Tổng quan nghiên cứu

Nhiễm virus viêm gan B (HBV) là một vấn đề y tế toàn cầu với khoảng 248 triệu người mang virus mạn tính, gây ra 30% bệnh nhân xơ gan và 53% trường hợp ung thư biểu mô tế bào gan (HCC). Ở Việt Nam, tỷ lệ nhiễm HBV mạn tính rất cao, ước tính hơn 10 triệu người mang HBV mạn tính, với tần suất HBsAg dương tính từ 15 đến 21%, có nơi lên đến 26%. Mặc dù đã có vaccine và các thuốc điều trị như Peg-IFN α-2a và các thuốc ức chế enzym phiên mã ngược đồng đẳng nucleoside (NAs), việc điều trị triệt để vẫn còn nhiều thách thức do sự tồn tại bền vững của covalently closed circular DNA (cccDNA) trong nhân tế bào gan.

Việc đánh giá hoạt tính phiên mã của cccDNA là rất quan trọng trong theo dõi và điều trị viêm gan B mạn tính. Tuy nhiên, việc đo trực tiếp cccDNA đòi hỏi sinh thiết gan, gây khó khăn trong thực hành lâm sàng. Pregenomic RNA (pgRNA) của HBV trong huyết tương được xem là dấu ấn sinh học tiềm năng phản ánh hoạt tính phiên mã của cccDNA, giúp dự báo đáp ứng điều trị và tiên lượng bệnh.

Mục tiêu nghiên cứu là xây dựng và tối ưu quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA huyết tương với độ nhạy cao trên bệnh nhân viêm gan B mạn tính đang điều trị bằng các đồng đẳng nucleoside tại Việt Nam. Nghiên cứu có phạm vi thực hiện trên 77 bệnh nhân viêm gan B mạn tính và 50 người khỏe mạnh làm nhóm chứng, nhằm cung cấp công cụ theo dõi hiệu quả điều trị và quản lý bệnh tại Việt Nam, góp phần giảm gánh nặng bệnh tật do HBV.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

  • Chu trình nhân lên của HBV: HBV là virus DNA sợi đôi không hoàn chỉnh, nhân lên qua trung gian pregenomic RNA (pgRNA) và enzyme phiên mã ngược polymerase. cccDNA trong nhân tế bào gan là khuôn mẫu phiên mã cho các RNA virus, trong đó có pgRNA, đóng vai trò quan trọng trong sự nhân lên và duy trì nhiễm HBV mạn tính.

  • Đặc điểm hệ gen HBV và đa dạng di truyền: Hệ gen HBV dài khoảng 3,2 kb, gồm các khung đọc mở (ORF) S, C, P, X mã hóa các protein cấu trúc và điều hòa. Sự đa dạng di truyền và đột biến ngẫu nhiên trong hệ gen HBV ảnh hưởng đến thiết kế mồi/probe cho kỹ thuật RT-qPCR, do đó vùng gen S đầu N-terminal được lựa chọn làm vùng đích ổn định và đặc hiệu để thiết kế mồi/probe.

  • Dấu ấn sinh học HBV pgRNA huyết tương: pgRNA trong huyết tương phản ánh hoạt tính phiên mã của cccDNA trong tế bào gan, là dấu ấn mới đầy hứa hẹn trong đánh giá đáp ứng điều trị và tiên lượng viêm gan B mạn tính.

Các khái niệm chính bao gồm: cccDNA, pgRNA, RT-qPCR, HBeAg, HBsAg, nucleos(t)ide analogues (NAs).

Phương pháp nghiên cứu

  • Đối tượng nghiên cứu: 77 bệnh nhân viêm gan B mạn tính (CHB) được chẩn đoán theo tiêu chuẩn HBsAg dương tính > 6 tháng, HBV DNA ≥ 10^5 copy/mL (HBeAg dương tính) hoặc ≥ 10^4 copy/mL (HBeAg âm tính), ALT tăng liên tục hoặc từng đợt. Nhóm chứng gồm 50 người khỏe mạnh và 5 bệnh nhân viêm gan C.

  • Thu thập và bảo quản mẫu: Mẫu máu ngoại vi 5 ml được lấy vào ống chứa EDTA, tách huyết tương bằng ly tâm 1500 g trong 10 phút, bảo quản ở -80°C. RNA được tách chiết từ 500 µL huyết tương bằng bộ kit QIAamp MinElute Virus Vacuum Kit, xử lý DNase I để loại bỏ DNA.

  • Thiết kế mồi và probe: Vùng gen S đầu N-terminal được lựa chọn dựa trên phân tích đa dạng di truyền và đột biến bằng phần mềm Clustalx và Oligo Primer Analysis Software. Mồi/probe được thiết kế theo nguyên tắc nhiệt độ nóng chảy, tỷ lệ GC, tránh tạo dimer và bắt cặp nhầm.

