưu điểm lớn nhất là sự đơn giản, nhanh chóng (kết quả có trong vòng 30-60 phút) và có thể quan sát kết quả bằng mắt thường thông qua sự đổi màu của thuốc nhuộm pH, rất phù hợp để phát triển các kit LAMP EHP và kit PSR EHP cho việc chẩn đoán tại hiện trường.

II. Thách thức trong việc chẩn đoán bệnh EHP trên tôm thẻ

Việc chẩn đoán bệnh tôm do EHP gây ra đối mặt với nhiều thách thức. Triệu chứng lâm sàng của bệnh EHP trên tôm thường không rõ ràng ở giai đoạn đầu và dễ nhầm lẫn với các bệnh khác hoặc do yếu tố môi trường. Tôm có thể mang mầm bệnh nhưng không biểu hiện ra bên ngoài, trở thành nguồn lây nhiễm tiềm tàng trong ao. Các phương pháp truyền thống như PCR phát hiện EHP hay Real-time PCR tuy có độ chính xác cao nhưng lại tồn tại nhiều hạn chế khi áp dụng rộng rãi. Chúng đòi hỏi phòng thí nghiệm được trang bị đầy đủ máy móc hiện đại, kỹ thuật viên có chuyên môn cao và chi phí đầu tư lớn. Thời gian từ khi lấy mẫu đến khi có kết quả thường kéo dài, làm chậm quá trình ra quyết định xử lý tại ao nuôi. Hơn nữa, quy trình tách chiết DNA từ mẫu tôm xét nghiệm cũng là một bước phức tạp, tốn thời gian và có thể ảnh hưởng đến chất lượng DNA, dẫn đến kết quả không chính xác. Do đó, ngành tôm rất cần một S.O.P xét nghiệm EHP (Quy trình thao tác chuẩn) đơn giản, nhanh chóng, chi phí thấp và có thể thực hiện ngay tại trang trại để chủ động trong việc quản lý sức khỏe tôm.

2.1. Hạn chế của phương pháp PCR phát hiện EHP truyền thống

Mặc dù được coi là “tiêu chuẩn vàng”, phương pháp PCR phát hiện EHP có những nhược điểm cố hữu. Đầu tiên là yêu cầu về cơ sở vật chất. Phản ứng PCR cần máy luân nhiệt (thermocycler) để thực hiện 30-40 chu kỳ thay đổi nhiệt độ, đây là thiết bị đắt tiền và không phù hợp với điều kiện tại ao nuôi. Thứ hai, quy trình này đòi hỏi nhân viên phải có tay nghề cao để thực hiện các bước phức tạp từ tách chiết DNA, pha phản ứng đến phân tích kết quả trên gel điện di. Bất kỳ sai sót nào trong quá trình đều có thể dẫn đến kết quả âm tính giả hoặc dương tính giả. Cuối cùng, thời gian là một rào cản lớn. Toàn bộ quy trình từ chuẩn bị mẫu đến đọc kết quả mất vài giờ đồng hồ, làm lỡ “thời điểm vàng” để can thiệp và ngăn chặn dịch bệnh lây lan trong quần thể tôm.

2.2. Nhu cầu về một S.O.P xét nghiệm EHP hiệu quả tại ao nuôi

Từ những hạn chế trên, nhu cầu cấp thiết là xây dựng một S.O.P xét nghiệm EHP (Quy trình thao tác chuẩn) mới, đáp ứng được các tiêu chí: nhanh, nhạy, đặc hiệu, rẻ và dễ sử dụng tại hiện trường. Một quy trình lý tưởng sẽ loại bỏ được bước tách chiết DNA phức tạp, cho phép thực hiện xét nghiệm EHP trực tiếp trên mẫu gan tụy tôm đã được xử lý đơn giản. Kết quả phải có thể quan sát bằng mắt thường, không cần đến các thiết bị đọc chuyên dụng. Việc này sẽ giúp người nuôi tôm chủ động sàng lọc con giống, kiểm tra định kỳ sức khỏe đàn tôm và phát hiện sớm mầm bệnh để có biện pháp xử lý kịp thời, đóng góp quan trọng vào chiến lược an toàn sinh học trong nuôi tôm và phát triển bền vững.

