MỞ ĐẦU 1.Đặt vấn đề Nấm phân bố trên toàn thế giới và phát triển ở nhiều dạng môi trƣờng sống khác nhau,đa phần sống ở trên cạn,nhƣng một số loài lại chỉ tìm thấy ở môi trƣờng trong nƣớc. Dựa theo tỷ lệ giữa số loài nấm với số loài thực vật ở cùng một môi trƣờng, ngƣời ta ƣớc tính giới nấm có khoảng 1,5 triệu loài. Hiện nay có khoảng 80000 loài nấm đã đƣợc các nhà phân loại học phát hiện và định danh. Giới nấm ngày càng có ý nghĩa to lớn trong nền kinh tế quốc dân,trong khoa học cũng nhƣ trong vòng tuần hoàn vật chất.
Nấm đã đƣợc sử dụng trong dân gian từ hàng ngàn năm nay và một số có ý nghĩa rất quan trọng trong đời sống con ngƣời. Linh chi là loài dƣợc liệu đã đƣợc chứng minh có nhiều đặc tính quý,rất tốt cho phòng và chữa bệnh. Các chế phẩm từ nấm linh chi (Ganoderma) đƣợc dùng để hỗ trợ điều trị nhiều bệnh nhƣ bệnh gan,tiết niệu,tim mạch,ung thƣ,AIDS. Các hoạt chất tách chiết từ nấm lim xanh đƣợc dùng để hỗ trợ điều trị nhiều bệnh gan, tiết niệu,tim mạch,ung thƣ,AIDS và không gây dị ứng đối với cơ thể ngƣời và động vật.
Thanh hóa là tỉnh có diện tích rừng lớn, có khu bảo tồn Pù Hu, Quan Hóa, Mƣờng Lát, Thanh Hóa, Khu bảo tồn thiên nhiên Xuân Liên, Khu bảo tồn thiên nhiên rừng sến,. đây là tỉnh đƣợc đánh giá là có tính đa dạng sinh học rất cao, tại đây có chứa đựng nguồn lợi lớn giá trị kinh tế và giá trị trong nghiên cứu khoa học từ các loài động thực vật. Trong đó có nguồn lợi lớn về nấm và có thể sử dụng chúng làm nguyên liệu tốt cho các ngành công nghiệp thực phẩm, dƣợc phẩm. Nấ m Linh chi mo ̣c trên gỗ lim ngƣời ta thƣờng go ̣i là Nấ m Lim.
Trong tƣ̣ nhiên, nấ m Lim xanh mo ̣c ở nơi rƣ̀ng râ ̣m , ít ánh sáng , đô ̣ ẩ m cao và thƣờng xuấ t hiê ̣n vào mùa mƣa. Nấ m Lim xanh là loài thƣờng niên , tai nấ m chỉ phát triể n trong mô ̣t mùa. Vì vậ y số lƣơ ̣ng quầ n thể nấ m Lim xanh rấ t ha ̣n chế , Các hoạt chất từ Ganoderma lucidum có hiệu lực chống khối u cao, chúng đƣợc sử dụng trong điều trị ung thƣ: ƣng thƣ phổi, ung thƣ vú, ung thƣ dạ dày,. c 2 Do có chứa nhiều hoạt chất quý cùng với số lƣợng hạn chế và viê ̣c khai thác quá nhanh trong thời gian ng ắn đã dẫn đế n tình tra ̣ng nguy cấ p của loài nấ m này trong tự nhiên và đã đƣợc liệt kê vào danh sách loài cần đƣợc bảo tồn và nghiêm cấm khai thác - trích lu ̣c sách đỏ Việt Nam - 2007.
Để bảo tồn loài nấm này việc phân lập giữ giống và phát triển là rất cần thiết. Việc gây trồng các giống nấm đã đƣợc nghiên cứu ở Việt Nam từ những năm 80 của thế kỷ XVI tuy nhiên để đáp ứng nhu cầu dƣợc liệu của đất nƣớc hàng năm Việt Nam vẫn phải nhập hàng nghìn tấn nấm không kiểm định đƣợc chất lƣợng từ các nƣớc nhƣ Nhật Bản, Hàn Quốc, Triều Tiên, Trung Quốc và và một số lƣợng lớn nấm nhập khẩu theo con đƣờng không chính thống nhƣ hàng hóa sách tay mang về Việt Nam. Để phát triển các sản phẩm nấm của Việt Nam thành các sản phẩm chức năng có giá trị và đƣợc thực hiện ở quy mô lớn thì ngoài việc nuôi trồng theo phƣơng pháp truyền thống việc nhân nhanh sinh khối để tách các hoạt chất có giá trị là cần thiết. Việc thu hoạt chất có giá trị từ sinh khối là công nghệ mới đã đƣợc ứng dụng ở các nƣớc có trình độ sản xuất nấm tiên tiến nhƣ: Nhật, Hàn Quốc, Đài Loan,…tuy nhiên công nghệ này chƣa đƣợc nghiên cứu ở Việt Nam.
