ĐẶT VẤN ĐỀ Ở nước ta, lâm sản ngoài gỗ có vai trò đặc biệt quan trọng đối với phát triển kinh tế - xã hội của đất nước. Mây là một trong những loài cây lâm sản ngoài gỗ có giá trị kinh tế cao. Nghề gây trồng, chế biến và kinh doanh các sản phẩm từ mây, đã tạo ra nhiều việc làm, tăng thu nhập, cải thiện đời sống cho người dân. Trong những năm gần đây, việc khai thác mây tự nhiên diễn ra quá mức, bất hợp lý, làm cho khu phân bố, cũng như trữ lượng mây còn không nhiều.
Nguồn mây nguyên liệu tự nhiên không còn đủ đáp ứng cho các cơ sở sản xuất để tạo các sản phẩm phục vụ cho nhu cầu sử dụng trong nước và xuất khẩu. Vì vậy hàng năm chúng ta phải nhập khẩu một lượng lớn mây nguyên liệu từ bên ngoài, chủ yếu từ Lào và Trung Quốc. Hiện nay, nhiều tỉnh trong cả nước đang có các chương trình mở rộng diện tích trồng mây nguyên liệu. Để nâng cao năng suất, giống tốt có vai trò cực kỳ quan trọng.
Giống mây nếp (C. tetradactylus Hance) đang được đánh giá là giống cho năng suất và giá trị kinh tế cao ở Việt Nam, được nhiều địa phương gây trồng. Với diện tích gây trồng mây ngày càng được mở rộng, nên thị trường đang có nhu cầu rất lớn về cây giống chất lượng cao. Trồng rừng nguyên liệu từ cây con thực sinh thường có hiện tượng phân li hữu tính, nên có sinh trưởng và phát triển, cũng như có số lượng và chất lượng các sản phẩm chuyên dụng không đồng đều.
Điều này đã ảnh hưởng không nhỏ tới việc gây trồng, chăm sóc, khai thác và chế biến. Việc áp dụng kỹ thuật tạo cây con bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào - phương pháp nhân giống sinh dưỡng tiên tiến nhằm chủ động tạo ra số lượng lớn cây giống có phẩm chất di truyền tốt và đồng đều, trong thời gian ngắn thực sự đang là việc làm cấp bách và đầy ý nghĩa. Với ý nghĩa như vậy, tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tạo cây con mây nếp (Calamus tetradactylus Hance) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro". TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.
Đại cương về nuôi cấy mô – tế bào 1. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô – tế bào thực vật Tính toàn năng cùng với sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào là cơ sở lý luận của kỹ thuật nuôi cấy mô – tế bào.Tính toàn năng (Totipotence) của tế bào Haberlandt (1902) là người đầu tiên đề xuất phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật để chứng minh tính toàn năng của tế bào. Theo ông, mỗi tế bào của bất kỳ cơ thể sinh vật nào đều mang lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả sinh vật đó, vì vậy khi gặp điều kiện thích hợp mỗi tế bào đều có thể phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh [2], [12]. Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô – tế bào thực vật.
Đến nay con người đã hoàn toàn chứng minh được khả năng tái sinh thành một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ. Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào Cơ thể thực vật trưởng thành là một chỉnh thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, trong đó có nhiều loại tế bào khác nhau thực hiện các chức năng cụ thể khác nhau. Tuy nhiên tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ tế bào phôi sinh. Quá trình phân hóa tế bào có thể biểu thị: Tế bào phôi sinh Tế bào giãn Tế bào phân hóa chức năng Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành mô chức năng chúng không hoàn toàn mất khả năng phân chia của mình.
Trong trường hợp cần thiết, điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và lại phân chia mạnh mẽ. Quá trình đó gọi là sự phản phân hóa tế bào, ngược lại với sự phân hóa tế bào. 3 Về bản chất thì quá trình phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt hóa phân hóa gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển của cá thể, có một số gen được hoạt hóa (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho ra tính trạng mới, một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động.
Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc phân tử ADN của mỗi tế bào. Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thường bị ức chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách riêng rẽ tế bào, gặp điều kiện thuận lợi thì các gen được hoạt hóa, quá trình phân hóa sẽ được xảy ra theo một chương trình đã định sẵn. Lịch sử phát triển nuôi cấy mô – tế bào thực vật 1.
Trên thế giới - Giai đoạn khởi xướng (1898 - 1930) Haberlandt (1902) – nhà sinh lý thực vật học người Đức là người đầu tiên đề xuất phương pháp nuôi cấy mô – tế bào thực vật để chứng minh tính toàn năng của tế bào. Theo ông, mỗi tế bào của bất kỳ cơ thể sinh vật nào đều mang lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả sinh vật đó, vì vậy khi gặp điều kiện thích hợp mỗi tế bào đều có thể phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh [12]. Tuy nhiên ông đã không thành công trong thí nghiệm nuôi cấy tế bào khí khổng. - Giai đoạn nghiên cứu sinh lý (1930 - 1950) Giai đoạn này bắt đầu năm 1934 với công trình của White (Mỹ).
Ông đã nuôi cấy thành công rễ cà chua (Lycopersicum esculanum) trên môi trưởng lỏng chứa muối khoáng, glucose và dịch chiết nấm men. Năm 1935, Thimann đã phát hiện ra Auxin (IAA) trong mô thực vật. Nhiều nhà nghiên cứu đã sử dụng IAA cùng các Vitamin bổ sung vào môi trường nuôi cấy và thu được kết quả tốt. Cũng trong thời gian này, Gautheret (Pháp) đã nghiên cứu nuôi cấy 4 mô tượng tầng một số cây thân gỗ.