III. Hướng dẫn quy trình phát hiện EHP bằng phương pháp LAMP

Phương pháp LAMP (Loop-mediated Isothermal Amplification) là một giải pháp đột phá cho việc chẩn đoán bệnh tôm. Quy trình này được tối ưu hóa để phát hiện vi bào tử trùng EHP một cách nhanh chóng và chính xác. Dựa trên nghiên cứu, quy trình LAMP được thực hiện ở nhiệt độ không đổi, lý tưởng là 65°C, trong vòng 30 phút. Phản ứng sử dụng một bộ 6 mồi được thiết kế đặc hiệu nhắm vào gen SSU rRNA của EHP, đảm bảo tính đặc hiệu cao và không có phản ứng chéo với các tác nhân gây bệnh khác trên tôm. Điểm nổi bật của quy trình là sử dụng master mix có sẵn chất chỉ thị màu pH (phenol red). Khi phản ứng LAMP diễn ra và sản phẩm DNA được khuếch đại với số lượng lớn, ion H+ được giải phóng làm giảm độ pH của dung dịch, khiến màu của phản ứng chuyển từ hồng sang vàng. Sự thay đổi màu sắc rõ rệt này cho phép đọc kết quả trực tiếp bằng mắt thường, loại bỏ nhu cầu sử dụng các thiết bị phức tạp. Kit LAMP EHP dựa trên quy trình này có thể phát hiện tới 10 bản sao DNA mục tiêu trong một phản ứng, cho thấy độ nhạy rất cao, phù hợp cho việc sàng lọc mầm bệnh ở nồng độ thấp.

3.1. Nguyên lý hoạt động của kỹ thuật real time LAMP

Nguyên lý cốt lõi của phương pháp LAMP là sự khuếch đại DNA tự mồi theo cấu trúc vòng lặp. Phản ứng bắt đầu khi mồi trong (FIP và BIP) lai vào mạch khuôn DNA. Enzyme Bst DNA polymerase sẽ tổng hợp một mạch mới, đồng thời dịch chuyển mạch cũ. Mạch mới này tự tạo thành cấu trúc kẹp tóc ở hai đầu, hình thành các vòng lặp. Các vòng lặp này lại trở thành khuôn mới cho các mồi khác bám vào, khởi tạo một chu kỳ khuếch đại mới. Quá trình này diễn ra liên tục và theo cấp số nhân, tạo ra một lượng sản phẩm DNA khổng lồ chỉ trong thời gian ngắn ở nhiệt độ đẳng nhiệt (khoảng 60-65°C). Biến thể real-time LAMP cho phép theo dõi quá trình này theo thời gian thực bằng cách đo độ đục hoặc tín hiệu huỳnh quang, nhưng để đơn giản hóa cho việc ứng dụng tại ao nuôi, việc quan sát sự đổi màu vẫn là phương pháp hiệu quả và tiết kiệm nhất.

3.2. Các bước thực hiện xét nghiệm EHP bằng kit LAMP EHP

Quy trình thực hiện xét nghiệm EHP với kit LAMP EHP được tối ưu hóa để đơn giản tối đa. Bước 1: Chuẩn bị mẫu tôm xét nghiệm. Mẫu gan tụy tôm được nghiền trong dung dịch đệm. Bước 2: Xử lý nhiệt mẫu. Dịch nghiền được đun nóng để phá vỡ tế bào và giải phóng DNA. Bước 3: Pha phản ứng. Một lượng nhỏ dịch mẫu đã xử lý được thêm vào ống phản ứng chứa sẵn hỗn hợp master mix và mồi. Bước 4: Ủ đẳng nhiệt. Ống phản ứng được ủ ở 65°C trong 30 phút bằng máy ủ nhiệt khô cầm tay hoặc thậm chí là một bình nước nóng đơn giản. Bước 5: Đọc kết quả. Quan sát sự thay đổi màu sắc. Ống phản ứng chuyển sang màu vàng là dương tính với EHP, trong khi ống giữ nguyên màu hồng là âm tính. Quy trình này không đòi hỏi kỹ thuật viên chuyên nghiệp, phù hợp với mọi trang trại.