Bằng các nghiên cứu chúng tôi thấy phƣơng pháp này có nhiều tính ƣu việt nhƣ: Có khả năng kiểm soát đƣợc chất lƣợng, hàm lƣợng, thành phần hoạt chất do kiểm soát chặt chẽ đƣợc các điều kiện dinh dƣỡng và môi trƣờng nuôi cấy. Chính vì vậy chúng tôi đã thực hiện đề tài:“ Nghiên cƣ́u quy trình phân lập và nhân sinh khố i nấ m Lim xanh Ganoderma Lucidum thu thập tại Thanh Hóa”. Mục tiêu c ủa đề tài 1. Mục tiêu tổng quát Xây dựng thành công quy trình phân lập và nhân sinh khối nấm Lim xanh Ganoderma Lucidum thu thập tại Thanh Hóa.
Mục tiêu cụ thể - Xây dựng đƣơ ̣c quy trình phân lâ ̣p nấ m Lim xanh. - Xây dựng đƣợc quy trình nhân sinh khố i sơ ̣i nấ m Lim xanh trong dung ịchdlỏng. c 3 - Xây dựng đƣợc quy trình tách chiết polysaccharide từ dịch huyền phù nấm Lim xanh. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 1.
Ý nghĩa khoa học của đề tài - Giúp sinh viên củn g cố và hê ̣ thố ng la ̣i kiế n thƣ́c đã ho ̣c vào thƣ̣c tiễn. Đồng thời tiếp cận công tác nghiên cứu khoa học phục vụ cho việc nghiên cứu và công tác sau này. - Biế t đƣơ ̣c phƣơng pháp nghiên cƣ́u m ột vấn đề khoa học , xƣ̉ lý , phân tić h số liê ̣u, trình bày một báo cáo tốt nghiệp. Ý nghĩa thực tiễn - Kế t quả nghiên cƣ́u của đề tài giúp xây dƣ̣ng đƣơ ̣c quy trin ̀ h phân lâ ̣p và thu hoạt chất polysaccharide từ sinh khố i nấ m L im xanh Ganoderma Lucidum.
Góp phầ n bảo tồ n loài n ấm quý có giá trị của Việt Nam và ta ̣o nguồ n vâ ̣t liê ̣u có ý nghĩa trong công tác nghiên cứu nấm. - Phát triển và thƣơng mại hóa sản phẩm chức năng có giá trị. c 4 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Nấm Lim xanh.
Nguồ n gố c và phân loại nấm Linh xanh. * Nguồn gốc Linh Chi (Ganoderma) là loại nấm gỗ mọc hoang trong thiên nhiên, có hàng trăm các loài khác nhau, trong đó có 2 nhóm lớn là: Cổ Linh Chi và Linh Chi [12]. Linh Chi rất phong phú về chủng loại, ƣớc tính trên toàn thế giới có 200 loài Linh Chi. Riêng Trung Quốc có 84 loài, trong đó có 12 loài đƣợc dùng làm thuốc nhƣ Xích Linh Chi, Tử Linh Chi, Hắc Linh Chi [14],[16].
Theo sách bản thảo cƣơng mục của Lý Thời Trần (1959) thì đại danh y của Trung Quốc đã phân loại Linh Chi theo màu sắc thành 6 loại: Thanh chi hay Long chi: màu xanh, vị chua, tính bình, không độc. Hồng chi, Xích chi hay Đơn chi: màu đỏ vị đắng, tính bình, không độc. Hoàng chi hay Kim chi: màu vàng, vị ngot, tính bình, không độc. Bạch chi hay Ngọc chi: màu trắng, vị cay, tính bình, không độc.
Hắc chi hay Huyền chi: màu đen, vị mặn, tính bình, không độc. Tử chi hay Mộc chi: màu tím, vị ngọt, tính ôn, không độc. Trong đó nấm Lim xanh thuộc nhóm Hồng chi có tên khoa học là Ganoderma lucidum, Hồng Chi có loài mọc trên giá thể gỗ Keo, Bồ Đề, Phƣợng Vĩ,… có cả những loài mọc trên thân gỗ Lim đã mục, ngƣời ta gọi là nấm Lim xanh. * Phân loại Nấm Lim xanh có vị trí phân loại đƣợc thừa nhận rộng rãi hiện nay [6],[7].
