Luận Văn Thạc Sĩ: Phương Pháp Dự Đoán Và Ứng Dụng Trong Nhận Diện Khả Năng Ức Chế Gen Của siRNA

Luận văn thạc sĩ toán học nghiên cứu các phương pháp dự đoán và ứng dụng vào bài toán đoán nhận khả năng ức chế gen của sirna, khảo sát thực trạng, phân tích nguyên nhân, đề xuất

• Tác giả: Nguyễn Bá Quân
• Người hướng dẫn: TS. Bùi Ngọc Thăng
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội - Trường Đại học Công nghệ
• Chuyên ngành: Hệ thống thông tin
• Đề tài: Các phương pháp dự đoán và ứng dụng vào bài toán đoán nhận khả năng ức chế gen của siRNA
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU TỔNG QUAN VỀ ĐOẠN NGẮN RNA CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ (siRNA)
• 1.1. Can thiệp RNA
• 1.2. Các cơ chế, thành phần chính của RNAi. Vai trò của RNAi. Thành phần của RNAi
• 1.3. Nghiên cứu can thiệp RNA
• 1.3.1. Nghiên cứu siRNA. Lịch sử nghiên cứu siRNA. Chức năng của siRNA
• 1.3.2. Ứng dụng siRNA. Những thách thức trong nghiên cứu siRNA
• 2. CHƯƠNG 2: CÁC QUY TẮC THIẾT KẾ siRNA HIỆU QUẢ
• 2.1. Quy tắc thiết kế siRNA
• 2.2. Quy tắc thiết kế siRNA hiệu quả trong phương pháp sinh học. Các quy tắc thiết kế trong cách tiếp cận sinh học tính toán
• 3. CHƯƠNG 3: PHƢƠNG PHÁP DỰ ĐOÁN KHẢ NĂNG ỨC CHẾ CỦA siRNA
• 3.1. Tổng quan một số phương pháp xây dựng mô hình dự đoán ức chế của siRNA
• 3.2. Phương pháp máy vecto hỗ trợ (SVM- Support vector machine)
• 3.3. Phương pháp rừng ngẫu nhiên (Random Forest)
• 3.4. Sử dụng phương pháp học biểu diễn để nâng cao độ chính xác của các mô hình dự đoán
• 4. CHƯƠNG 4: THỰC NGHIỆM VÀ ĐÁNH GIÁ
• 4.1. Dữ liệu thực nghiệm và cài đặt
• 4.2. Thực nghiệm các phương pháp học máy dự đoán khả năng ức chế của siRNA
• 4.3. Đánh giá thực nghiệm
• 4.4. Những vấn đề được giải quyết trong luận văn. Công việc nghiên cứu trong tương lai
• 5. CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Phương pháp dự đoán

Phương pháp dự đoán là trọng tâm của luận văn, tập trung vào việc xây dựng các mô hình để dự đoán khả năng ức chế gen của siRNA. Các phương pháp học máy như Máy vecto hỗ trợ (SVM) và Rừng ngẫu nhiên (RF) được sử dụng để nâng cao độ chính xác của các mô hình dự đoán. Phân tích dữ liệu và tối ưu hóa siRNA là các bước quan trọng trong quá trình này. Luận văn cũng đề cập đến việc sử dụng học biểu diễn để cải thiện hiệu suất của các mô hình.

1.1. Mô hình dự đoán

Các mô hình dự đoán được xây dựng dựa trên các phương pháp học máy như SVM và RF. SVM sử dụng siêu phẳng với lề cực đại để phân loại dữ liệu, trong khi RF sử dụng nhiều cây quyết định để tăng độ chính xác. Các mô hình này được đánh giá dựa trên hiệu suất phân loại và khả năng dự đoán khả năng ức chế gen của siRNA.

1.2. Tối ưu hóa siRNA

Tối ưu hóa siRNA là quá trình cải thiện hiệu quả ức chế gen của siRNA thông qua việc điều chỉnh các tham số thiết kế. Các quy tắc thiết kế được xác định thông qua thực nghiệm sinh học và sinh học tính toán. Việc tối ưu hóa giúp tăng cường khả năng ức chế gen và giảm thiểu các tác dụng phụ không mong muốn.