IV. Cách phát hiện vi bào tử trùng EHP nhanh chóng bằng PSR

Phương pháp PSR (Polymerase Spiral Reaction) là một kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt mới, thậm chí còn đơn giản hơn LAMP về mặt thiết kế mồi, nhưng vẫn duy trì hiệu suất vượt trội trong việc xét nghiệm EHP. Quy trình PSR để phát hiện Enterocytozoon hepatopenaei đã được tối ưu hóa trong nghiên cứu và cho thấy kết quả ấn tượng. Tương tự LAMP, phản ứng PSR hoạt động hiệu quả nhất ở nhiệt độ 65°C trong thời gian chỉ 30 phút. Tuy nhiên, PSR chỉ cần một cặp mồi duy nhất, giúp giảm chi phí tổng hợp và giảm thiểu khả năng hình thành mồi dimer. Nguyên lý của PSR là tạo ra sản phẩm khuếch đại có cấu trúc xoắn ốc, quá trình này cũng giải phóng một lượng lớn proton, làm thay đổi pH dung dịch. Do đó, kết quả cũng có thể được quan sát dễ dàng bằng mắt thường thông qua sự đổi màu từ hồng sang vàng. Một trong những ưu điểm lớn nhất của phương pháp PSR được ghi nhận trong nghiên cứu là độ nhạy cực cao, có khả năng phát hiện chỉ 1 bản sao DNA mục tiêu trong mỗi phản ứng. Điều này làm cho kit PSR EHP trở thành một công cụ cực kỳ mạnh mẽ để phát hiện mầm bệnh ở giai đoạn rất sớm, ngay cả khi tải lượng ký sinh trùng trong tôm còn thấp.

4.1. So sánh ưu và nhược điểm của Polymerase Spiral Reaction

Polymerase Spiral Reaction (PSR) có nhiều ưu điểm nổi bật. Ưu điểm lớn nhất là độ nhạy vượt trội, cao hơn cả LAMP trong cùng điều kiện nghiên cứu. Việc chỉ sử dụng một cặp mồi giúp đơn giản hóa việc thiết kế và tối ưu hóa phản ứng, đồng thời giảm chi phí. Tốc độ phản ứng cũng rất nhanh, cho kết quả rõ ràng trong 30 phút. Tuy nhiên, là một kỹ thuật tương đối mới, các bộ kit test nhanh EHP dựa trên PSR có thể chưa phổ biến bằng LAMP. Ngoài ra, giống như các phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt khác, PSR rất nhạy cảm với tạp nhiễm. Việc mở nắp ống sau phản ứng để phân tích có thể tạo ra aerosol chứa sản phẩm khuếch đại, gây nguy cơ nhiễm chéo cho các lần xét nghiệm sau. Do đó, cần tuân thủ nghiêm ngặt quy trình thao tác để đảm bảo kết quả chính xác.

4.2. Quy trình chẩn đoán EHP không cần tách chiết DNA bằng PSR

Điểm đột phá của quy trình PSR được phát triển là khả năng chẩn đoán bệnh tôm mà không cần bước tách chiết DNA. Quy trình này tối ưu cho việc sử dụng mẫu trực tiếp, giúp tiết kiệm thời gian và chi phí. Cụ thể, một mảnh nhỏ gan tụy tôm được đồng nhất trong nước sinh học phân tử, sau đó dịch nghiền được pha loãng 50 lần. Việc pha loãng này rất quan trọng, giúp giảm nồng độ của các chất ức chế tiềm tàng có trong mẫu mô mà không làm ảnh hưởng đáng kể đến nồng độ DNA mục tiêu. Dịch mẫu đã pha loãng được cho trực tiếp vào ống phản ứng PSR và ủ ở 65°C trong 30 phút. Kết quả được đọc bằng mắt thường. Nghiên cứu đã chứng minh quy trình này đạt độ nhạy và độ đặc hiệu 100% khi so sánh với Real-time PCR trên cùng một bộ mẫu, khẳng định tính tin cậy và tiềm năng ứng dụng thực tiễn to lớn.

