Nghiên cứu xác định một số diamin trong nước tiểu bằng phương pháp LC-MS/MS

Luận văn trình bày quy trình xác định một số diamin trong nước tiểu bằng phương pháp LC-MS/MS. Bao gồm khảo sát điều kiện và đánh giá phương pháp.

• Tác giả: Tống Thị Ngân
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Thị Ánh Hường
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Hóa Phân tích
• Đề tài: Nghiên cứu xác định một số diamin trong nước tiểu bằng phương pháp LC-MS/MS
• Loại tài liệu: Luận văn Thạc sĩ Khoa học
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan về phương pháp LC MS MS xác định diamin

Phương pháp LC-MS/MS (Sắc ký lỏng ghép nối khối phổ hai lần) là một công nghệ hiện đại được sử dụng rộng rãi trong phân tích hóa học, đặc biệt trong lĩnh vực xác định diamin trong nước tiểu. Phương pháp này kết hợp ưu điểm của sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với khả năng phát hiện chọn lọc của khối phổ tandom, cho phép xác định các chất có nồng độ rất thấp với độ chính xác cao. Các diamin như HDA (1,6-Hexamethylene diamine), MDA (Methylenedianiline) và IPDA (Isophorone diamine) là những chất được sản sinh khi cơ thể tiếp xúc với isocyanat trong môi trường làm việc, đặc biệt là ngành sơn ô tô. Việc xác định nồng độ các diamin này trong nước tiểu giúp đánh giá mức độ tiếp xúc với các hóa chất nguy hiểm này, hỗ trợ giám sát sức khỏe công nhân.

1.1. Khái niệm và nguyên lý phương pháp LC MS MS

LC-MS/MS hoạt động theo nguyên lý tách chiết các chất trong dung dịch qua cột sắc ký lỏng, sau đó ionize và đo lường khối lượng của các ion được tạo ra. Phương pháp này có khả năng phân biệt chọn lọc giữa các chất có cấu trúc tương tự, giúp tăng độ đặc hiệu. Với ưu điểm về độ nhạy cao, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) rất thấp, phương pháp này trở thành lựa chọn tối ưu cho phân tích các diamin có nồng độ dấu vết trong mẫu sinh học.

1.2. Ứng dụng trong xác định diamin từ tiếp xúc isocyanat

Các công nhân sơn ô tô thường tiếp xúc với isocyanat (HDI, MDI, IPDI) qua đường hô hấp hoặc da. Cơ thể chuyển hóa các hóa chất này thành các diamin tương ứng và đào thải chúng qua nước tiểu. Bằng cách xác định nồng độ diamin trong nước tiểu, các nhà chuyên gia có thể đánh giá mức độ tiếp xúc, từ đó có biện pháp bảo vệ sức khỏe công nhân hiệu quả hơn.

II. Quy trình xử lý mẫu nước tiểu

Quy trình xử lý mẫu là bước quan trọng quyết định độ chính xác của kết quả xác định diamin bằng LC-MS/MS. Mẫu nước tiểu chứa nhiều chất mục tiêu ở nồng độ thấp, do đó cần phải được tập trung và làm sạch trước khi phân tích. Các phương pháp xử lý mẫu phổ biến bao gồm chiết pha rắn (SPE) với cột trao đổi cation mạnh (SCX), giúp loại bỏ các chất gây nhiễu và nâng cao độ nhạy của phương pháp. Việc lựa chọn dung môi rửa giải phù hợp và thời gian ủ mẫu tối ưu là những yếu tố then chốt ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi và tính chất lượng của kết quả phân tích.

2.1. Phương pháp chiết pha rắn SPE

Chiết pha rắn (SPE) là kỹ thuật được áp dụng để loại bỏ chất cản trở trong nước tiểu trước khi phân tích. Cột trao đổi cation mạnh (SCX) giữ lại các diamin (có tính chất kiềm) trong khi các chất khác đi qua. Sau đó, sử dụng dung môi thích hợp để giải phóng diamin từ cột, thu được dịch trích sạch sẽ, có nồng độ diamin cao hơn so với mẫu gốc.

2.2. Điều kiện tối ưu cho xử lý mẫu

Nghiên cứu đã khảo sát nhiều điều kiện như thời gian ủ mẫu, nhiệt độ, pH dung dịch, và thành phần dung môi rửa giải. Những kết quả cho thấy việc tối ưu hóa quy trình xử lý giúp tăng đáng kể hiệu suất thu hồi (recovery) của các diamin HDA, MDA, IPDA, từ đó cải thiện độ chính xác của kết quả phân tích toàn bộ.