II. Ứng dụng siRNA

Ứng dụng siRNA trong y học và công nghệ sinh học là một trong những mục tiêu chính của luận văn. siRNA được sử dụng để điều trị các bệnh như ung thư, viêm gan, và HIV thông qua việc ức chế các gen mục tiêu. Công nghệ sinh học đóng vai trò quan trọng trong việc phát triển các phương pháp điều trị mới dựa trên siRNA.

2.1. Ứng dụng trong y học

siRNA được sử dụng để điều trị các bệnh như ung thư, viêm gan, và HIV. Các nghiên cứu cho thấy siRNA có khả năng ức chế các gen liên quan đến sự phát triển của bệnh, từ đó giúp kiểm soát và điều trị bệnh hiệu quả. Tương tác gen và khả năng ức chế gen là các yếu tố quan trọng trong việc phát triển các liệu pháp điều trị.

2.2. Ứng dụng trong công nghệ sinh học

Công nghệ sinh học sử dụng siRNA để nghiên cứu và điều chỉnh các quá trình sinh học trong tế bào. siRNA được sử dụng để ức chế các gen cụ thể, giúp hiểu rõ hơn về chức năng của các gen và các quá trình sinh học liên quan. Điều này mở ra nhiều cơ hội mới trong nghiên cứu và phát triển các sản phẩm sinh học.

III. Khả năng ức chế gen

Khả năng ức chế gen của siRNA là yếu tố quyết định hiệu quả của các phương pháp điều trị và nghiên cứu. Luận văn tập trung vào việc phân tích và đánh giá khả năng ức chế gen của siRNA thông qua các phương pháp tính toán sinh học và thực nghiệm. Các yếu tố như tương tác gen và nhận diện gen được xem xét để cải thiện hiệu quả ức chế.

3.1. Tính toán sinh học

Tính toán sinh học được sử dụng để phân tích và dự đoán khả năng ức chế gen của siRNA. Các mô hình tính toán giúp xác định các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả ức chế gen, từ đó cải thiện thiết kế của siRNA. Phân tích dữ liệu và mô hình dự đoán là các công cụ quan trọng trong quá trình này.

3.2. Thực nghiệm

Các thí nghiệm thực tế được tiến hành để đánh giá khả năng ức chế gen của siRNA. Kết quả thực nghiệm được so sánh với các dự đoán từ mô hình tính toán để xác định độ chính xác và hiệu quả của các phương pháp dự đoán. Thực nghiệm cũng giúp xác định các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng ức chế gen của siRNA.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Can thiệp RNA (RNA interference - RNAi) là một cơ chế sinh học quan trọng giúp tế bào điều hòa biểu hiện gen thông qua các đoạn RNA ngắn, trong đó siRNA (short interfering RNA) đóng vai trò trung tâm trong việc ức chế gen mục tiêu. Theo ước tính, siRNA có kích thước khoảng 19-25 nucleotit và có khả năng làm giảm biểu hiện mRNA đích một cách hiệu quả, từ đó mở ra nhiều ứng dụng trong nghiên cứu y sinh và phát triển thuốc điều trị các bệnh như virus cúm, HIV, viêm gan B, ung thư. Tuy nhiên, việc thiết kế siRNA hiệu quả vẫn là thách thức lớn do hiệu quả ức chế gen của các siRNA khác nhau rất đa dạng, nhiều siRNA không hoạt động hoặc có hiệu quả thấp.

Mục tiêu nghiên cứu của luận văn là tổng hợp và phát triển các phương pháp dự đoán khả năng ức chế gen của siRNA, bao gồm việc tìm kiếm các quy tắc thiết kế siRNA hiệu quả và xây dựng mô hình dự báo dựa trên các kỹ thuật học máy như Support Vector Machine (SVM) và Random Forest (RF). Nghiên cứu tập trung trên dữ liệu thực nghiệm thu thập từ các bộ dữ liệu siRNA công bố, với phạm vi nghiên cứu chủ yếu tại Việt Nam trong giai đoạn 2010-2016, nhằm nâng cao độ chính xác dự đoán và hỗ trợ phát triển thuốc điều trị dựa trên siRNA.