V. Kết quả tối ưu hóa quy trình xét nghiệm EHP bằng LAMP PSR

Nghiên cứu đã thành công trong việc xây dựng và tối ưu hóa quy trình phát hiện EHP trên tôm bằng LAMP và PSR. Kết quả cho thấy cả hai phương pháp đều hoạt động hiệu quả ở điều kiện tối ưu là nhiệt độ 65°C và thời gian phản ứng là 30 phút. Đây là một khoảng thời gian cực kỳ ngắn so với các phương pháp truyền thống, cho phép đưa ra kết quả xét nghiệm EHP gần như tức thì. Về độ nhạy, phương pháp PSR tỏ ra vượt trội khi có giới hạn phát hiện (LOD) là 1 bản sao DNA/phản ứng, trong khi phương pháp LAMP có LOD là 10 bản sao DNA/phản ứng. Cả hai đều là những con số rất ấn tượng, đảm bảo khả năng phát hiện mầm bệnh ngay cả ở giai đoạn nhiễm sớm. Về tính đặc hiệu, bộ mồi được thiết kế cho cả hai quy trình đã được kiểm tra chéo với DNA của các vi khuẩn phổ biến khác trên tôm như Vibrio parahaemolyticus, V. cholerae, E. coli... và cho kết quả âm tính, khẳng định rằng phản ứng chỉ xảy ra đặc hiệu với Enterocytozoon hepatopenaei. Đặc biệt, khi áp dụng trên 50 mẫu tôm thực tế (20 mẫu dương tính và 30 mẫu âm tính theo qPCR), cả hai quy trình đều cho kết quả chính xác 100%, kể cả khi sử dụng mẫu trực tiếp không qua tách chiết DNA.

5.1. Xác định giới hạn phát hiện và tính đặc hiệu của bộ mồi

Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ thấp nhất của tác nhân gây bệnh mà xét nghiệm có thể phát hiện được. Trong nghiên cứu này, LOD được xác định bằng cách pha loãng chuỗi DNA tổng hợp của EHP theo bậc 10. Kết quả cho thấy phản ứng PSR cho tín hiệu dương tính rõ ràng ở nồng độ 10⁰ (1 bản sao/phản ứng), còn LAMP là 10¹ (10 bản sao/phản ứng). Tính đặc hiệu được đánh giá bằng cách cho bộ mồi EHP phản ứng với DNA của các mầm bệnh không liên quan. Kết quả không ghi nhận bất kỳ tín hiệu dương tính nào, chứng tỏ bộ mồi được thiết kế chỉ nhận diện duy nhất gen mục tiêu của vi bào tử trùng EHP. Điều này đảm bảo rằng kết quả chẩn đoán bệnh tôm là đáng tin cậy và không bị gây nhiễu bởi các vi sinh vật khác.

5.2. Đánh giá hiệu quả trên mẫu tôm xét nghiệm thực địa

Để xác thực tính ứng dụng, quy trình đã được thử nghiệm trên các mẫu tôm xét nghiệm thu thập từ các vùng nuôi trọng điểm. Các mẫu này được xử lý theo quy trình đơn giản (nghiền và pha loãng 50 lần) và chạy song song với phương pháp đối chứng là Real-time PCR. Kết quả cho thấy sự tương đồng tuyệt đối: 20 mẫu dương tính theo qPCR đều cho kết quả dương tính (chuyển màu vàng) với LAMP/PSR, và 30 mẫu âm tính theo qPCR cũng cho kết quả âm tính (giữ màu hồng). Độ nhạy và độ đặc hiệu lâm sàng của cả hai phương pháp trên mẫu thực địa đều đạt 100%. Thành công này chứng tỏ quy trình phát hiện EHP trên tôm bằng LAMP và PSR không chỉ hoạt động tốt trong phòng thí nghiệm mà còn cực kỳ hiệu quả và đáng tin cậy khi áp dụng trong điều kiện thực tế.