  • Xây dựng quy trình RT-qPCR: Sử dụng phản ứng một bước (one-step) RT-qPCR với thành phần gồm buffer, enzyme RTase, mồi, probe, dUTP và AmpErase uracil N-glycosylase (UNG) để chống nhiễm chéo. Chu trình nhiệt gồm bước phiên mã ngược (45-50°C, 10-40 phút), biến tính (95°C, 15 phút), 45 chu kỳ khuếch đại với các bước biến tính, gắn mồi và kéo dài.

  • Tối ưu hóa quy trình: Tối ưu nhiệt độ và thời gian phiên mã ngược, nhiệt độ gắn mồi (57°C và 63°C), thời gian gắn mồi (15 và 30 giây), nồng độ mồi (0,05-1 µM) và probe (0,1-0,2 µM). Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, độ lặp lại, độ chính xác và tính ổn định của bộ mẫu chuẩn RNA tổng hợp in-vitro.

  • Phân tích số liệu: Nồng độ HBV pgRNA được tính theo copy/mL huyết tương dựa trên đường chuẩn từ RNA tổng hợp. Độ lặp lại đánh giá qua delta Ct, độ chính xác qua hệ số biến thiên (CV ≤ 0,05). Tính ổn định mẫu chuẩn được đánh giá qua các mốc thời gian 2 tuần, 1, 2 và 3 tháng.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

  1. Thiết lập thành công quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA huyết tương với ngưỡng phát hiện 1,25 copy/phản ứng, ngưỡng định lượng 2,5 copy/phản ứng, độ nhạy cao trong dải 10^4 – 1,25 copy/phản ứng. Độ lặp lại tốt với delta Ct < 0,5 và CV ≤ 0,05.

  2. Vùng gen S đầu N-terminal được xác định là vùng bảo thủ, ổn định cho thiết kế mồi/probe, phù hợp với đa dạng di truyền HBV tại Việt Nam, đảm bảo tính đặc hiệu và hiệu quả khuếch đại.

  3. Bộ mẫu chuẩn RNA tổng hợp in-vitro có tính ổn định cao sau 3 tháng bảo quản ở -80°C, không có sự biến đổi đáng kể về Ct, đảm bảo độ tin cậy cho xét nghiệm định lượng.

  4. Đánh giá trên mẫu bệnh nhân CHB (n=77) cho thấy nồng độ HBV pgRNA huyết tương trung bình cao hơn đáng kể ở nhóm HBeAg dương tính so với nhóm HBeAg âm tính (p < 0,05), phù hợp với hoạt tính phiên mã cccDNA và mức độ nhân lên virus.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu phù hợp với các báo cáo quốc tế về vai trò của HBV pgRNA huyết tương như một dấu ấn sinh học phản ánh hoạt tính phiên mã của cccDNA, giúp đánh giá hiệu quả điều trị và tiên lượng bệnh. Việc lựa chọn vùng gen S đầu N-terminal làm vùng đích thiết kế mồi/probe đã khắc phục được khó khăn do đa dạng di truyền và đột biến của HBV, nâng cao độ đặc hiệu và độ nhạy của phản ứng RT-qPCR.

Độ ổn định của bộ mẫu chuẩn RNA tổng hợp in-vitro qua các mốc thời gian cho thấy quy trình có thể áp dụng lâu dài trong thực hành lâm sàng. So sánh nồng độ pgRNA giữa nhóm HBeAg dương tính và âm tính phản ánh đúng sinh học virus, đồng thời hỗ trợ việc theo dõi đáp ứng điều trị bằng các thuốc ức chế enzym phiên mã ngược.

Các biểu đồ đường chuẩn, biểu đồ so sánh nồng độ pgRNA giữa các nhóm bệnh nhân và bảng thống kê độ lặp lại, độ chính xác sẽ minh họa rõ ràng các kết quả trên, giúp người đọc dễ dàng hình dung và đánh giá chất lượng quy trình.

Đề xuất và khuyến nghị

  1. Áp dụng quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA huyết tương trong các cơ sở y tế để theo dõi hoạt tính virus và đánh giá hiệu quả điều trị viêm gan B mạn tính, đặc biệt ở bệnh nhân điều trị bằng nucleos(t)ide analogues. Thời gian triển khai: 6-12 tháng.

  2. Đào tạo kỹ thuật viên và cán bộ y tế về kỹ thuật RT-qPCR và phân tích kết quả pgRNA để đảm bảo chất lượng xét nghiệm và ứng dụng hiệu quả trong lâm sàng. Chủ thể thực hiện: các bệnh viện, trung tâm xét nghiệm. Thời gian: 3-6 tháng.