Ý nghĩa nghiên cứu được thể hiện qua việc cải thiện khả năng lựa chọn siRNA có hiệu quả ức chế cao, giảm thiểu tác động sai mục tiêu, từ đó góp phần thúc đẩy ứng dụng RNAi trong y học và sinh học phân tử. Các chỉ số đánh giá như độ chính xác dự đoán, hệ số tương quan Pearson (R) và sai số bình phương trung bình (RMSE) được sử dụng để đo lường hiệu quả mô hình.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Cơ chế RNAi và siRNA: RNAi là quá trình phân hủy mRNA nhờ phức hợp RISC, trong đó siRNA đóng vai trò dẫn đường để nhận diện mRNA mục tiêu. Các thành phần chính gồm siRNA, enzyme Dicer và phức hợp RISC.

• Quy tắc thiết kế siRNA hiệu quả: Các đặc điểm sinh học như chiều dài siRNA, thành phần nucleotide, vị trí các bazơ A/U, tính chất nhiệt động học ảnh hưởng đến hiệu quả ức chế. Các quy tắc thiết kế được phát triển dựa trên phương pháp sinh học thực nghiệm và sinh học tính toán.

• Phương pháp học máy trong dự đoán siRNA: Sử dụng các thuật toán như Support Vector Machine (SVM) và Random Forest (RF) để xây dựng mô hình dự báo khả năng ức chế gen của siRNA dựa trên các đặc trưng trình tự và tính chất nhiệt động học.

Các khái niệm chính bao gồm: RNAi, siRNA, phức hợp RISC, quy tắc thiết kế siRNA, học máy, SVM, RF, ma trận mã hóa siRNA, hiệu ứng ức chế sai mục tiêu (off-target effect).

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu chính là các bộ dữ liệu siRNA công bố, bao gồm khoảng 2.400 siRNA được gán nhãn hiệu quả ức chế gen, thu thập từ nhiều nghiên cứu quốc tế. Dữ liệu được xử lý và mã hóa thành ma trận nhị phân biểu diễn trình tự nucleotide.

Phương pháp phân tích bao gồm:

• Áp dụng kỹ thuật học máy SVM với chuỗi tổng quát kernel (GSK) để trích xuất đặc trưng từ trình tự siRNA và phân loại siRNA hiệu quả và không hiệu quả.

• Sử dụng thuật toán Random Forest để xây dựng mô hình hồi quy dự đoán mức độ ức chế gen, với các tham số được tối ưu hóa qua kiểm tra chéo 3-fold cross-validation.

• Phương pháp học biểu diễn dữ liệu bằng cách chuyển đổi chuỗi siRNA thành ma trận đặc trưng dựa trên các quy tắc thiết kế siRNA, nhằm làm giàu dữ liệu đầu vào cho mô hình học máy.

Timeline nghiên cứu kéo dài trong năm 2016, bao gồm các bước thu thập dữ liệu, xây dựng mô hình, thực nghiệm đánh giá và so sánh kết quả với các phương pháp hiện có.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Hiệu quả phân loại siRNA bằng SVM với chuỗi tổng quát kernel (GSK): Mô hình SVM sử dụng đặc trưng (1,2,3)-mer đạt độ chính xác phân loại lên đến 86,2% trên bộ dữ liệu thử nghiệm gồm 94 siRNA, trong đó 90,6% siRNA hiệu quả được phân loại đúng và 80,5% siRNA không hiệu quả được nhận diện chính xác.

2. Mô hình hồi quy Random Forest (RFR) cho dự đoán hiệu quả ức chế: Sử dụng 15 đặc trưng sinh học quan trọng, mô hình RFR đạt hệ số tương quan Pearson (R) là 0,851 và sai số bình phương trung bình (RMSE) là 8,924 trên bộ dữ liệu huấn luyện 2.431 siRNA. Sau khi loại bỏ các giá trị ngoại lai, R tăng lên 0,917, cho thấy mô hình có khả năng dự đoán chính xác cao.