VI. Triển vọng ứng dụng kit test nhanh EHP trong nuôi tôm

Sự thành công của quy trình phát hiện EHP trên tôm bằng LAMP và PSR mở ra một tương lai đầy hứa hẹn cho ngành nuôi tôm Việt Nam. Triển vọng lớn nhất là việc thương mại hóa các bộ kit test nhanh EHP dựa trên các quy trình đã được tối ưu hóa này. Các kit LAMP EHP và kit PSR EHP sẽ là công cụ đắc lực, cho phép người nuôi tôm tự thực hiện xét nghiệm EHP ngay tại ao mà không cần gửi mẫu đến phòng thí nghiệm. Việc này giúp rút ngắn đáng kể thời gian chờ đợi kết quả, từ vài ngày xuống còn khoảng 30-40 phút, cho phép đưa ra các quyết định quản lý tức thì. Người nuôi có thể chủ động sàng lọc chất lượng tôm giống trước khi thả, kiểm tra định kỳ sức khỏe đàn tôm trong suốt vụ nuôi và phát hiện sớm sự hiện diện của vi bào tử trùng EHP. Khi phát hiện ca nhiễm sớm, có thể nhanh chóng cách ly ao bệnh, áp dụng các biện pháp phòng trị bệnh EHP phù hợp, ngăn chặn sự lây lan và bùng phát thành dịch. Về lâu dài, việc áp dụng rộng rãi các bộ kit này sẽ nâng cao năng lực quản lý sức khỏe tôm, cải thiện tỷ lệ thành công của các vụ nuôi và đóng góp vào việc xây dựng một nền nông nghiệp thủy sản bền vững, an toàn và hiệu quả.

6.1. Lợi ích của việc chủ động phòng trị bệnh EHP tại trang trại

Việc trang bị bộ kit test nhanh EHP mang lại lợi ích kép: phòng và chống. Về phòng bệnh, người nuôi có thể kiểm tra 100% các lô tôm giống, đảm bảo chỉ thả nuôi những đàn tôm sạch bệnh, cắt đứt nguồn lây nhiễm ngay từ đầu vào. Trong quá trình nuôi, việc kiểm tra định kỳ giúp phát hiện sớm các cá thể nhiễm bệnh và loại bỏ chúng trước khi mầm bệnh phát tán rộng. Về chống dịch, khi phát hiện ao dương tính, người nuôi có thể nhanh chóng áp dụng các biện pháp xử lý như tăng cường dinh dưỡng, sử dụng chế phẩm sinh học, hoặc thu hoạch sớm để giảm thiểu thiệt hại, thay vì bị động chờ đợi dịch bệnh bùng phát trên diện rộng. Sự chủ động này giúp giảm chi phí thuốc và hóa chất, bảo vệ môi trường và nâng cao hiệu quả kinh tế.

6.2. Hướng phát triển S.O.P xét nghiệm EHP và an toàn sinh học

Từ quy trình đã được xác thực, bước tiếp theo là xây dựng một S.O.P xét nghiệm EHP (Quy trình thao tác chuẩn) hoàn chỉnh và dễ hiểu để chuyển giao cho người dùng cuối. S.O.P này cần chi tiết hóa từng bước, từ cách lấy và xử lý mẫu gan tụy tôm, cách sử dụng pipet, cách ủ nhiệt, đến cách đọc và ghi nhận kết quả. Song song đó, việc phát triển các bộ kit tích hợp sẵn mọi thành phần cần thiết (ống chứa master mix, dung dịch đệm,...) sẽ giúp người dùng thao tác dễ dàng và giảm thiểu sai sót. Việc áp dụng S.O.P này một cách rộng rãi sẽ trở thành một trụ cột quan trọng trong chương trình an toàn sinh học trong nuôi tôm, giúp kiểm soát không chỉ EHP mà còn có thể mở rộng cho các mầm bệnh nguy hiểm khác, hướng tới một ngành tôm phát triển bền vững và có khả năng truy xuất nguồn gốc rõ ràng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CONG HOA XA HOI CHU NG HI A VIET NAM Doc lap - Tip do - Hanh phuc Don vi chu tri: Tripong Dai hoc Nguyln TSt Thanh BAO CAO TONG KET DE TAI NCKH DANH CHO CAN BO■ - GIANG VIEN 2023 Ten dd tai: Xay dong quy trinh phat hien Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) b^ng phu’O’ng phap khudch dai dang nhiet LAMP va PSR Sd hop dong: 2023.135 Chu nhiem de tai: Trdn Hdng Didm Don vi cong tac: Vien ky thuat cong nghe cao NTT Thoi gian thoc hien: 10/2023 - 05/2024 TP. Hd Chi Minh, ngay thang nam 2023 CONG HOA XA HOI CHU NGHIA VIET NAM Doc lap - Tit do - Hanh phuc Dan vi chu tri: Trepang Dai hoc Nguyen Tit Thanh BAO CAO TONG KET DE TAI NCKH DANH CHO CAN BO■ - GIANG VIEN 2023 Ten de tai: Xay dong quy trinh phat hien Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) bang phuong phap khuech dai ding nhiet LAMP va PSR Sd hop dong: 2023.135 Chu nhiem de tai: Tran Hong Diem Don vi cong tac: Vien ky thuat cong nghe cao NTT Thoi gian thoc hien: 10/2022 - 05/2023 Cac thanh vien phdi hop va cong tac: Phung Thi Thu Hoong Tran Hong Diem Tran Thi Hau ii MUC LUC MO DAU. ii DANH MUC KY HIEU. CAC CHU' VlET TAT.