Trong những năm 1940, nhiều chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm Auxin (NAA, 2,4D) được tổng hợp thành công và được nhiều nhà nghiên cứu sử dụng trong nuôi cấy mô cùng với nước dừa. Kết quả nghiên cứu cho thấy các chất này có tác dụng kích thích tạo mô sẹo, thúc đẩy tế bào phân chia rõ rệt [2]. - Giai đoạn nghiên cứu phát sinh hình thái (1950 - 1960) Năm 1954 – 1955, Skoog và Miller (Mỹ) trong khi nuôi cấy mô lõi cây thuốc lá đã xác định được vai trò của Kinetin trong sự kích thích phát triển của mô. Năm 1956, Skoog và Miller đã tìm hiểu ảnh hưởng của tỷ lệ Auxin/Cytokinin trong môi trường nuôi cấy đến sự hình thành cơ quan và tạo được chồi từ mô cây thuốc lá nuôi cấy.
Năm 1956, Nickell đã nuôi thành công tế bào đơn của đậu (Phaseolus vulgaris) trong dịch lỏng. Năm 1960, Bergman đã tái sinh tế bào đơn thuốc lá trong môi trường lỏng (còn gọi là kỹ thuật gieo tế bào) [2], [14]. - Giai đoạn triển khai nuôi cấy mô vào công nghệ sinh học thực vật (từ 1960 đến nay) Năm 1960, Cooking (Anh) đã dùng enzym Cellulase để phân hủy vỏ cellulose của tế bào thực vật và thu được các tế bào không vỏ, còn gọi là tế bào trần (protoplast). Nitsh (1967), Nakata và Tanaka (1968) tạo được cây thuốc lá đơn bội bằng cách nuôi cấy bao phấn.
Nakata và Tanaka (1970 - 1971) cho các protoplast thuốc lá tái tạo vỏ Cellulose, tế bào mới phân chia tạo nên quần lạc tế bào trong môi trường lỏng và sau đó tạo được cây hoàn chỉnh. Năm 1977, Melchers dung hợp protoplast giữa khoai tây và cà chua thành công tạo ra cây lai khoai tây – cà chua “Pomate”. Từ năm 1965, Ledoux cho rằng có thể gây ra biến dị di truyền ở tế bào, thậm chí ở hạt giống bằng cách cho chúng hấp thụ ADN ngoại lai, ADN 5 ngoại lai sau khi vào trong tế bào sẽ gắn với ADN nội bào. ADN ngoại lai vào trong tế bào thực vật, đặc biệt là trong tế bào trần, chúng không bị các nuclease của tế bào chủ phân hủy.
Từ năm 1980, hàng loạt nghiên cứu trong lĩnh vực công nghệ sinh học (công nghệ gen) đã được công bố. Ngày nay nuôi cấy mô – tế bào không những là cơ sở quan trọng của công nghệ sinh học hiện đại, là công cụ quan trọng trong chọn tạo và nhân giống hiện đại mà còn đóng góp những cơ sở lý luận mới cho sinh học hiện đại. Lịch sử phát triển của nuôi cấy mô – tế bào thực vật ở Việt Nam Nuôi cấy mô – tế bào thực vật được phát triển ở Việt Nam ngay sau khi chiến tranh kết thúc (1975). Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô – tế bào đầu tiên được xây dựng tại Viện Sinh vật học, viện Khoa học Việt Nam (KHVN) do PGS.
Lê Thị Muội đứng đầu. Phòng đã nghiên cứu các phương pháp nuôi cấy cơ bản trong điều kiện Việt Nam như nuôi cấy bao phấn, nuôi cấy mô sẹo và protoplast. Thành công đầu tiên về nuôi cấy bao phấn lúa và thuốc lá đã được công bố vào năm 1978 (Lê Thị Muội và cs, 1978; Lê Thị Xuân và cs. Tiếp đó là thành công về nuôi cấy protoplast ở thuốc lá và khoai tây (Lê Thị Muội và Nguyễn Đức Thành, 1978; Nguyễn Đức Thành và Lê Thị Muội, 1980, 1981).
Trong cùng thời gian, tại phân viện KHVN ở thành phố Hồ Chí Minh, Đại học Nông nghiệp I Hà Nội, viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam. các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô – tế bào được thành lập và chủ yếu tập trung vào vi nhân giống khoai tây. Đến nay, nước ta đã có rất nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô – tế bào ở các viện nghiên cứu (viện Di truyền Nông nghiệp, viện Rau quả Trung ương, .); các trường đại học (Đại học Nông nghiệp I, Đại học Lâm nghiệp, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh,.); một số tỉnh và cơ sở sản xuất 6 cây giống nông – lâm nghiệp (Yên Bái, Hưng Yên, Bình Định, Đà Lạt, Quảng Ninh, Hòa Bình, Phú Thọ,.) Đối tượng cây giống sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy mô – tế bào thực vật cũng được mở rộng như: bạch đàn, keo, dó trầm, lan, cúc,.Thành tựu nuôi cấy mô – tế bào thực vật Kỹ thuật nuôi cấy mô – tế bào thực vật đã thành công với hàng loạt các cây trồng như: cây ăn quả, cây lương thực, cây công nghiệp, cây thuốc, hoa. và các loại cây quý hiếm có giá trị cao.