3. So sánh giữa RFR và SVM: Mô hình RFR vượt trội hơn SVM về độ chính xác dự đoán trên cùng bộ dữ liệu, với RFR đạt R=0,917 so với R=0,89 của SVM sau khi loại bỏ ngoại lai. Điều này cho thấy RFR có khả năng chịu nhiễu và tổng quát hóa tốt hơn.

4. Phương pháp học biểu diễn dữ liệu nâng cao: Việc chuyển đổi chuỗi siRNA thành ma trận đặc trưng dựa trên các quy tắc thiết kế giúp làm giàu dữ liệu đầu vào, từ đó cải thiện hiệu suất mô hình dự báo. Phương pháp này giúp bảo tồn thông tin vị trí nucleotide và các đặc điểm sinh học quan trọng.

Thảo luận kết quả

Nguyên nhân của hiệu quả cao của mô hình SVM và RFR là do khả năng xử lý dữ liệu có số chiều lớn và tính không tuyến tính trong đặc trưng siRNA. Việc sử dụng chuỗi tổng quát kernel giúp trích xuất các đặc trưng quan trọng từ trình tự nucleotide, trong khi RFR tận dụng kỹ thuật bagging và lựa chọn ngẫu nhiên thuộc tính để giảm thiểu overfitting và tăng độ ổn định.

So với các nghiên cứu trước đây, kết quả của luận văn cho thấy sự cải thiện rõ rệt về độ chính xác dự đoán, đặc biệt là khi áp dụng phương pháp học biểu diễn dữ liệu. Điều này khẳng định tầm quan trọng của việc kết hợp các quy tắc thiết kế sinh học với kỹ thuật học máy hiện đại.

Dữ liệu có thể được trình bày qua các biểu đồ phân bố điểm số GSK/SVM phân loại siRNA hiệu quả và không hiệu quả, bảng so sánh hiệu suất các mô hình học máy trên bộ dữ liệu độc lập, và biểu đồ thể hiện sự cải thiện R và RMSE sau khi loại bỏ ngoại lai trong mô hình RFR.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Phát triển hệ thống dự báo siRNA tích hợp: Xây dựng một nền tảng phần mềm tích hợp các mô hình SVM và RFR với phương pháp học biểu diễn dữ liệu để hỗ trợ các nhà nghiên cứu trong việc thiết kế siRNA hiệu quả. Mục tiêu đạt độ chính xác dự đoán trên 85% trong vòng 12 tháng, do nhóm nghiên cứu và phát triển phần mềm thực hiện.

2. Mở rộng bộ dữ liệu huấn luyện: Thu thập và chuẩn hóa thêm dữ liệu siRNA từ các nghiên cứu quốc tế và trong nước nhằm tăng tính đa dạng và đại diện cho mô hình. Dự kiến hoàn thành trong 18 tháng, do các phòng thí nghiệm sinh học phân tử phối hợp thực hiện.

3. Nghiên cứu sâu về hiệu ứng ức chế sai mục tiêu: Áp dụng các kỹ thuật phân tích sinh học tính toán để giảm thiểu tác động off-target của siRNA, từ đó nâng cao tính an toàn và hiệu quả trong ứng dụng điều trị. Thời gian nghiên cứu dự kiến 24 tháng, do nhóm chuyên gia sinh học và tin sinh học phối hợp.

4. Thử nghiệm lâm sàng và ứng dụng thực tế: Hợp tác với các trung tâm y tế để thử nghiệm các siRNA được thiết kế dựa trên mô hình dự báo trong điều trị các bệnh virus và ung thư, nhằm đánh giá hiệu quả và tính khả thi. Kế hoạch triển khai trong 3 năm, do các tổ chức y tế và nghiên cứu phối hợp thực hiện.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu sinh học phân tử và công nghệ sinh học: Luận văn cung cấp kiến thức sâu rộng về cơ chế RNAi, siRNA và các phương pháp thiết kế, dự đoán hiệu quả siRNA, hỗ trợ nghiên cứu phát triển thuốc và công nghệ gen.

2. Chuyên gia tin sinh học và học máy: Các thuật toán SVM, Random Forest và kỹ thuật học biểu diễn dữ liệu được trình bày chi tiết, giúp phát triển các mô hình dự báo trong lĩnh vực sinh học phân tử.