ui DANH MUC BANG BlEU, SO DO. v TOM TAT KET QUA NGHIEN CUU. vii MO DAU. TONG QUAN TAI LIEU.

Tong quan ve benli do vi bao hr trung E. Khai quat ve benli EHP. Tac nhan gay benli. Co die gay benli.

Trieu chung benli. Bien phap dieu tri benli. Bien phap phong benli. Phuong phap phat hien benh EHP.

Phuong phap khuech dai dang nhiet LAMP. Tong quan ve phuong phap khuech dai dang nhiet. Nguyen li boat dong cua LAMP. Ung dung phuong phap LAMP.

Tong quan ve phuong phap PSR. Nguyen li phuong phap PSR. Ung dung phuong phap PSR. NOl DUNG VA PHUONG PHAP NGHIEN CUU.

Thai gian va dia diem. Noi dung nghien cuu. Vat lieu nghien cuu. Thiet bi, dung cu.

Vat lieu sinh hoc. Phuong phap nghien cuu. Phuong phap xac dinh trinh tu cac thanh phan phan ung LAMP/PSR.2 Phuong phap phat hien trinh tu dac tiling cua EHP bang LAMP/PSR.3 Phuong phap doc ket qua LAMP/PSR.4 Khao sat dieu kien phan ung.1 Phuong phap khao sat nhiet do toi uu cho phan ung LAMP/PSR.2 Phuong phap khao sat thoi gian cua phan ung LAMP/PSR. Phuong phap khao sat gioi han phat hien cua phan ung LAMP/PSR.6 Khao sat tinh dac hien cua moi phan ung LAMP/PSR.

Phuong phap LAMP/PSR true tiep voi thuc pham nhiem benh. KET QUA YA THAO LUAN. Ket qua kiem tra moi va cac thanh phan phan ung LAMP/PSR.2 Ket qua khao sat thoi giau cho phan ung LAMP/PSR. Ket qua khao sat nhiet do.

Gioi han phat hien cua phuong phap LAMP/PSR. Tinh dac hieu ciia bo moi thiet ke doi ven EHP. Hoat dong cua LAMP/PSR doi voi DNA tach chiet tu man tom nliiem EHP. Hoat dong cua LAMP/PSR doi voi DNA hien dien trong mau benh pham - mau tom benh.

Khao sat do pha loang mau klii dung mau true tiep khong tach chiet DNA cho phan ung LAMP/PSR. Kha nang phat hien cua phan ung LAMP PSR voi man tom benh true tiep. khong qua tach chiet. KET LEAN VA Kl£N NGHI.