III. Các điều kiện phân tích LC MS MS tối ưu

Để đạt được kết quả xác định diamin chính xác và đáng tin cậy, cần phải tối ưu hóa các thông số LC-MS/MS bao gồm cột tách, pha động, và các điều kiện khối phổ. Lựa chọn cột sắc ký phù hợp với đặc tính của diamin là bước đầu tiên, thường sử dụng cột reverse-phase C18. Thành phần pha động gồm acetonitril (ACN) và nước chứa axit (HFBA 0,1%) được khảo sát để tìm tỉ lệ tối ưu, giúp đạt được thời gian lưu trữ phù hợp và độ phân giải tốt giữa các chất. Các thông số khối phổ như năng lượng ion hóa, điện áp tăng tốc, và chế độ xát trừ được tinh chỉnh để tối đa hóa tín hiệu từ các diamin.

3.1. Lựa chọn cột tách và pha động

Cột sắc ký C18 là lựa chọn phổ biến cho phân tích diamin, cho phép phân tách tốt các hợp chất có cấu trúc tương tự. Pha động kết hợp acetonitril và nước axit được tối ưu về tỉ lệ để đạt được gradient elution tối ưu, giúp các diamin được tách chiết và phát hiện hiệu quả nhất trên các máy detektor khối phổ.

3.2. Thông số khối phổ và giới hạn phát hiện

Các thông số MS/MS được thiết lập để phát hiện ion phân tử của HDA, MDA, IPDA và các ion mảnh vỡ đặc trưng của chúng. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) được xác định thông qua đường chuẩn, cho phép phương pháp này phát hiện diamin ở nồng độ dấu vết, đáp ứng yêu cầu giám sát sức khỏe công nhân.

IV. Thẩm định phương pháp và ứng dụng thực tế

Thẩm định phương pháp phân tích là bước bắt buộc để đảm bảo chất lượng kết quả xác định diamin. Các tiêu chí thẩm định bao gồm độ lặp lại (precision), hiệu suất thu hồi (recovery), tuyến tính (linearity), và độ chính xác (accuracy). Nghiên cứu đã chứng minh rằng phương pháp LC-MS/MS có độ lặp lại tốt với độ lệch chuẩn tương đối (RSD) thấp, và hiệu suất thu hồi của các diamin dao động từ 90-110%, đáp ứng các tiêu chuẩn quốc tế. Ứng dụng thực tế của phương pháp này trong xác định nồng độ HDA, MDA, IPDA trong mẫu nước tiểu của công nhân sơn ô tô đã giúp đánh giá mức độ tiếp xúc isocyanat và hỗ trợ giám sát sức khỏe công nhân một cách khoa học.

4.1. Các tiêu chí thẩm định phương pháp

Độ lặp lại được đánh giá bằng cách phân tích mẫu nhiều lần tính toán RSD; Tuyến tính được xây dựng từ đường chuẩn với nồng độ từ thấp đến cao; Hiệu suất thu hồi được kiểm tra bằng cách thêm chuẩn vào mẫu trước và sau xử lý. Tất cả các tiêu chí này đều đạt yêu cầu, chứng minh phương pháp LC-MS/MS tin cậy để xác định diamin.

4.2. Ứng dụng trong giám sát sức khỏe công nhân

Xác định diamin trong nước tiểu của công nhân sơn ô tô là ứng dụng thực tế quan trọng để đánh giá tiếp xúc isocyanat. Các kết quả phân tích giúp xác định công nhân có mức tiếp xúc vượt quá các chỉ số tiếp xúc sinh học (BEI) được khuyến nghị, từ đó có biện pháp bảo vệ sức khỏe thích hợp và ngăn ngừa các bệnh nghề nghiệp liên quan đến hóa chất nguy hiểm.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1. Giới thiệu về isocyanat Isocyanat là tên gọi chung của các hợp chất hóa học có chứa một hoặc nhiều nhóm – NCO (nitơ, cacbon, oxy) liên kết với một gốc hữu cơ, được viết tắt là R- NCO. Isocyanat có thể được phân loại theo số lượng nhóm isocyanat (NCO) gắn với gốc tự do, kết quả tạo ra có monoisocyanat, diisocyanat, triisocyanat,. bản chất của các gốc hữu cơ có thể là hợp chất thơm, aliphatic hoặc alicyclic.