3. Cơ sở đào tạo đại học và sau đại học: Tài liệu là nguồn tham khảo quý giá cho sinh viên và giảng viên ngành hệ thống thông tin, công nghệ sinh học, y sinh học trong việc nghiên cứu và giảng dạy về ứng dụng học máy trong sinh học.

4. Doanh nghiệp công nghệ sinh học và dược phẩm: Các kết quả nghiên cứu hỗ trợ phát triển sản phẩm thuốc dựa trên siRNA, giúp tối ưu hóa thiết kế và giảm chi phí thử nghiệm, nâng cao hiệu quả điều trị.

Câu hỏi thường gặp

1. SiRNA là gì và vai trò của nó trong RNAi?
   SiRNA là đoạn RNA ngắn 19-25 nucleotit, đóng vai trò dẫn đường trong phức hợp RISC để nhận diện và phân hủy mRNA mục tiêu, từ đó ức chế biểu hiện gen. Ví dụ, siRNA được sử dụng để tắt gen gây bệnh trong nghiên cứu điều trị ung thư.

2. Tại sao cần dự đoán hiệu quả ức chế của siRNA?
   Hiệu quả ức chế của siRNA rất khác nhau, nhiều siRNA không hoạt động hoặc gây tác dụng sai mục tiêu. Dự đoán giúp chọn lựa siRNA hiệu quả cao, giảm chi phí và thời gian thử nghiệm thực nghiệm.

3. Phương pháp học máy nào được sử dụng trong nghiên cứu này?
   Luận văn sử dụng Support Vector Machine (SVM) và Random Forest (RF) để xây dựng mô hình dự báo hiệu quả ức chế siRNA, kết hợp với kỹ thuật học biểu diễn dữ liệu để nâng cao độ chính xác.

4. Hiệu suất mô hình dự báo được đánh giá như thế nào?
   Hiệu suất được đo bằng độ chính xác phân loại, hệ số tương quan Pearson (R) và sai số bình phương trung bình (RMSE). Mô hình Random Forest đạt R=0,917 và RMSE=8,924 sau khi loại bỏ ngoại lai, cho thấy độ chính xác cao.

5. Ứng dụng thực tế của nghiên cứu này là gì?
   Nghiên cứu hỗ trợ thiết kế siRNA hiệu quả cho phát triển thuốc điều trị các bệnh virus, ung thư, và các bệnh di truyền. Ngoài ra còn giúp nghiên cứu chức năng gen và phát triển công nghệ sinh học.

Kết luận

• Luận văn đã tổng hợp và phân tích các quy tắc thiết kế siRNA hiệu quả dựa trên cả phương pháp sinh học và sinh học tính toán.
• Áp dụng thành công các thuật toán học máy SVM và Random Forest để xây dựng mô hình dự báo khả năng ức chế gen của siRNA với độ chính xác cao.
• Phương pháp học biểu diễn dữ liệu bằng ma trận đặc trưng giúp nâng cao hiệu suất dự báo và bảo tồn thông tin sinh học quan trọng.
• Kết quả nghiên cứu góp phần giải quyết thách thức trong thiết kế siRNA hiệu quả, hỗ trợ phát triển thuốc điều trị dựa trên RNAi.
• Hướng nghiên cứu tiếp theo là mở rộng dữ liệu, giảm thiểu hiệu ứng sai mục tiêu và thử nghiệm lâm sàng để ứng dụng thực tế.

Để tiếp tục phát triển, các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp được khuyến khích áp dụng các mô hình dự báo này trong thiết kế siRNA, đồng thời phối hợp mở rộng nghiên cứu đa ngành nhằm nâng cao hiệu quả và tính ứng dụng của RNAi trong y học hiện đại.