  3. Phát triển hệ thống quản lý dữ liệu xét nghiệm pgRNA tích hợp với các dấu ấn virus học khác như HBV DNA, HBsAg, HBeAg để xây dựng mô hình dự báo đáp ứng điều trị và tiên lượng bệnh. Thời gian: 12-18 tháng.

  4. Khuyến khích nghiên cứu tiếp theo mở rộng quy mô bệnh nhân và đa trung tâm để đánh giá vai trò của pgRNA trong các giai đoạn điều trị khác nhau, từ đó hoàn thiện hướng dẫn lâm sàng sử dụng dấu ấn này. Chủ thể: các viện nghiên cứu, trường đại học. Thời gian: 18-24 tháng.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

  1. Bác sĩ chuyên khoa gan mật và truyền nhiễm: Nắm bắt kỹ thuật và ý nghĩa của định lượng HBV pgRNA để cải thiện chẩn đoán, theo dõi và điều trị viêm gan B mạn tính.

  2. Kỹ thuật viên xét nghiệm y học phân tử: Học hỏi quy trình RT-qPCR tối ưu, kỹ thuật thiết kế mồi/probe và xử lý mẫu RNA huyết tương, nâng cao năng lực xét nghiệm.

  3. Nhà nghiên cứu y sinh học và vi sinh vật học: Tham khảo phương pháp nghiên cứu, tối ưu kỹ thuật và ứng dụng dấu ấn sinh học mới trong nghiên cứu HBV và các virus khác.

  4. Quản lý y tế và hoạch định chính sách: Hiểu rõ tầm quan trọng của dấu ấn pgRNA trong quản lý bệnh viêm gan B, từ đó xây dựng chính sách xét nghiệm và điều trị phù hợp.

Câu hỏi thường gặp

  1. Tại sao cần định lượng HBV pgRNA thay vì chỉ HBV DNA?
    HBV pgRNA phản ánh hoạt tính phiên mã của cccDNA trong tế bào gan, trong khi HBV DNA chỉ thể hiện tải lượng virus hiện tại. pgRNA giúp đánh giá hiệu quả điều trị và dự báo tái phát khi ngừng thuốc.

  2. Quy trình RT-qPCR được tối ưu như thế nào để đạt độ nhạy cao?
    Quy trình được tối ưu về nhiệt độ và thời gian phiên mã ngược, nhiệt độ gắn mồi, nồng độ mồi và probe, sử dụng enzyme UNG để chống nhiễm chéo, đảm bảo phát hiện được nồng độ pgRNA thấp nhất 1,25 copy/phản ứng.

  3. Có thể áp dụng quy trình này ở các phòng xét nghiệm thông thường không?
    Quy trình sử dụng thiết bị RT-qPCR tiêu chuẩn và hóa chất thương mại, phù hợp với các phòng xét nghiệm có trang bị máy Realtime PCR và nhân viên được đào tạo bài bản.

  4. Nồng độ pgRNA có thay đổi theo giai đoạn điều trị không?
    Có, nồng độ pgRNA giảm khi điều trị hiệu quả bằng NAs nhưng không biến mất hoàn toàn do cccDNA tồn tại. Sự biến động pgRNA giúp đánh giá đáp ứng và dự báo tái phát.

  5. Tại sao vùng gen S đầu N-terminal được chọn làm vùng đích thiết kế mồi/probe?
    Vùng này có tính bảo thủ cao, ít biến dị và đột biến, đảm bảo tính đặc hiệu và hiệu quả khuếch đại trong đa dạng di truyền HBV tại Việt Nam, giúp kết quả định lượng chính xác.

Kết luận

  • Đã thiết lập và tối ưu thành công quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA huyết tương với độ nhạy cao, độ chính xác và tính ổn định tốt.
  • Vùng gen S đầu N-terminal được xác định là vùng đích phù hợp cho thiết kế mồi/probe trong xét nghiệm pgRNA.
  • Nồng độ pgRNA huyết tương phản ánh hoạt tính phiên mã cccDNA, có giá trị trong theo dõi và đánh giá đáp ứng điều trị viêm gan B mạn tính.
  • Quy trình có thể ứng dụng trong thực hành lâm sàng tại Việt Nam, góp phần nâng cao hiệu quả quản lý và điều trị bệnh nhân viêm gan B.
  • Đề xuất triển khai đào tạo, áp dụng rộng rãi và nghiên cứu mở rộng để hoàn thiện hướng dẫn sử dụng dấu ấn pgRNA trong lâm sàng.

Hành động tiếp theo: Các cơ sở y tế và phòng xét nghiệm nên phối hợp triển khai quy trình này, đồng thời tiếp tục nghiên cứu ứng dụng để nâng cao chất lượng chăm sóc bệnh nhân viêm gan B mạn tính.