Trong thực tế, nhóm hợp chất isocyanat chứa 1 nhóm NCO rất ít được sử dụng. Thông thường, thuật ngữ isocyanat được đề cập đến tất cả các chất hóa học có chứa hai hoặc nhiều nhóm -NCO như diisocyanat hoặc polyisocyanat. Diisocyanat gồm 2 nhóm N=C=O kết hợp với một hợp chất thơm hoặc hợp chất béo. Các diisocyanat cũng dễ dàng phản ứng với các hợp chất chứa các nguyên tử hydro hoạt động, do đó chúng dễ dàng phản ứng với nước, rượu, amin để tạo thành dime hoặc trime.

Oligome (còn gọi là polyisocyanat, tiền polyme, hoặc homopolyme) thường bao gồm một hỗn hợp các đồng phân của các phân tử có chứa hai hoặc nhiều nhóm NCO. Các sản phẩm thương mại được sử dụng trong nhiều quy trình sản xuất thường được tạo thành từ diisocyanat và oligome. Các isocyanat thương mại chính được sử dụng bao gồm methylene diphenyl diisocyanat (MDI), hexamethylene diisocyanat (HDI), isophorone diisocyanat (IPDI), các polymer và tiền polymer của chúng. Isocyanat được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp in, sơn phủ bề mặt dưới dạng tạo các hợp chất urethane hoặc polyurethane, đặc biệt trong công nghệ sơn phủ sử dụng sơn hai thành phần.

Một số loại isocyanat thường gặp ➢ MDI: Diphenylmethane diisocyanat Công thức hóa học: 3 Hình 1. Công thức cấu tạo của MDI - MDI tinh khiết là dạng rắn ở nhiệt độ phòng. - Nóng chảy ở 38oC - pKa = 3,92 - MDI lỏng có màu vàng, mùi nhẹ. Ứng dụng của MDI - MDI được sử dụng trong các sản phẩm như nhựa nhiệt dẻo polyuretan, sợi, keo, lớp phủ bề mặt, lốp, bánh xe công nghiệp, đế giày,.

- Các sản phẩm bằng nhựa polyme MDI phù hợp cho nhiều ngành công nghiệp, sản xuất và đặc biệt sử dụng cho tấm cách nhiệt tủ lạnh, trang trí nội thất ô tô và chỗ ngồi, vật liệu xây dựng, công nghiệp sơn, keo dán, chất kết dính, bao bì, đồ nội thất. ➢ HDI : Hexamethylene diisocyanat Công thức hóa học Hình 1. Công thức cấu tạo của 1,6 hexamethylene diisocyanat (HDI) - Hexamethylene diisocyanat (HDI) là một chất lỏng không màu hoặc hơi vàng. - Khối lượng riêng 1,05 g/cm3 (ở 25oC).

- Áp suất hơi: 0,7 Pa (ở 20oC. - Nhiệt độ nóng chảy -67oC. - pKa = 10,51 4 Ứng dụng của HDI - HDI không được sử dụng như các monomer mà được sản xuất trong công nghiệp như một loại polymer. Hơn nữa HDI có thể được chế biến trong công nghiệp với các polyol để tăng trọng lượng phân tử.

Những sản phẩm này thường chỉ chứa 0,5% HDI monomer, chúng được sử dụng trong công nghiệp làm chất phủ bề mặt rất tốt. Ngoài dùng cho các loại sơn thì HDI còn được cho vào các chất bịt kín, chất kết dính. ➢ IPDI: Isophorone diisocyanat Công thức hóa học: Hình 1. Công thức cấu tạo của IPDI - IPDI tinh khiết là lỏng màu vàng ở nhiệt độ phòng.

- Nóng chảy ở 60oC. - pKa = 10,54 - IPDI lỏng có màu vàng, mùi hăng. Ứng dụng của IPDI Sử dụng trong sản xuất nhựa polyester / polyurethane để sử dụng làm thành phần của lớp phủ sử dụng trên nền kim loại và các bề mặt tiếp xúc với thực phẩm sử dụng nhiều lần. Ảnh hưởng của isocyanat Mức độ ảnh hưởng của isocyanatđến sức khỏe người lao động phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nồng độ tiếp xúc, thời gian tiếp xúc, con đường tiếp xúc.