Trích đoạn nội dung tài liệu

mở đầu sẽ trình bày một số kiến thức nền tảng của RNAi và trình bày tổng quát về siRNA bao gồm chức năng, hoạt động, ứng dụng, hạn chế và các phương pháp giải quyết bài toán siRNA. Chƣơng 2: Các quy tắc thiết kế siRNA hiệu quả: Trình bày khái quát các phương pháp đã được các nhà khoa học thực nghiệm để giải quyết vấn đề của bài toán. Đó là tìm các quy tắc thiết kế siRNA hiệu quả trong cả hai cách tiếp cận sinh học và sinh học tính toán. Chƣơng 3: Phương pháp dự đoán khả năng ức chế gen của siRNA.

Chương này sẽ tập trung vào giới thiệu tổng quan về nghiên cứu xây dựng các mô hình dự báo và cách áp dụng các phương pháp học SVM và RF để dự đoán khả năng ức chế gen của siRNA. Đồng thời trình bày phương pháp học biểu diễn dữ liệu áp dụng cho phần thực nghiệm. Chƣơng 4: Thực nghiệm đánh giá. Đây là phần nêu lên kết quả đạt được trong suốt quá trình thực hiện, ngoài ra còn đề cập đến những khó khăn vấn đề vướng mắc phát sinh, sau đó là đánh giá những kết quả đạt được chi tiết ở từng bước thực hiện Chƣơng 5: Kết luận.

Tổng kết lại những nội dung chính của luận văn, đưa ra hướng đi và hướng áp dụng thực tế. GIỚI THIỆU TỔNG QUAN VỀ ĐOẠN NGẮN RNA CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ (siRNA) Phần đầu của chương này trình bày tổng quan về sự can thiệp RNA, phần thứ hai là thảo luận chi tiết về siRNA gồm lịch sử ra đời, cơ chế hoạt động, chức năng, ứng dụng của siRNA cũng như giải pháp giải quyết bài toán siRNA. Can thiệp RNA Can thiệp RNA (RNAi) là một hệ thống bên trong các tế bào sống, giúp kiểm soát các gen đang hoạt động đó là các đoạn ngắn RNA giúp tế bào ức chế sự biểu hiện của các gen có trình tự tương đồng với nó. Đây là hệ thống tự vệ của tế bào nhằm chống lại sự xâm nhập của siêu vi khuẩn, các phần tử di truyền ngoại lai khác, những yếu tố sử dụng chuỗi RNA xoắn kép trong chu kỳ sống của tế bào.

Các cơ chế, thành phần chính của RNAi RNAi chính là quá trình phân hủy mRNA. Các dsRNA (Double stranded RNA) mạch kép hoặc dạng kẹp tóc bị cắt thành các đoạn ngắn RNA (siRNA) bởi các enzyme ribonuclease III Dicer, họ protein được gọi là RNA- phức hệ gây sự im lặng (RISC) sẽ mang các siRNA bám vào mRNA đích có trình tự tương đồng với nó và phân hủy mRNA. Nên quá trình chuyển hóa mRNA thành protein hay lây nhiễm virut RNA sẽ bị ngăn chặn. RNAi xảy ra trong quá trình im lặng gen sau phiên mã (PTGS), quá trình RNAi được bảo toàn mạnh mẽ ở các sinh vật nhân chuẩn đóng vai trò bảo vệ chống lại virus và sự bất ổn về di truyền phát sinh từ yếu tố di truyền động (Transposons).

Công trình nghiên cứu về RNAi của hai nhà khoa học Z.Mello đã được công bố trên tạp chí Nature vào ngày 19/2/1998, kết quả của nghiên cứu này vô cùng quan trọng bởi chúng cung cấp lời giải thích cho các hiện tượng nghiên cứu ở thực vật được các nhà nghiên cứu trước đó gọi là “Đồng ức chế”. Khám phá của họ đã làm sáng tỏ nhiều quan sát thí nghiệm mâu thuẫn và khó hiểu trong nhiều năm trước đây, đồng thời tiết lộ một cơ chế tự nhiên để kiểm soát dòng thông tin di truyền trong tế bào, báo hiệu sự khởi đầu cho một lĩnh vực nghiên cứu mới. RNAi được sử dụng trong khoa học cơ bản nghiên cứu chức năng của gen. Ngoài ra, cơ chế này có ý nghĩa rất quan trọng đối với việc điều khiển các biểu hiện gen, tham gia bảo vệ cơ thể chống nhiễm virus và kiểm soát gen thay đổi đột ngột.