33 TAI LIEU THAM KHAO. 34 iii DANH MUC CAC KY MU, CAC CHI" VIET TAT EHP Classical Swine Fever virus DNA Deoxyiibonucleic acid LAMP Loop-mediated Isothermal Amplification NCBI National Center for Biotechnology Information PCR Polymerase Chain Reaction qPCR Real-time - Polymerase Chain Reaction PSR Polymerase spiral reaction DANH MUC CAC BANG BlfiU, SO DO, HiNH ANH Hinh 1. Phuong phap khuech dai dang nhiet vong xoan LAMP/. Phuong phap khuech dai dang nhiet vong xoan PSR.

So do boat dong cua moi cho cac phuong phap LAMP/PSR. Mau sac cua phan ung LAMP/PSR truoc va sau khi phan ung xay ra. Ket qua Idem tra moi LAMP/PSR thiet ke dac trung cho EHP. Ket qua khao sat thoi gian phan ung LAMP/PSR.

Ket qua khao sat nhiet do toi uu cho phan ung LAMP/PSR.4 Ket qua khao sat gioi han phat hien cua phuong phap LAMP/PSR. Ket qua khao sat tinh dac hieu cua bp moi dupe thiet ke. Khao sat dp pha loang man tom benh cho phan ung LAMP/PSR khi thuc hien voi mau true tiep. khong tach chiet.

Cac bp kit chan doan bang ky thuat LAMP PSR da dupe luu hanh.1 Danh muc thiet bi su dung trong nghien cuu.2 Danh muc dung cu sir dung trong nghien cuu.3 Danh muc hoa chat sir dung trong nghien cuu.4 Cac chung vi sinh vat dupe sir dung trong nghien cuu.5 Cac trinh tu sir dung trong nghien cuu.6 Chuong trinh phan ung LAMP/PSR.7 Thanh phan phan ung LAMP. Thanh phan phan ung PSR. Ket qua khao sat thoi gian trong ba lan lap lai. Ket qua khao sat nhiet dp trong ba lan lap lai.

Ket qua LAMP/PSR so voi phuong phap qPCR thuc hien tren mau DNA tach chiet tu tom benh. Ket qua LAMP PSR so voi phuong phap qPCR thuc hien tren mau tom benh. 32 v TOM TAT KtT QUA NGHIEN CUT’ STT Cong viec thuc hien Ket qua dat diro’c 1 Phat hien. toi uu quy trinh Xac dinh trinh tu moi dac tiring, cac khuech dai dangnhiet thanh phan phan ung, toi uu nhiet do, LAMP PSR de phat hien chinh thoi gian phan ung xac EHP 2*• Thuc hien tren man benh pham Quy trinh LAMP PSR co kha nang phat hien true tiep RNA virus trong man benh pham (huyet thanh) 3 Hoan thien bao cao de tai Bao cao hoan chinh STT San pham dang ky San pham da dat diro’c 1 Bai bao khoa hoc Hoan thanh ban thao Thoi gian thuc hien: 9/2022 - 2/2023 Thoi gian nop cuon bao cao: 7/2024 vi MO DAU EHP la mot loai vi bao hr tiling ky sinh gay ra moi de doa dang ke cho nghe nuoi tom tren toan can.

anh hubng den cac loai nhu Penaeus monodon va Litopenaeus vamiamei. Viec phat hien sbm EHP la rat quan trong de quan ly benh hieu qua b cac co sb nuoi trong thuy san. Nghien cmi nay nham muc dich phat then mot phuong phap chan doan nhanh, nhay va dac hieu de phat hien EHP b quan the tom bang each sir dung PSR do man. Xet nghiem PSR dirge tbi mi hba ve nhiet do va thbi gian phan ung, vbi ket qua cho thay dieu kien tbi mi b 65°C trong 30 phut.

Tinh dac hieu cua bo moi PSR da dirge xac nhan bang thu nghiem chbng lai cac mam benh thuy sinh khac nhau. cho thay khong co phan img cheo. Ngoai ra, gibi han phat hien ciia xet nghiem PSR dirge xac dinh la thap nhat la mot ban sao cho moi phan img. Viec danh gia xet nghiem PSR bang each sir dung cac mau tom lam sang cho thay ket qua day hira hen, vbi phuong phap PSR do man true tiep cho thay do nhay va do dac hieu 100% so vbi xet nghiem PCR truyen thong.