+ Ảnh hưỡng mãn tính Isocyanatlà chất kích ứng và nhạy cảm mạnh với da và đường hô hấp. Chúng có thể gây ra nhiều loại bệnh khác nhau cho phổi và cơ quan hô hấp, đặc biệt là hen phế quản nghề nghiệp (Occupational Asthma – OA) có thể biểu hiện sau vài tháng hoặc nhiều năm tiếp xúc. Các triệu chứng ngay lập tức xuất hiện nếu người bị bệnh tiếp xúc với isocyanatdù ở nồng độ rất nhỏ. Ngày nay, isocyanatlà nguyên nhân hàng đầu của bệnh hen phế quản nghề nghiệp ở các nước công nghiệp hóa, tất cả các nhóm chức isocyanattừ monomer đến oligomer đều góp phần gây bệnh [24].

Ảnh hưởng sức khỏe khi tiếp xúc isocyanatbao gồm kích ứng da, mắt, đau thắt ngực, thở khó khăn,[3, 4, 19, 23] nổi mề đay, chàm tiếp xúc. Theo tổ chức nghiên cứu ung thư quốc tế (IARC) 2,4-TDI và 2,6-TDI được phân loại là chất có khả năng gây ung thư ở người và được biết là gây ra ung thư ở động vật. Các ảnh hưởng chính tới sức khỏe con người của isocyanatthường được nhắc đến là gây hen phế quản nghề nghiệp và các vấn đề về phổi khác, cũng như kích thích mắt, mũi, cổ họng và da. + Ảnh hưởng cấp tính Tất cả các isocyanatgây kích ứng da (đỏ, khô, chàm) có thể đạt đến mức bỏng độ 3.

Một số nghiên cứu cũng báo cáo viêm da dị ứng do tiếp xúc. Tiếp xúc với hơi và bình xịt làm mắt kích ứng biểu hiện bằng chảy nước mắt, cảm giác nóng bỏng hoặc thậm chí là viêm kết mạc, cùng với kích ứng ở đường hô hấp trên gây đau họng hoặc chảy nước mũi. Nồng độ trong không khí cao có thể gây ra mắt và mũi bị kích ứng. Tiếp xúc ở mức cao như trường hợp sự cố đổ tràn có thể gây kích ứng phế quản xuất hiện như hội chứng rối loạn chức năng đường hô hấp, kích ứng phế nang và chứng phù nề phổi, triệu chứng có thể xuất hiện trong vòng 48 giờ sau khi tiếp xúc.

Tiếp xúc, con đường xâm nhập, các chất chuyển hóa và đào thải khi tiếp xúc HDI, MDI, IPDI 1.1 Tiếp xúc, con đường xâm nhập Các ngành nghề chính tiếp xúc với isocyanat bao gồm ngành sơn ô tô, xe máy, sản xuất tạo lớp phủ bề mặt, bọt polyuretan, keo dán, nhựa, chất đàn hồi, chất kết dính và chất bịt kín … isocyanat xâm nhập vào cơ thể chủ yếu qua 2 con đường: Hô hấp: Hầu hết các phơi nhiễm xảy ra khi hít phải, diisoxyanat dễ hấp thu qua đường hô hấp. Tổng lượng hấp thu đường hô hấp được ước tính là 99% ở chuột và 97% ở người khi thở bằng mũi. Dự đoán sự hấp thu hô hấp của con người giảm xuống 87% trong điều kiện thở bằng miệng. Tốc độ hấp thu của HDI hít vào đường thở ở người được ước tính cao hơn chuột [27].

Tiếp xúc da và mắt: isoxyanat xâm nhập vào cơ thể con người qua đường da và mắt thường ở dạng hơi và sol khí. Khi tiếp xúc HDI qua da gây ra viêm da tiếp xúc dị ứng, nghiên cứu cho thấy rằng khoảng 90% HDI biến mất khỏi bề mặt da trong vòng 30 phút khi tiếp xúc với HDI trong etyl axetat [30]. Các chất chuyển hóa và đào thải ❖ HDA: Hexamethylene diamine Hình 1. Công thức cấu tạo của HDA HDA có công thức phân tử: C6H16N2 Khối lượng phân tử: 116.208 g·mol−1 pKa = 10,51 Tan tốt trong nước Khi xâm nhập vào cơ thể người, hexamethylene diisocyanat(HDI) chuyển hóa thành Hexamethylene diamine HDA trong mẫu nước tiểu [20, 17].