Với nghiên cứu mới này, giới khoa học cũng đang tìm ra các ứng dụng của RNAi trong những nghiên cứu y học chữa bệnh bằng liệu pháp gen, các ứng dụng trên cây trồng, vật nuôi trong nông nghiệp nhằm tạo ra các sản phẩm với chất lượng tốt hơn. Trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn, các bệnh do virut, bệnh tim, ung thư, rối loạn nội tiết và nhiều chứng bệnh khác. Quá trình RNAi bao gồm các bước sau (Hình1.1), bước đầu tiên của RNAi đó là RNA sợi kép (dsRNA) bị cắt thành những đoạn ngắn (siRNA) bởi một endonuclease gọi là dicer sẽ tách dsRNA thành các siRNA 11 5‟ A) AUGGACUAGCAU… 3 ‟ RNA mạch đôi B) DICER DICER siRNA 19-25 nt RISC RISC mRNA AAAAA mRNA AAAAA Hình 1.1: Sơ đồ hoạt động của RNAi và siRNA Bước thứ 2, siRNA được mở ra thành hai sợi đơn ngắn đó là hai sợi sence và antisence. Sợi antisense ngắn (siRNA) được nạp vào phức hợp RISC và sợi antisense RNA trong phức hợp RISC bắt cặp với mRNA bằng liên kết tương đồng giữa các bazơ.

Tiếp theo RISC sẽ phân hủy mRNA tương đồng với nó. Các thành phần xúc tác mà tách hai sợi của siRNA được xác định là các protein thuộc họ Argonaut 2 (Ago2). Bằng cách phân tích cấu trúc tinh thể của Ago2, cho thấy Ago2 tương tự như RNase H, đó sẽ tách thành phần RNA của một DNA / RNA kép [34] Có ba thành phần chính liên quan đến quá trình can thiệp RNA: siRNA, enzyme Dicer, và phức hệ (RISC). Trong đó siRNA là một đoạn ngắn của dsRNA (RNA mạch kép) có kích thước khoảng 19 đến 25 nucleotit với gốc phosphoryl là đầu 5 ' đến 2 phân tử nucleotide ở đầu hydroxy 3' (Hình 1.

Dicer là một endoonuclease giống như RNase III sẽ cắt RNA sợi đôi thành các đoạn ngắn RNA (siRNA) và RISC là một phức hợp đa protein (muti-protein) có chứa enzyme helicase và một số protein, trong đó quan trọng nhất là protein thuộc họ Agronaut hoạt động như một endonuclease và có vai trò cắt mRNA. Vai trò của RNAi RNAi có nhiều chức năng quan trọng trong tế bào như: Bảo vệ tế bào chống lại gen ký sinh trùng, virus và các yếu tố di truyền vận động (Transposon). Điều hòa biểu hiện gen. Duy trì hình dạng nhiễm sắc thể và tăng cường phiên mã… 12 1.

Thành phần của RNAi RNAi gồm 2 thành phần siRNA và miRNA siRNA (small interfeing RNA, short interfering RNA) là các RNA ngắn có kích thước khoảng 19 đến 25 nucleotit, được hình thành từ các RNA sợi đôi, tham gia vào quá trình tổng hợp protein, siRNA có khả năng điều khiển protein họ Argomaute tới đích điều hòa. miRNA (micro RNA) là những đoạn RNA ngắn khoảng từ 19 đến 25 nucleotit, không tham gia vào quá trình tổng hợp protein. Nghiên cứu can thiệp RNA Can thiệp trong thực vật Ở thực vật sự ức chế của RNA (RNA silencing) được phát hiện khi thực hiện biến đổi gen trên cây dạ yến thảo với dự kiến là có màu tím hơn. Năm 1990 phòng thí nghiệm R.