Dieu quan trong la xet nghiem PSR khong yen cau trich xuat DNA nen phii hop de phat hien tai cho b cac trang trai nuoi tom. Tom lai, xet nghiem PSR do mau dirge phat trien cung cap mot phuong phap nhanh chbng va dang tin cay de phat hien EHP trong quan the tom. Cach tiep can nay mang lai mot sb mi diem, bao gbm tinh don gian, do nhay va hieu qua ve chi phi, khien no trb thanh mot ebng cu co gia tri de quan ly dich benh trong nuoi torn. TONG QUAN TAI Ll£U 1.

Tong quan ve benh do vi bao hr trung E. Khai quat ve benh EHP EHP la mot benh pho bien anh hudng den tom. dac biet la tom the. Day la mot benh nhiem khuan gay ra bdi cac vi khuan hoac vi nit.

dan den su phat then ciia cac te bao bi nhiem thing trong gan va tuy cua tom1-3. Dudi kinh hien vi, cac to chirc nhiem thing thudng xuat hien nhu cac can true tron hoac oval cd man trang, tuong tir nhu tiii hoac can4 5. Cac trieu chimg cua EHP cd the bao gdm str giam sire khang, su yen dudi. va mat kha nang sinh san d tom3.

Benh nay cd the gay ra ty le tir vong cao va anh hudng den hien suat san xuat trong nganh nudi tom6. De dieu tri va kiem soat benh EHP, cac bien phap nhu sir dung khang sinh, ap dung cac bien phap quan ly moi trudng nudi trong, va phdng tranh su lay lan ciia benh tir nhung khu lire nhiem thing cd the duoc thuc hien4 5. Dong thdi, viec nghien cuu va phat trien cac bien phap phdng tranh va dieu tn tien bo la rat quan trong de giam thieu tac dong cua EHP doi vdi nganh nudi tom3. Tac nhan gay benh Vi bao tir thing EHP la ky sinh tiling thuoc chi Candidatus Hepatobacter penaei, gay ra benh EHP tren tom5.

Dudi kinh hien vi, chimg xuat hien dudi dang cac cau true tron hoac oval, cd man trang va thudng tao thanh cac te bao bao tir tren md gan va tuy ■ tom cua. Vi bao tir thing EHP la nhung vi sinh vat cd kich thudc nhd. khong the nhin thay bang mat thudng va thudng chi cd the duoc quan sat dudi kinh hien vi. 9 Chimg thudng tao thanh cac te bao bao tir tren md gan va tuy ciia tom, gay ra cac then chimg va tac dong tieu cue ddi vdi sire khde va hieu suat san xuat ciia tom6.

Co die gay benh Co che gay benh ciia EHP van chua duoc hieu rd hoan toan. nhung cd co che dua tren cac nghien cuu va quan sat ciia benh tren tom: 1 - Nhiem tiling qua dudng nude: EHP thuang nhiem tiling tom thong qua dudng nude, khi tom tiep xue voi nude chua vi khuan hoac vi nit EHP. Cac vi khuan hoac vi nit nay co the duoc sinh san va phat hien trong mo gan va tuy cua tom10. - Phat then te bao bao tu: EHP gay ra su phat trien cua cac te bao bao tu hen mo gan va tuy cua tom.

Cac te bao nay thuang xuat hien dudi dang cac can true trdn hoac oval, co mau hang va cd the gay ra su ton thuang va chuc nang khong hieu qua ciia cac co quan nay9. - Anli hudng den sue khde cua tom: Cac te bao bao hr phat then tu vi khuan hoac vi nit EHP cd the gay ra su yen dudi ciia tom. giam sue khang, mat can nang va giam hieu suat san xuat11. - Tac dong lay lan trong trai nudi tom: Khi mot so tom trong moi trudng nudi tom bi nhiem tiling EHP, cd the xay ra su lay lan nhanh chdng ciia benh trong ca trai nudi, gay ra ty le tu vong cao va anh hudng den hieu suat san xuat12.

Trieu chung benh Benh EHP tren tom thuang khong hien nhien ngay hr dau va cd the khong duoc nhan biet cho den khi benh da phat trien den giai doan nang.