Tên khoa học: Ganoderma lucidum Ngành: Eumycota Ngành phụ: Basidiamyctina Lớp: Hymenomycetes Lớp phụ: Hymenomycetidae Bộ: Aphyllophorales Họ: Ganodermataceae c 5 Họ phụ: Ganodermoidae Chi: Ganoderma 2. Đặc điểm thực vật và phân bố - Nấm Lim xanh là một trong những loại nấm phá gỗ, nó thƣờng ký sinh trên các cây gỗ lâu năm, một số loài cây chết mục, thƣờng gặp chúng trên cây Lim. Nấm thƣờng có ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Trong tự nhiên, nấm thƣờng chỉ có ở nơi rừng rậm, ít ánh sáng và có độ ẩm cao [12].
- Lim xanh có cấu tạo 2 phần: Phần cuống và mũ nấm. Cuống nấm biến dị rất lớn, từ rất ngắn (0,5cm), rất mảnh (0,2cm) cho đến dài cỡ hàng 5-10 cm hoặc rất dài 20-25cm. Cuống có thể đính ở bên hoặc đính gần tâm do quá trình lên tán mà thành. - Mũ nấm dạng thận - gần tròn, đôi khi xoè hình quạt hoặc ít nhiều dị dạng.
Trên mặt mũ có vân gợn đồng tâm và có tia rãnh phóng xạ, màu vàng nâu, vàng cam, đỏ cam, đỏ nâu, nâu tím hoặc nâu đen, nhẵn bóng nhƣ láng vecni. Kích thƣớc tán biến động từ 2 - 30cm, dày 0,8 - 2,5cm. - Thịt nấm dày từ 0,4 - 1,8cm, màu vàng kem, nâu nhạt. Nấm mềm, dai khi tƣơi và trở nên chắc cứng và nhẹ khi khô, đầu tận cùng của sợi phình hình chuỳ, màng rất dày đan khít vào nhau tạo thành lớp vỏ láng phủ trên mũ và bao quanh cuống [14].
Nấm Lim xanh đƣợc thu thập Nấm Lim xanh đƣợc nuôi trồng tại từ Thanh Hóa Trƣờng ĐH Nông Lâm Thái Nguyên Hình 2.1: Hình thái quả thể nấm Lim xanh thu nhận từ Thanh Hóa và nuôi trồng tại trƣờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên c 6 2. Thành phần các hoạt chất sinh học trong nấm Lim xanh Các nghiên cứu về thành phần hoá học của nấm Linh Chi đầu tiên đƣợc tiến hành vào đầu thế kỷ XX, khi các nhà khoa học nghiên cứu đến lớp vỏ láng của nấm và đã phát hiện các chất nhƣ: esgosterol, các enzyme phenoloxidase và peroxidase. Theo phân tích của G. Bing Lin thì thành phần hoá học của Ganoderma lucidum gồm các chất: Nƣớc(12 - 13%), cellulose (54 - 56%), lignin (13 - 14%), monosaccharide (4,5 - 5%), lipid (1,9 - 2,0%), protein (0,08 - 0,12%), sterol (0,14 - 0,16%), các nguyên tố vô cơ nhƣ: Ag, Br, Ca, Fe, K, Na, Mg, Mn, Zn, Bi…[12].
Hiện nay ngƣời ta đã tìm đƣợc các hoạt chất sinh học trong nấm Lim xanh nhƣ: Hoạt chất Beta–D-glucan,D-6,… trong nhóm polysaccharide và hoạt chất ganoderic acid, oleic acid, lucidenol,…trong nhóm triterpenoid [12]. Tác dụng của nấ m Lim xanh. Vai trò dƣợc lý của nấm Lim xanh rất lớn nhờ sự có mặt của các hoạt chất sinh học. Nấm Lim xanh đƣợc sử dụng nhƣ một dƣợc liệu quý, để chữa trị nhiều bệnh.
Cho đến nay, kết quả nghiên cứu dƣợc lý học hiện đại cho thấy, Lim xanh có tác dụng dƣợc lý khá phong phú. Tác dụng trên hệ tuần hoàn [19],[21],[22]. Tác dụng trên hệ miễn dịch và chống ung thƣ [25]. Chế phẩm nấm Lim xanh làm gia tăng quá trình sản xuất Interleukin-1 & 2, có tác dụng hạn chế sự phát triển của nhiều loại mô có hại [22].
Tác dụng phòng, chống bệnh tiểu đƣờng [21], cholesterol và đƣờng trong máu [19]. Làm giảm đƣờng huyết và điều chỉnh rối loạn lipid máu.