Jorgensen muốn tăng cường hoạt động của gien tổng hợp chalcone synthase (chsA) một loại enzyme tham gia vào việc sản xuất sắc tố anthocyanin (Hình 1.2) họ đã thí nghiệm bằng cách chuyển gen quy định màu tím chalcone synthase dưới sự điều khiển của một promoter mạnh (promoter 35S), gen CHS là gen có liên quan đến chu trình hình thành chất anthocyanin trong hoa dạ yến thảo, tuy nhiên thay vì hình thành màu tím của cánh hoa như mong đợi thì chúng lại thể hiện các đốm màu khác nhau và thậm chí là màu trắng. Hiện tượng này các nhà khoa học đặt thuật ngữ là "cosuppresion" nghĩa là "đồng ức chế" bởi vì sự biểu hiện của gen ngoại sinh và gen nội sinh trong hoa dạ yến thảo đều bị ức chế như nhau. Thuật ngữ "đồng ức chế" là quá trình mô tả sự mất đi của các mRNA do gen nội sinh (gen có sẵn của tế bào) và gen ngoại sinh (gen được chuyển vào trong tế bào) phiên mã ra.2: Đồng ức chế của cây dạ yến thảo, cây bên trái là cây dại, bên phải là cây chứa biến đổi gen Trong khoảng thời gian này các phòng thí nghiệm khác [23] cũng cho thấy rằng việc chuyển gen ở dạng sense vào tế bào có thể làm giảm sự biểu hiện của gen nội sinh tương ứng. Sau đó nhiều trường hợp đồng ức chế tương tự đã được báo cáo trong các tài liệu khoa học.

Tất cả các trường hợp đồng ức chế đều dẫn đến sự thoái hoá của các phân tử RNA của gen nội sinh và gien ngoại sinh sau khi quá trình phiên mã ở nhân 13 xảy ra [27].Vì sự thoái hoá của RNA sau phiên mã được quan sát thấy ở một loạt các gien ở thực vật, vi khuẩn hoặc virut, nó được đặt tên lại là sự bất hoạt gien sau phiên mã [PTGS], PTGS không chỉ dưới tác động của gen được chuyển dạng sense mà còn cả antisense và những bằng chứng về mặt hoá học cho thấy các cơ chế tương tự nhau có thể đã xảy ra trong cả hai trường hợp [17]. Nó chỉ ra rằng mặc dù hiện tượng đồng ức chế ban đầu được quan sát ở thực vật nhưng nó không chỉ giới hạn ở thực vật mà còn xuất hiện ở động vật đa bào và động vật có vú. Cùng thời gian đó những biến đổi quan sát được ở các kiểu hình (motif) có liên quan tới PTGS được cho là do sự kết hợp ở nhiều vị trí, hình thành nên phân tử RNA dị thường, các cấu trúc được lặp đi lặp lại của gen được chuyển vào trong tế bào. Sau đó, người ta mới biết rõ rằng sự biểu hiện của gen được chuyển vào trong tế bào đã dẫn đến sự hình thành nên dsRNA và bắt đầu cho PTGS.

Các báo cáo từ một số phòng thí nghiệm trong vài năm qua đã cho thấy rằng sự mất đi khả năng tích tụ các mRNA đích là gần như hoàn toàn nếu gen được chuyển vào phiên mã ra các bản sao ở dạng mạch kép. Bằng chứng này cho thấy việc tạo ra dsRNA là cần thiết để khởi đầu PTGS ở thực vật, dựa vào điều này, thực vật mang gen chuyển có hoạt động phiên mã mạnh mẽ theo cả hai hướng tạo ra dạng sense và dạng antisense đã cho thấy những đặc tính PTGS mạnh mẽ. Những thực vật chuyển gen này có thể gây bất hoạt gien nội sinh, RNA virut có thể xâm nhập hoặc những gen lạ không mong muốn xuất hiện và đặc tính này có thể di truyền được. Nói chung, thành phần sense và antisense của các gen được chuyển vào tế bào nói trên chỉ khác nhau ở một DNA bên trong một gen nhưng không tham gia vào việc mã hoá protein (intron) để tăng cường tính hiệu quả của PTGS [8], [42].

Ví dụ, 2 loại cà chua Arabidopsis thaliana và Lycopersicon esculentum được biến nạp bởi một gien được thiết kế với mục đích tạo ra các bản sao iaaM và ipt có khả năng tự bổ sung.