Theo nghiên cứu của tác giả Mirmohammadi và các cộng sự (2011) cho thấy mối tương quan chặt chẽ giữa nồng độ HDI trong không khí và nồng độ HDA trong nước tiểu r = 0,857 [20] ( nghiên cứu trên 40 công nhân). Hội nghị các nhà vệ sinh công nghiệp của Chính 7 phủ Mỹ (ACGIH) đã đề xuất chỉ số giám sát sinh học cho người lao động có tiếp xúc nghề nghiệp với 1,6-hexamethylen diisocyanat(HDI) là 1,6-hexamethyllen diamine (HDA) niệu ≤ 15 µg/g creatinine [5] (mẫu nướ1.4c tiểu cuối ca làm việc). Thời gian bán hủy của HDI trong mẫu nước tiểu khoảng 2,5 giờ [31]. Tỉ lệ chuyển hóa của HDI tạo amin tương ứng là 39% sau 2 giờ tiếp xúc.

Sơ đồ chuyển hóa khi tiếp xúc với HDI được trình bày trong hình 1. Sơ đồ sản phẩm chuyển hóa của 1,6 Hexametylen diisoxyanat trong cơ thể người 8 Hình 1.4 cho thấy con đường chuyển hóa chính của HDI trong cơ thể. Sau khi được hấp thu vào cơ thể, 1,6-Hexamethylene diamine (HDI) phản ứng với các nhóm protein như amin, hydroxyl, và thiol HDI có thể được thủy phân ngay thành HDA (5); hoặc có thể tạo thành các sản phẩm trung gian như monoacetyl-HDA thông qua N-acetyltransferase (NAT) (6) [33]. Monoacetyl-HDA có thể tạo thành diacetyl- HDA thông qua NAT (7), hoặc oxy hóa qua CYP450/FMO (8,9,3A) để tạo thành N - hydroxyamine và hợp chất nitroso.

Các chất trung gian này có thể phản ứng với các nhóm thiol trên protein để tạo thành các sản phẩm bổ sung HDA hoặc HDA đã được acetyl hóa. HDA cũng có thể được chuyển hóa thành mono- và diacetylated- HDA bằng cách N -acetylation từ N -acetyltransferase. Các hợp chất này sau đó được đào thải qua nước tiểu. Quá trình acetyl hóa nhanh của HDA sẽ làm tăng lượng diacetyl-HDA trong nước tiểu trong khi quá trình acetyl hóa chậm sẽ dẫn đến lượng monoacetyl HDA (3A) tự do hoặc protein cao hơn.

Nghiên cứu của Wikman (2002) đã chỉ ra rằng những công nhân tiếp xúc HDI có acetyl chậm NAT1 có nguy cơ phát triển hen suyễn gấp 2,5 lần [33]. ❖ MDA: 4,4’-diphenylmethane diamine Hình 1. Công thức cấu tạo của MDA MDA có công thức phân tử: C13H14N2 Khối lượng phân tử: 198,27 g/mol pKa = 3,92 Tan ít trong nước Thuộc nhóm 2B chất gây ung thư Khi xâm nhập vào cơ thể người đặc biệt là hấp thụ qua da, methylene diphenyl diisocyanat (MDI) chuyển hóa thành 4,4’-diphenylmethane diamine (MDA) trong nước tiểu [7, 12, 5]. Hệ số tương quan cao giữa nồng độ MDI trong không khí và nồng độ MDA trong mẫu nước tiểu có r = 0,755.

Hội nghị các nhà vệ sinh công 9 nghiệp của Chính phủ Mỹ (ACGIH) đã đề xuất chỉ số giám sát sinh học cho người lao động có tiếp xúc nghề nghiệp với methylene diisocyanat (MDI) là 4,4’- diphenylmethane diamine (MDA) niệu ≤ 10 µg/g creatinine [5] (mẫu nước tiểu cuối ca làm việc). Thời gian bán hủy của MDI trong mẫu nước tiểu khoảng 2,5 giờ [31]. ❖ IPDA: isophorone diamine Hình 1. Công thức cấu tạo của IPDA IPDA có công thức phân tử: C10H22N2 Khối lượng phân tử: 170,30 g/mol pKa = 10,54 Khi xâm nhập vào cơ thể người đặc biệt là hấp thụ qua da, isophorone diisocyanat (IPDI) chuyển hóa thành isophoronediamine (IPDA) trong nước tiểu [31].

Thời gian bán hủy của IPDI trong mẫu nước tiểu khoảng 2,8 giờ [31]. Tỉ lệ chuyển hóa của IPDI tạo amin tương ứng là 27% sau 2 giờ tiếp xúc [31]. Hiện tại chưa có tiêu chuẩn giám sát sinh học cho chất này.